SN/T 3432-2012
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SN/T 3432-2012.Detection and identification of Dia porthe helianthi Muntanola-Cvetkovic.
1范围
SN/T 3432规定了向日葵茎溃疡病菌的分离培养及分子生物学鉴定方法。
SN/T 3432适用于进出境向日葵种子和田间向日葵植株中向日葵茎溃疡病菌的检疫和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
SN/T1538.1培养基制备指南第1部分:实验室培养基制备质量保证通则
SN/T1809进出境植物种子检疫规程
3向日葵茎溃疡病菌基本信息
学名:有性态:Dia porthe helianthi Muntanola-Cvetkovic Mihaljcevic et Petrov;
无性态: Phomo psis helianthi Munt. -Cvetk. , Mihaljc. & M. Petrov。
分类地位:有性态为子囊菌亚门(Ascomycotina)、核菌纲( Pyrenomycetes)、球壳目(Sphaeriales)、间座壳科(Diaporthaceae).间座壳属(Diaporthe);无性态为半知菌亚门(Deuteromycotina)、腔孢纲(Coelomycetes)、球壳孢目(Sphaeropsidales)、球壳孢科(Sphaeropsidaceae)、拟茎点霉属( Phomopsis)。
传播途径:该病菌近距离传播主要靠分生孢子借助雨水飞溅、病残体以及农事操作工具传播,远距离传播主要通过带菌向日葵种子调运和种子中夹带的病残体传播。
1范围
SN/T 3432规定了向日葵茎溃疡病菌的分离培养及分子生物学鉴定方法。
SN/T 3432适用于进出境向日葵种子和田间向日葵植株中向日葵茎溃疡病菌的检疫和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
SN/T1538.1培养基制备指南第1部分:实验室培养基制备质量保证通则
SN/T1809进出境植物种子检疫规程
3向日葵茎溃疡病菌基本信息
学名:有性态:Dia porthe helianthi Muntanola-Cvetkovic Mihaljcevic et Petrov;
无性态: Phomo psis helianthi Munt. -Cvetk. , Mihaljc. & M. Petrov。
分类地位:有性态为子囊菌亚门(Ascomycotina)、核菌纲( Pyrenomycetes)、球壳目(Sphaeriales)、间座壳科(Diaporthaceae).间座壳属(Diaporthe);无性态为半知菌亚门(Deuteromycotina)、腔孢纲(Coelomycetes)、球壳孢目(Sphaeropsidales)、球壳孢科(Sphaeropsidaceae)、拟茎点霉属( Phomopsis)。
传播途径:该病菌近距离传播主要靠分生孢子借助雨水飞溅、病残体以及农事操作工具传播,远距离传播主要通过带菌向日葵种子调运和种子中夹带的病残体传播。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3432--2012www.bzxz.net
向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Dia porthe helianthi Muntanola-Cvetkovic2012-12-12发布
中华人民共和国
宝家质量鉴督检验检疫总晨
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1-·2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3432—2012
本标准起草单位：中华人民共和国新疆出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院本标主要起草人：王文正、张祥林、杜洪忠、李焱、张汀国。1范围
向白葵莹溃疡病菌检疫鉴定方法本标准规定了向日葵溃荡病菌的分离培养及分子生物学鉴定方法，SN/T3432—2012
本标准适用于进出境向日葵种子和田间间日葵植株中向H葵茎溃瘤病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件：仅注口期的版本适用于本文件。儿是不注月期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。CB/T6682分析实验室角水规格和试验方法SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则SN/T1809进山境植物种子检疫规程3向日萎茎溃疡病菌基本信息
学名：有性态：DiaporthehelianthiMuntanula-CvetkovicMihaljceviceiPeirov:无性态.Phontopsis helianhi Munt.Cvetk.,Mihaljc.&..M.Peirov.分类地位：有性态为于囊菌亚门（Ascurnycutinla）、核菌纲（Pyrennmyrct:s）球充月（Sphaeriales）问座壳科（Diaporthaceae）问座壳属（Diuporthe）：无性态为半知菌亚门（Deuteromycotina），胶孢纲（Coelomycetes）、球壳孢目（Sphaeropsidales）、球亮孢科（Sphaeropsidaceae）拟点霉属（Phomobsis）。传播途径：该病菌近距离传播主要靠分生孢子借助雨水飞、病残体以及农事操作工具传播，远距离传播主过带菌向日葵种子调运和种子中爽带的病残体传播。向月葵茎溃疡病菌的其他相关信息参见附录A。4鉴定原理
根据问日菱茎溃疡病菌在寄土上的为害症状、形态学特征、培养性状和PCR特异性扩增片段作为鉴定依据，
5仪器和用具
5.1仪器
体视显微镜、生物显微镜、超净工作台、PCR扩增仪、电泳仪，凝胶成像仪、光照培养箱、电子天平(1/1000 g)、高压灭菌器、冰箱。5.2用具
手持放大镜、培养Ⅲ、酒精灯、镊了，剪刀、解剖刀、样品筛（10月，$1.7mm），修技剪、接种针、载玻片、盖玻片、封口膜、菌种保藏管，离心管（1.5mL）、可调微量加样器及其配套枪头（10uL～」000μl.)，1
SN/T34322012
6试剂和培养基
6.1试剂
葡萄糖、琼脂粉、乳酸、链霉素、次氯酸钠、盐酸、氯化镁、SDS、EDTA、Tris、CTAB、无水乙醇、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇、苯酚、溴化乙锭、蛋白酶K、TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA相对分子质量Marker(100bp)。
6.2培养基
按照SN/T1538.1制备以下培养基马铃薯葡萄糖培养基（PDA）去皮马铃薯200g：切碎.加适量蒸馅水煮沸20min左右，双层纱布过京脂17g，继续煮至琼脂完全融化后，调节PH至6.8.加蒸馏水补足滤，滤液中加人葡萄糖20g、精琼1c00ml,121C高压灭菌20mi
酸性马铃薯葡萄糖培养基（APDA）：去皮马铃薯200g切碎，加适量蒸馏水煮沸20min左右，双层纱布过滤，在滤汁中加人葡萄糖20g、琼脂18g·继续煮至琼脂完全融化后，加蒸馅水补足1000mL121℃高压灭菌20min。当培养基冷却至55℃左右时，无菌操作下加人100mg链素，并用乳酸调节PH至6.0.摇匀，倒Ⅲ后备用。
鉴定方法
7.1取样和制样
按照SN/T1806抽取向日葵种子样品选取向日葵种子中具有干癌、被缩、需变或变色等非正常的种了，同时挑选出向日葵种子中夹带的向日葵植株残体，如叶柄、茎秆、花盘碎片等。有种衣剂包被向日葵种子
，需将种衣剂洗掉，晾干质
后再挑选种子和植株残体进行检测。向日葵种了包衣的洗涤方法参见附录A。
取田间具有疑似症状的茎杆，病叶或英盘，在病健交界处剪取组织材料，剪成长5mm~10mm的小块备用。
7.2分离培养
无菌操作下将供试样品分别用3%次氟酸钠表面消毒5min~10min，灭菌水冲洗3次，移至含链霉素的APDA培养基平Ⅲ中，26℃.8b光照/16h黑暗条件下培养，5d后观察。将生长出的可疑菌落分别转到PDA平皿上，26℃纯化培养5d后，观察菌落的特征，制片镜检观察记录分生孢子器和分生孢子的形状、大小等。
7.3菌种保藏
将所分离的菌种纯化后转接在PDA平血培养基上，待菌落长满后，无菌操作下，用解剖刀将菌落切成若干个边长约1cm左右的小方块，分别放在盛有无菌水的菌种保藏管中，用封口膜封好，室温保存。
7.4分子生物学鉴定
7.4.1DNA提取
将分离出的可疑菌落·接种到液体PDA培养基上，28℃培养3d。挑取生长的菌丝，用市售的通用KAoNiKAca
DNA提取试剂盒，提取病原菌基因组DNA。7.4.2PCR检测
SN/T3432-—2012
向日葵茎溃疡病菌的PCR扩增的特异性引物序列为：PHDFI：5+-TCGCCGCTGGATTTCA-3；PHDF2.5*-CCTGGGAACAGGGAGCAGC-3PCR反应体系，10×缓冲液2.5uL，25mmol/LMgClz2.4L,10mmol/LdNTP0.3gL.5U/μLTagDNA聚合酶0.2μL，10μmal/L上、下游引物各1.5μL，DNA模板1μl总体积25μL。PCR反应条件：预变性95℃3min95℃1min，62℃1min，72℃1min，共35个循环：72℃延伸10min
将PCR扩增产物进行电泳分析。制备2%的琼脂糖凝胶，按比例混勾电泳上样缓冲液和PCR扩增产物，用DNAMarker作为相对分子质量标记，电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA条带，并拍摄记录。PCR检测实验中所用的水按照GB/T6682执行8鉴定标准
8.1菌落特征和病菌形态
向日英茎溃疡病菌在PDA培养基上生长的菌落初期为白色，菌丝体较密集，两周后菌落基质渐渐变为红褐色至深褐色，其间形成暗色分生抱子器。向日葵茎溃疡病菌的形态特征参见附录A8.2PCR扩增产物
经琼脂糖凝胶电泳分析，向日茎溃疡病菌的PCR特异性扩增产物大小为326bp。9结果判定
根据向日莫茎溃疡病菌的鉴定标准（见第8章），对分离菌和核酸提取物进行判定。如分离菌的形态特征或PCR产物与鉴定指标吻合，可判定为向目类茎溃疡病菌·否则，不视为向日英茎溃疡病菌3
TTKAoNiKAca
SN/T3432-—2012
A.1奇主范围
向日葵（Helianthusannuus）。A.2地理分布
附录A
（资料性附录）
向日茎溃疡病菌其他相关信息
波黑、克罗地亚、塞尔维亚、法国、匈牙利、意大利、摩尔多瓦、罗马尼亚、俄罗斯、斯洛伐克、西班牙、乌克兰、巴基斯坦、摩洛哥、美国（明尼苏达州，俄亥俄州、德克萨斯州）、墨西哥、阿根廷和委内瑞拉。A.3病原菌形态特征
回日葵茎溃疡病菌的菌丝体有分隔，分生抱子器聚生或散生，浅褐色、褐色至黑色，球形或扁球形，直径120μm～450um，含有α和β两种类型的分生孢子。α型分生孢子无色，单胞，纺锤形或椭圆形，常有2~4个油滴，大小为（8μm~21μm）×（1.7μm~5.5μm）：β型分生抱子无色、单胞，丝状线形，一端常为钩状，无油球，大小（16μm~42μm）×（0.5μm~0.9μm）。该病菌在病残体上可形成有性器官。子囊壳直径350μm~450m，有状突起长350um~600μm：子囊无色，大小（44μm~67μm）×（7.5μm~12.5μm），含8个子囊孢子；子囊孢子双胞、无色、椭圆形，大小（12.5μm~19μm）×（2.8mm~7.5um）。a
说明：
向日类茎溃疡病菌α型分生孢子：向日葵茎溃疡病菌β型分生孢子。b
向日葵溃疡病菌分生孢子形态
A.4病害典型症状
在向日葵茎秆和叶柄结合处产生枯黄色至淡褐色大型病斑，边缘呈日烧状：发病严重时·病斑逐步4
KAoNiKAca
SN/T34322012
扩展并包围茎秆，导致茎秆上部干枯，易折断，茎秆和叶柄的髓部腐烂坏死。叶片上的病斑呈棕色或褐色，严重时整叶萎、干枯变黑。花盘受害后发育不良，不能形成成熟的种子，或千枯败育。发病严重时可导致整个植株死亡。
向日葵溃疡病典型症状见图A,2。向日萎茎溃疡病典型症状
A.5向日菱种子包衣的洗涤方法
将种子放入样品筛（10目，1.7mm）中，然后将样品筛置于一个盛有灭菌水的小盆中浸泡35遍，每一遍浸泡20min～30min，期间缓慢摇晃样品筛3～5次，以便洗去向日葵种子包衣。5
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向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Dia porthe helianthi Muntanola-Cvetkovic2012-12-12发布
中华人民共和国
宝家质量鉴督检验检疫总晨
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1-·2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3432—2012
本标准起草单位：中华人民共和国新疆出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院本标主要起草人：王文正、张祥林、杜洪忠、李焱、张汀国。1范围
向白葵莹溃疡病菌检疫鉴定方法本标准规定了向日葵溃荡病菌的分离培养及分子生物学鉴定方法，SN/T3432—2012
本标准适用于进出境向日葵种子和田间间日葵植株中向H葵茎溃瘤病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件：仅注口期的版本适用于本文件。儿是不注月期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。CB/T6682分析实验室角水规格和试验方法SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则SN/T1809进山境植物种子检疫规程3向日萎茎溃疡病菌基本信息
学名：有性态：DiaporthehelianthiMuntanula-CvetkovicMihaljceviceiPeirov:无性态.Phontopsis helianhi Munt.Cvetk.,Mihaljc.&..M.Peirov.分类地位：有性态为于囊菌亚门（Ascurnycutinla）、核菌纲（Pyrennmyrct:s）球充月（Sphaeriales）问座壳科（Diaporthaceae）问座壳属（Diuporthe）：无性态为半知菌亚门（Deuteromycotina），胶孢纲（Coelomycetes）、球壳孢目（Sphaeropsidales）、球亮孢科（Sphaeropsidaceae）拟点霉属（Phomobsis）。传播途径：该病菌近距离传播主要靠分生孢子借助雨水飞、病残体以及农事操作工具传播，远距离传播主过带菌向日葵种子调运和种子中爽带的病残体传播。向月葵茎溃疡病菌的其他相关信息参见附录A。4鉴定原理
根据问日菱茎溃疡病菌在寄土上的为害症状、形态学特征、培养性状和PCR特异性扩增片段作为鉴定依据，
5仪器和用具
5.1仪器
体视显微镜、生物显微镜、超净工作台、PCR扩增仪、电泳仪，凝胶成像仪、光照培养箱、电子天平(1/1000 g)、高压灭菌器、冰箱。5.2用具
手持放大镜、培养Ⅲ、酒精灯、镊了，剪刀、解剖刀、样品筛（10月，$1.7mm），修技剪、接种针、载玻片、盖玻片、封口膜、菌种保藏管，离心管（1.5mL）、可调微量加样器及其配套枪头（10uL～」000μl.)，1
SN/T34322012
6试剂和培养基
6.1试剂
葡萄糖、琼脂粉、乳酸、链霉素、次氯酸钠、盐酸、氯化镁、SDS、EDTA、Tris、CTAB、无水乙醇、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇、苯酚、溴化乙锭、蛋白酶K、TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA相对分子质量Marker(100bp)。
6.2培养基
按照SN/T1538.1制备以下培养基马铃薯葡萄糖培养基（PDA）去皮马铃薯200g：切碎.加适量蒸馅水煮沸20min左右，双层纱布过京脂17g，继续煮至琼脂完全融化后，调节PH至6.8.加蒸馏水补足滤，滤液中加人葡萄糖20g、精琼1c00ml,121C高压灭菌20mi
酸性马铃薯葡萄糖培养基（APDA）：去皮马铃薯200g切碎，加适量蒸馏水煮沸20min左右，双层纱布过滤，在滤汁中加人葡萄糖20g、琼脂18g·继续煮至琼脂完全融化后，加蒸馅水补足1000mL121℃高压灭菌20min。当培养基冷却至55℃左右时，无菌操作下加人100mg链素，并用乳酸调节PH至6.0.摇匀，倒Ⅲ后备用。
鉴定方法
7.1取样和制样
按照SN/T1806抽取向日葵种子样品选取向日葵种子中具有干癌、被缩、需变或变色等非正常的种了，同时挑选出向日葵种子中夹带的向日葵植株残体，如叶柄、茎秆、花盘碎片等。有种衣剂包被向日葵种子
，需将种衣剂洗掉，晾干质
后再挑选种子和植株残体进行检测。向日葵种了包衣的洗涤方法参见附录A。
取田间具有疑似症状的茎杆，病叶或英盘，在病健交界处剪取组织材料，剪成长5mm~10mm的小块备用。
7.2分离培养
无菌操作下将供试样品分别用3%次氟酸钠表面消毒5min~10min，灭菌水冲洗3次，移至含链霉素的APDA培养基平Ⅲ中，26℃.8b光照/16h黑暗条件下培养，5d后观察。将生长出的可疑菌落分别转到PDA平皿上，26℃纯化培养5d后，观察菌落的特征，制片镜检观察记录分生孢子器和分生孢子的形状、大小等。
7.3菌种保藏
将所分离的菌种纯化后转接在PDA平血培养基上，待菌落长满后，无菌操作下，用解剖刀将菌落切成若干个边长约1cm左右的小方块，分别放在盛有无菌水的菌种保藏管中，用封口膜封好，室温保存。
7.4分子生物学鉴定
7.4.1DNA提取
将分离出的可疑菌落·接种到液体PDA培养基上，28℃培养3d。挑取生长的菌丝，用市售的通用KAoNiKAca
DNA提取试剂盒，提取病原菌基因组DNA。7.4.2PCR检测
SN/T3432-—2012
向日葵茎溃疡病菌的PCR扩增的特异性引物序列为：PHDFI：5+-TCGCCGCTGGATTTCA-3；PHDF2.5*-CCTGGGAACAGGGAGCAGC-3PCR反应体系，10×缓冲液2.5uL，25mmol/LMgClz2.4L,10mmol/LdNTP0.3gL.5U/μLTagDNA聚合酶0.2μL，10μmal/L上、下游引物各1.5μL，DNA模板1μl总体积25μL。PCR反应条件：预变性95℃3min95℃1min，62℃1min，72℃1min，共35个循环：72℃延伸10min
将PCR扩增产物进行电泳分析。制备2%的琼脂糖凝胶，按比例混勾电泳上样缓冲液和PCR扩增产物，用DNAMarker作为相对分子质量标记，电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA条带，并拍摄记录。PCR检测实验中所用的水按照GB/T6682执行8鉴定标准
8.1菌落特征和病菌形态
向日英茎溃疡病菌在PDA培养基上生长的菌落初期为白色，菌丝体较密集，两周后菌落基质渐渐变为红褐色至深褐色，其间形成暗色分生抱子器。向日葵茎溃疡病菌的形态特征参见附录A8.2PCR扩增产物
经琼脂糖凝胶电泳分析，向日茎溃疡病菌的PCR特异性扩增产物大小为326bp。9结果判定
根据向日莫茎溃疡病菌的鉴定标准（见第8章），对分离菌和核酸提取物进行判定。如分离菌的形态特征或PCR产物与鉴定指标吻合，可判定为向目类茎溃疡病菌·否则，不视为向日英茎溃疡病菌3
TTKAoNiKAca
SN/T3432-—2012
A.1奇主范围
向日葵（Helianthusannuus）。A.2地理分布
附录A
（资料性附录）
向日茎溃疡病菌其他相关信息
波黑、克罗地亚、塞尔维亚、法国、匈牙利、意大利、摩尔多瓦、罗马尼亚、俄罗斯、斯洛伐克、西班牙、乌克兰、巴基斯坦、摩洛哥、美国（明尼苏达州，俄亥俄州、德克萨斯州）、墨西哥、阿根廷和委内瑞拉。A.3病原菌形态特征
回日葵茎溃疡病菌的菌丝体有分隔，分生抱子器聚生或散生，浅褐色、褐色至黑色，球形或扁球形，直径120μm～450um，含有α和β两种类型的分生孢子。α型分生孢子无色，单胞，纺锤形或椭圆形，常有2~4个油滴，大小为（8μm~21μm）×（1.7μm~5.5μm）：β型分生抱子无色、单胞，丝状线形，一端常为钩状，无油球，大小（16μm~42μm）×（0.5μm~0.9μm）。该病菌在病残体上可形成有性器官。子囊壳直径350μm~450m，有状突起长350um~600μm：子囊无色，大小（44μm~67μm）×（7.5μm~12.5μm），含8个子囊孢子；子囊孢子双胞、无色、椭圆形，大小（12.5μm~19μm）×（2.8mm~7.5um）。a
说明：
向日类茎溃疡病菌α型分生孢子：向日葵茎溃疡病菌β型分生孢子。b
向日葵溃疡病菌分生孢子形态
A.4病害典型症状
在向日葵茎秆和叶柄结合处产生枯黄色至淡褐色大型病斑，边缘呈日烧状：发病严重时·病斑逐步4
KAoNiKAca
SN/T34322012
扩展并包围茎秆，导致茎秆上部干枯，易折断，茎秆和叶柄的髓部腐烂坏死。叶片上的病斑呈棕色或褐色，严重时整叶萎、干枯变黑。花盘受害后发育不良，不能形成成熟的种子，或千枯败育。发病严重时可导致整个植株死亡。
向日葵溃疡病典型症状见图A,2。向日萎茎溃疡病典型症状
A.5向日菱种子包衣的洗涤方法
将种子放入样品筛（10目，1.7mm）中，然后将样品筛置于一个盛有灭菌水的小盆中浸泡35遍，每一遍浸泡20min～30min，期间缓慢摇晃样品筛3～5次，以便洗去向日葵种子包衣。5
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