SN/T 3392-2012
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标准简介
SN/T 3392-2012.Codes of examination of Borrelia burgdorferi at frontier port.
1范围
SN/T 3392规定了国境口岸菜姆病螺旋体的检验对象、方法、生物安全要求及结果判定。
SN/T 3392适用于国境口岸菜姆病螺旋体的检验。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用多本文件。
GB 19489实验室生物安 全通用要求
SN/T 1312国境口岸森林脑炎监测规程
SN/T1638-2005国境口岸莱姆病监测规程
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
3.1莱姆病螺旋体Borrelia burgdorferin
细胞外寄生、微嗜氧型的螺旋体经蜱传播,是引起人体莱姆病(Lymedisease)的病原体，引起的临床症状多样，除慢性游走性红斑和关节炎外还常伴有心脏损害和神经系统受累等症状。
4实验室生物安全防护
检测样本的采集和处理应符台无菌操作原则，进行样本检测的实验室应符合GB19489中生物安全二级实验室要求。
5对象
5.1疑似感染莱姆病的人出境人员、口岸边境人群的血液样本和其他组织样本。
5.2蜱及宿主动物标本。
6试剂及器材
6.1莱姆病螺旋体培养及聚合酶链反应(PCR)检验试剂和器材参见附录A,或购买符合要求的商品化检测试剂盒。
6.2血清学检验试剂和器材见SN/T1638-2005中附录A,或购买符合要求的商品化试剂盒。
1范围
SN/T 3392规定了国境口岸菜姆病螺旋体的检验对象、方法、生物安全要求及结果判定。
SN/T 3392适用于国境口岸菜姆病螺旋体的检验。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用多本文件。
GB 19489实验室生物安 全通用要求
SN/T 1312国境口岸森林脑炎监测规程
SN/T1638-2005国境口岸莱姆病监测规程
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
3.1莱姆病螺旋体Borrelia burgdorferin
细胞外寄生、微嗜氧型的螺旋体经蜱传播,是引起人体莱姆病(Lymedisease)的病原体，引起的临床症状多样，除慢性游走性红斑和关节炎外还常伴有心脏损害和神经系统受累等症状。
4实验室生物安全防护
检测样本的采集和处理应符台无菌操作原则，进行样本检测的实验室应符合GB19489中生物安全二级实验室要求。
5对象
5.1疑似感染莱姆病的人出境人员、口岸边境人群的血液样本和其他组织样本。
5.2蜱及宿主动物标本。
6试剂及器材
6.1莱姆病螺旋体培养及聚合酶链反应(PCR)检验试剂和器材参见附录A,或购买符合要求的商品化检测试剂盒。
6.2血清学检验试剂和器材见SN/T1638-2005中附录A,或购买符合要求的商品化试剂盒。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3392-2012
国境口岸莱姆病螺旋体检验规程Codes of examination of Borrelia burgdorferi at frontier port2012-12-12发布
中华人民共和国
国质量监臀检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准是按照 GB/T 1.12009 给出的规则起革SN/T3392—2012
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的贵任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共利国黑龙江出入境检验检疫局、军事医学科学院微生物流行病研究所。
本标准主要起草人：鞠文东.孙毅、付维明、杨德文、徐宁、程城.王艳楠、丁淑丽、包方。1范围
国境口岸莱姆病螺旋体检验规程SN/T3392——2012
本标准规定了国境口岸莱姆病螺旋体的检验对象、方法、生物安全要求及结果判定。本标准适用于国境口岸莱姆病螺旋体的检验。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。GB19489实验室生物安全道用要求SN/T1312国境口岸森林脑炎监测规程SN/T1638-2005国境口岸莱姆病监测规程3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
莱姆病螺旋体Borreliaburgdorferis人体莱姆病
细胞外寄生、微嗜氧型的螺旋体经蟀传播，是起床症状多样，除慢性游走性红斑和关节4实验室生物安全防护
Symedisease）的病原体，引起的临还常伴有心脏损害利神经系统受累等症状。检测样本的采集和处理应符会无菌操作原则，进行样本检测的全二级实验室要求。
5对象
验室应符合GB19489中生物安
5.1疑似感染莱姆病的人出境人员、口岸边境人群的血液样本和其他组织样本。5.2蜱及宿主动物标本。
6试剂及器材
6.1莱姆病螺旋体培养及聚合酶链反应（PCR）检验试剂和器材参见附录A，或购买符合要求的商品化检测试剂盒。
6.2血清学检验试剂和器材见SN/T1638—2005中附录A，或购买符合要求的商品化试剂盒。7标本的采集和处理
按照附录B的方法进行。
SN/T 3392—2012
8实验室检验方法
8.1形态学检验
将染色的玻片置于低倍显微镜载物台上，对准焦距。在涂片上红,细胞分散均匀的部分，100倍暗视野或油镜下耐心仔细按顺序观察红细胞被染成红揭色，菜姆病螺旋体被染成蓝色，间距约8.10个螺距，螺距较大。
8.2血清学检验
按照 SV/T 1638一20G5中附录A规定的方法进行，或按照商晶化试剂说明书操作。8.3桑合酶链反应(PCR)检验
参照附录C规定的方法进行。
8.4离体培养鉴定
按附录D规定的方法进行。
9结果判定
9.1形态学检验
9.1.1标本中观察到典型的莱姆病螺旋体,报“观察到莱姆病螺旋体”。9.1.2标本中300个以视野,未观察到典型的莱姆病螺旋体，报告末检出莱姆病螺旋体\。9.2血清学检验
9,2.1血清学检验阳性,报告\柴姆病螺旋体抗体阳性”。9.2.2血清学检验阴性,报告“莱姆病螺旋体抗体阴性”。9.3聚合酶链反应(PCR)检验
9.3.1PCR检验阳性,报告“莱姆病螺旋体核酸检验阳性”。9.3.2CR检验阴性，报告“莱姆病螺旅体核酸检验阴性”、9.4离体培养鉴定
9.4.1标本中培养出莱姆病螺旋体,报告“离体培葬检出莱姆病螺旋体”。9.4.2育传三代未见可疑莱姆病螺旋体,报告“离体细胞培养三代,未检出莱姆病螺旋体”。10阳性结果的处置
10.1形态学检验和血清学检验阳性的标本，应选择离体分离培养方法进行复检验证。离体培养阳性结果应出具阳性报告单，升向上级主管部门报告。10.2
-TrKAoNrKAca
A.1主要试
姬姆萨(Gimsa）染液
姬姆萨柒料
附录A
（瓷料性附录）
莱姆病螺旋体检验主要试剂及器材0.8g
SN/T 33922012
将0.8g染料加到50ml.甘油中，混匀，置60℃2h.不时搅拌。取出凉至与室温相同时加入甲醇5U m[.,用磁力搅拌过夜。用滤纸过滤:滤液即为原液。应用时所 PBS(1/15 mnl/I,μH 6. 4~-6, 8)或蒸馏水稀释倍。
A. 1, 2 培养基的主要成分及制备方法BSK11培养液
A. 1. 2. 1
CMRI.106G（商品培养基）
高纯水或去离子水定容到
5.7%明胶(Gelatin)缓冲液
高纯水或去离子水定到
121 ℃,15 min灭菌。
300 mL蒸馏水，加热至 50℃～70℃,依次加人：(3）wwW.bzxz.Net
新陈 Neopetone
胰陈Tryptane
酵母提取物Yeastolate
搅拌10min至室温，调=H之前加成分见（4)依次加人
海培斯HEPES
柠檬酸钠（分析纯）
葡萄糖(分析纯R)
内酮酸钠(分析纯）
N-乙酰氨基葡葡糖(N-acetyglucosamine）磷酸氢钠（分析纯）
氯化镁MgCl6H,Ot分新纯）
注；FPE5,N-2-hydroxycthylpiperazine-V-2-ethaes-lfori racid为 N-2-羟乙基眼素-N--2-乙馈酸，相对分子质量238.2.
(5)加人 35%牛恤清白蛋白(Bovine serum Albumin， BSA Fraction IV)113 mL(6)10 mol/LNaOH调pII 茎 7.4:（）C.2umn滤膜膝菌后总氧定容到13
TKAONrKAca
SN/T3392—2012
（8）取300mL明胶与（7）液700mL混合（或者二者按体积比为3：7混合）。（9）无菌试验后，加人100mL无菌灭活小牛血清后，低温保存。A.1.2.2冻存液（水溶剂，以下为体积百分比）甘油
山梨醇
氯化钠
A.1.3PCR试剂
A.1.3.1TRIS-HCIpH8.8：181.7g/LTRIS(三羟甲基氨基甲烷），浓盐酸（HCI)调整PH值。A.1.3.2TE缓冲液：10mmol/LTRIs.HClCpH8.0)1mmo/EBTA(pH8.0)。A.1.3.310×PCR缓冲液：500mmol1条化钾（KCl）-40mmo/氯化镁（MgCl），100mmol/LTRIS-HCI.pH8.5.
A.1.3.4电泳缓冲液：242gTRIS碱，57.1mL冰2酸
至1000mL.使用时十倍稀释。
5mol/LEDTA（pH8.0），加蒸馏水A.1.3.520×SSC缓冲液：在800mL蒸馏水中器解175.3g氟化钠（NaCI)和88.2g柠檬酸钠，加人数滴10mol/L氢氧化钠（NaOH)滚液调节PII值室7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。A.1.3.6琼脂糖：电泳级。
A.2器材
A.2.1离体培养器材
5mL康氏管：滤膜滤器，旋涡娠汤器离心机：暗视野光显微镜：解剖显微镜：全排式生物安全柜；CO，恒温培养箱：0.22μm除菌滤膜高压蒸汽火菌器，玻璃吸管（2mL、5mL）、量筒（50ml、平精确到0.0om
200mL）.三角烧瓶（200mL、1g00mml，电子奏A.2.2PCR器材
离心机PCR仪：电泳仪；可调
凝胶成像仪。
ME、2
g普通冰箱。
20uL~200μL100μL~1000ul
riKAONrKAca
B.1疑似感染者标本的采集
附录B
（规范性附录）
标本的采集和处理
SN/T3392—2012
血液（末梢血或静脉血）、其他组织的印片可进行病原学检测，常规采样后立即送检。B.1.2无菌方法采集血液，EDTA抗凝后无菌试管4C保存，立即送检。B.1.3用不抗凝或促凝真空管采集并保存惠者急性期（发病.3d内）第一周、第三周血清用于血清学检测。
B.1.4典型红斑或溃疡斑组织切片无菌保存后立即送检。B.2疑似感染者标本的处理
B.2.1患者血液取1uL～3μL，置于一张洁净载玻片（甲片）的端涂片时用左手在拇指及食指持握该片的两端；另取一张载玻片作推片（乙片），将其一端接触甲片血滴使血滴沿推片向两侧展开，两片之间保持45°的夹角：将乙片紧靠甲片，沿着甲片的表面轻而迅速地向前推动，直到甲片的另一端为止。推片时注意保持一定的速度和两片间的角度，切忌过分用力或中间停顿，否则将使血球破碎或涂布不匀。质量好的薄血膜应呈舌形，血细胞分布均匀。将制好的血片置于空气中干燥，用甲醇一到两滴置于血片上，均匀散开，固定血膜，干透后再染色。B.2.2血涂片染色方法：采用国际通用的Gimsa染液进行（110）稀释后（现稀释现用），染色30min并清洗，自然风干后镜检观察。B,2.3血清学试验的血液采集后以相对离心力300g离心5min，分离出血清。B.2.4组织切片用体积分数为5%的乙醇溶液表面消毒5min10nin后加人BSKI培养基，无菌研磨至匀浆状，4C保存，作分离培养PCR检测备用。B.3蜱及宿主动物标本采集
蜱及宿主动物采集，参照SN/T1312进行。宿主动物血液标本，应常规无菌取样，用有盖无菌EDTA抗凝、促凝分离胶管的真空管采集试管保存。B.4蜱及宿主动物标本处理
B.4.1宿主动物血液样品参照B.2.1、B.2.2制作血涂片。B.4.2血液样品采集后以相对离心力300g离心5min分高出血清。B.4.3取蜱及宿主动物组织约50mg或媒介蜱一只（幼蜱可五只到十只为一组）.用体积分数为75%的乙醇溶液表面消毒5min~10min，再用无菌水洗涤两到三次后，加入BSKll培养基无菌研磨至匀浆状，以相对离心力150g离心10min，取上清液4℃保存，备用。TYKAONKAca
SN/T3392-—2012
C.1扩增引物
陶录汇
（资料性附录）
案合酶链反应检测
下列是根据莱姆病螺旋体外膜蛋白A(OspA)设计的-对引物，在Genbank中的参考字列号：NC000619。引物具有高度特异性，阳性标本可扩增出309bP的片段，供使用时参考。L游引I物:OA!5*-AATAGGTCAATATTAGCCTTAATAGC-3下游引物:OA4 5*-TTATTTTAAAGCGT[G]T[CJTTT-3C.2模板制备
C.2.1莱姆病螺旋体的模板制备
(.2.1.1取爆旋体阳性培养液1mL，8c00r/min离心15min.弃L清液，将沉淀物溶于100mLTE缓冲筱中。
C. 2. t. 2 加人溶菌酶(20 g/L)10 μL,37 ℃水浴 30 min。C.2.1.3加人体积分数为10%的十二烷基硫酸钠溶液（SDS>10μL，60℃水10min（变清为止），室温玲却。
C.2.1.4 加人蛋白酶K(10 g/L)10 μL 37 C 60 min。C 2. 1. 5 RNA 酶(10 g/L)10 μL 37 C 30 min,C. 2. 1. 6 加人 150 μL酚、三氯甲烷、异戊醇混匀液,抽提三次。C.2.1.7加人冰乙醇，12000r/min离心19min，弃上水相，白然T燥，加入1×SSc:100μL，4℃保存待测。
C.2.2临床标本的模板制备
C. 2. 2. 1取血 2 mI.,5 000 r/mir.,5 min,弃上清液-加 TE缓冲液 300 μL。C.2.2.2100℃激沸 30 min,室温冷却。C.2.2.3 加人 RNA 酶t10 g/L)10 μl. 37 C 30 min。C. 2. 2. 4离心 12 000 1/min,5 min,取上清液10 μL 用于 PcR扩增。C.2.3蜱及宿主动物标本的模板制备C.2.3. 1标本处现:取蜱--只（幼虫可每五到十只为一组),用体积分数为 70%的乙醇溶液浸泡5 min～1c min表面消毒:然后用无萄蒸馏水洗涤两到三次,无菌滤纸吸千水分。研磨器加 TE缓冲液研糜至细粉末状然后按照C.2.1.2-C.2.1.7程序述行，C. 2. 3. 2宿主动物血液标本按 C. 2. 2. 2 处理。C.3扩增
C,3.1吸儿菌的C.2m1.PCR扩增管设肾阴性对照、阳性对照，将样品编号,按照以下剂样避加样：TYKAONrKAca
10XFCR缓冲（含氧化镁）
4dNrPs(1.25 mmol/L)
上游引物（10μmo/1.)
下游引物（10mol/1.)
聚合酶（5U/ml.）
超纯水
1. 0 μl.
0. 5 μl.
36.5 μl.
C. 3, 2混匀.6 000 r/min离心1 min.将管内液体用人管底。SN/T3392—2012
C.3.3设置扩增度应条件:94 ℃ 3 mu;94℃ 45 s,54 ℃ 50 s,72 ℃120 s.35个循环：最后 72 ℃5 min,进行 PCR扩增。
C.4电泳
取 [0 I.扩增产物加人 2 μL溴蓝上样缓冲液,混.加样于1. 5%琼脂糖凝腔(含0. 5 μ/mI溴化乙锭)胶孔中.以5V/cm稳定电压也脉30min,用凝胶减像系统观察是季出现月的条节（3sbp）C.5
结果判定
如明性对照利空问对照未出现条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扌增条带（片段大小为3c9bp),则可初步判定该样品莱姆病螺旋体 1CR检验阳性,应进-步进行测序验证；如果待测样昂中末山现PCR扩增产物·则可判断待测样品莱姆病螺旋体PCR检验阴性。SN/T 3392-2012
D.1初培养
（规范性附录）
莱姆病媒旋体的离体培养鉴定
将疑似患者戴宿主动物的而疫标本，直接滴入BSKI培养基中，培养基与培养物的体积比一般在8~10：1（下同），加塞后33℃培养3d~7d不少于3d），COz浓度5%（下同）。每传代一次，取样一滴，加盖玻片后湿片400俯暗视野进行观察。媒介样品培养操作方法与结果和血液样品相同。0. 2
传代培养
取D.1初培养中阳性培养物两滴到三滴，加入新鲜BSKⅡ培养基，加塞后33℃培养2d～7d。按D.1取样观察，当观察剑每视鼾有螺旋体10-~20条即可冻存，D.3冻存保种
取上述培养物，80001/min离心15min，弃上清液，将沉淀物用新鲜BSKⅡ培养基滤勾，分别取150μL加入冷冻管内，等量加入冻存液。先放人4℃冰箱2h后，冰浴5mir～10min后再放人液氮罐中冻存。
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国境口岸莱姆病螺旋体检验规程Codes of examination of Borrelia burgdorferi at frontier port2012-12-12发布
中华人民共和国
国质量监臀检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准是按照 GB/T 1.12009 给出的规则起革SN/T3392—2012
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的贵任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共利国黑龙江出入境检验检疫局、军事医学科学院微生物流行病研究所。
本标准主要起草人：鞠文东.孙毅、付维明、杨德文、徐宁、程城.王艳楠、丁淑丽、包方。1范围
国境口岸莱姆病螺旋体检验规程SN/T3392——2012
本标准规定了国境口岸莱姆病螺旋体的检验对象、方法、生物安全要求及结果判定。本标准适用于国境口岸莱姆病螺旋体的检验。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。GB19489实验室生物安全道用要求SN/T1312国境口岸森林脑炎监测规程SN/T1638-2005国境口岸莱姆病监测规程3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
莱姆病螺旋体Borreliaburgdorferis人体莱姆病
细胞外寄生、微嗜氧型的螺旋体经蟀传播，是起床症状多样，除慢性游走性红斑和关节4实验室生物安全防护
Symedisease）的病原体，引起的临还常伴有心脏损害利神经系统受累等症状。检测样本的采集和处理应符会无菌操作原则，进行样本检测的全二级实验室要求。
5对象
验室应符合GB19489中生物安
5.1疑似感染莱姆病的人出境人员、口岸边境人群的血液样本和其他组织样本。5.2蜱及宿主动物标本。
6试剂及器材
6.1莱姆病螺旋体培养及聚合酶链反应（PCR）检验试剂和器材参见附录A，或购买符合要求的商品化检测试剂盒。
6.2血清学检验试剂和器材见SN/T1638—2005中附录A，或购买符合要求的商品化试剂盒。7标本的采集和处理
按照附录B的方法进行。
SN/T 3392—2012
8实验室检验方法
8.1形态学检验
将染色的玻片置于低倍显微镜载物台上，对准焦距。在涂片上红,细胞分散均匀的部分，100倍暗视野或油镜下耐心仔细按顺序观察红细胞被染成红揭色，菜姆病螺旋体被染成蓝色，间距约8.10个螺距，螺距较大。
8.2血清学检验
按照 SV/T 1638一20G5中附录A规定的方法进行，或按照商晶化试剂说明书操作。8.3桑合酶链反应(PCR)检验
参照附录C规定的方法进行。
8.4离体培养鉴定
按附录D规定的方法进行。
9结果判定
9.1形态学检验
9.1.1标本中观察到典型的莱姆病螺旋体,报“观察到莱姆病螺旋体”。9.1.2标本中300个以视野,未观察到典型的莱姆病螺旋体，报告末检出莱姆病螺旋体\。9.2血清学检验
9,2.1血清学检验阳性,报告\柴姆病螺旋体抗体阳性”。9.2.2血清学检验阴性,报告“莱姆病螺旋体抗体阴性”。9.3聚合酶链反应(PCR)检验
9.3.1PCR检验阳性,报告“莱姆病螺旋体核酸检验阳性”。9.3.2CR检验阴性，报告“莱姆病螺旅体核酸检验阴性”、9.4离体培养鉴定
9.4.1标本中培养出莱姆病螺旋体,报告“离体培葬检出莱姆病螺旋体”。9.4.2育传三代未见可疑莱姆病螺旋体,报告“离体细胞培养三代,未检出莱姆病螺旋体”。10阳性结果的处置
10.1形态学检验和血清学检验阳性的标本，应选择离体分离培养方法进行复检验证。离体培养阳性结果应出具阳性报告单，升向上级主管部门报告。10.2
-TrKAoNrKAca
A.1主要试
姬姆萨(Gimsa）染液
姬姆萨柒料
附录A
（瓷料性附录）
莱姆病螺旋体检验主要试剂及器材0.8g
SN/T 33922012
将0.8g染料加到50ml.甘油中，混匀，置60℃2h.不时搅拌。取出凉至与室温相同时加入甲醇5U m[.,用磁力搅拌过夜。用滤纸过滤:滤液即为原液。应用时所 PBS(1/15 mnl/I,μH 6. 4~-6, 8)或蒸馏水稀释倍。
A. 1, 2 培养基的主要成分及制备方法BSK11培养液
A. 1. 2. 1
CMRI.106G（商品培养基）
高纯水或去离子水定容到
5.7%明胶(Gelatin)缓冲液
高纯水或去离子水定到
121 ℃,15 min灭菌。
300 mL蒸馏水，加热至 50℃～70℃,依次加人：(3）wwW.bzxz.Net
新陈 Neopetone
胰陈Tryptane
酵母提取物Yeastolate
搅拌10min至室温，调=H之前加成分见（4)依次加人
海培斯HEPES
柠檬酸钠（分析纯）
葡萄糖(分析纯R)
内酮酸钠(分析纯）
N-乙酰氨基葡葡糖(N-acetyglucosamine）磷酸氢钠（分析纯）
氯化镁MgCl6H,Ot分新纯）
注；FPE5,N-2-hydroxycthylpiperazine-V-2-ethaes-lfori racid为 N-2-羟乙基眼素-N--2-乙馈酸，相对分子质量238.2.
(5)加人 35%牛恤清白蛋白(Bovine serum Albumin， BSA Fraction IV)113 mL(6)10 mol/LNaOH调pII 茎 7.4:（）C.2umn滤膜膝菌后总氧定容到13
TKAONrKAca
SN/T3392—2012
（8）取300mL明胶与（7）液700mL混合（或者二者按体积比为3：7混合）。（9）无菌试验后，加人100mL无菌灭活小牛血清后，低温保存。A.1.2.2冻存液（水溶剂，以下为体积百分比）甘油
山梨醇
氯化钠
A.1.3PCR试剂
A.1.3.1TRIS-HCIpH8.8：181.7g/LTRIS(三羟甲基氨基甲烷），浓盐酸（HCI)调整PH值。A.1.3.2TE缓冲液：10mmol/LTRIs.HClCpH8.0)1mmo/EBTA(pH8.0)。A.1.3.310×PCR缓冲液：500mmol1条化钾（KCl）-40mmo/氯化镁（MgCl），100mmol/LTRIS-HCI.pH8.5.
A.1.3.4电泳缓冲液：242gTRIS碱，57.1mL冰2酸
至1000mL.使用时十倍稀释。
5mol/LEDTA（pH8.0），加蒸馏水A.1.3.520×SSC缓冲液：在800mL蒸馏水中器解175.3g氟化钠（NaCI)和88.2g柠檬酸钠，加人数滴10mol/L氢氧化钠（NaOH)滚液调节PII值室7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。A.1.3.6琼脂糖：电泳级。
A.2器材
A.2.1离体培养器材
5mL康氏管：滤膜滤器，旋涡娠汤器离心机：暗视野光显微镜：解剖显微镜：全排式生物安全柜；CO，恒温培养箱：0.22μm除菌滤膜高压蒸汽火菌器，玻璃吸管（2mL、5mL）、量筒（50ml、平精确到0.0om
200mL）.三角烧瓶（200mL、1g00mml，电子奏A.2.2PCR器材
离心机PCR仪：电泳仪；可调
凝胶成像仪。
ME、2
g普通冰箱。
20uL~200μL100μL~1000ul
riKAONrKAca
B.1疑似感染者标本的采集
附录B
（规范性附录）
标本的采集和处理
SN/T3392—2012
血液（末梢血或静脉血）、其他组织的印片可进行病原学检测，常规采样后立即送检。B.1.2无菌方法采集血液，EDTA抗凝后无菌试管4C保存，立即送检。B.1.3用不抗凝或促凝真空管采集并保存惠者急性期（发病.3d内）第一周、第三周血清用于血清学检测。
B.1.4典型红斑或溃疡斑组织切片无菌保存后立即送检。B.2疑似感染者标本的处理
B.2.1患者血液取1uL～3μL，置于一张洁净载玻片（甲片）的端涂片时用左手在拇指及食指持握该片的两端；另取一张载玻片作推片（乙片），将其一端接触甲片血滴使血滴沿推片向两侧展开，两片之间保持45°的夹角：将乙片紧靠甲片，沿着甲片的表面轻而迅速地向前推动，直到甲片的另一端为止。推片时注意保持一定的速度和两片间的角度，切忌过分用力或中间停顿，否则将使血球破碎或涂布不匀。质量好的薄血膜应呈舌形，血细胞分布均匀。将制好的血片置于空气中干燥，用甲醇一到两滴置于血片上，均匀散开，固定血膜，干透后再染色。B.2.2血涂片染色方法：采用国际通用的Gimsa染液进行（110）稀释后（现稀释现用），染色30min并清洗，自然风干后镜检观察。B,2.3血清学试验的血液采集后以相对离心力300g离心5min，分离出血清。B.2.4组织切片用体积分数为5%的乙醇溶液表面消毒5min10nin后加人BSKI培养基，无菌研磨至匀浆状，4C保存，作分离培养PCR检测备用。B.3蜱及宿主动物标本采集
蜱及宿主动物采集，参照SN/T1312进行。宿主动物血液标本，应常规无菌取样，用有盖无菌EDTA抗凝、促凝分离胶管的真空管采集试管保存。B.4蜱及宿主动物标本处理
B.4.1宿主动物血液样品参照B.2.1、B.2.2制作血涂片。B.4.2血液样品采集后以相对离心力300g离心5min分高出血清。B.4.3取蜱及宿主动物组织约50mg或媒介蜱一只（幼蜱可五只到十只为一组）.用体积分数为75%的乙醇溶液表面消毒5min~10min，再用无菌水洗涤两到三次后，加入BSKll培养基无菌研磨至匀浆状，以相对离心力150g离心10min，取上清液4℃保存，备用。TYKAONKAca
SN/T3392-—2012
C.1扩增引物
陶录汇
（资料性附录）
案合酶链反应检测
下列是根据莱姆病螺旋体外膜蛋白A(OspA)设计的-对引物，在Genbank中的参考字列号：NC000619。引物具有高度特异性，阳性标本可扩增出309bP的片段，供使用时参考。L游引I物:OA!5*-AATAGGTCAATATTAGCCTTAATAGC-3下游引物:OA4 5*-TTATTTTAAAGCGT[G]T[CJTTT-3C.2模板制备
C.2.1莱姆病螺旋体的模板制备
(.2.1.1取爆旋体阳性培养液1mL，8c00r/min离心15min.弃L清液，将沉淀物溶于100mLTE缓冲筱中。
C. 2. t. 2 加人溶菌酶(20 g/L)10 μL,37 ℃水浴 30 min。C.2.1.3加人体积分数为10%的十二烷基硫酸钠溶液（SDS>10μL，60℃水10min（变清为止），室温玲却。
C.2.1.4 加人蛋白酶K(10 g/L)10 μL 37 C 60 min。C 2. 1. 5 RNA 酶(10 g/L)10 μL 37 C 30 min,C. 2. 1. 6 加人 150 μL酚、三氯甲烷、异戊醇混匀液,抽提三次。C.2.1.7加人冰乙醇，12000r/min离心19min，弃上水相，白然T燥，加入1×SSc:100μL，4℃保存待测。
C.2.2临床标本的模板制备
C. 2. 2. 1取血 2 mI.,5 000 r/mir.,5 min,弃上清液-加 TE缓冲液 300 μL。C.2.2.2100℃激沸 30 min,室温冷却。C.2.2.3 加人 RNA 酶t10 g/L)10 μl. 37 C 30 min。C. 2. 2. 4离心 12 000 1/min,5 min,取上清液10 μL 用于 PcR扩增。C.2.3蜱及宿主动物标本的模板制备C.2.3. 1标本处现:取蜱--只（幼虫可每五到十只为一组),用体积分数为 70%的乙醇溶液浸泡5 min～1c min表面消毒:然后用无萄蒸馏水洗涤两到三次,无菌滤纸吸千水分。研磨器加 TE缓冲液研糜至细粉末状然后按照C.2.1.2-C.2.1.7程序述行，C. 2. 3. 2宿主动物血液标本按 C. 2. 2. 2 处理。C.3扩增
C,3.1吸儿菌的C.2m1.PCR扩增管设肾阴性对照、阳性对照，将样品编号,按照以下剂样避加样：TYKAONrKAca
10XFCR缓冲（含氧化镁）
4dNrPs(1.25 mmol/L)
上游引物（10μmo/1.)
下游引物（10mol/1.)
聚合酶（5U/ml.）
超纯水
1. 0 μl.
0. 5 μl.
36.5 μl.
C. 3, 2混匀.6 000 r/min离心1 min.将管内液体用人管底。SN/T3392—2012
C.3.3设置扩增度应条件:94 ℃ 3 mu;94℃ 45 s,54 ℃ 50 s,72 ℃120 s.35个循环：最后 72 ℃5 min,进行 PCR扩增。
C.4电泳
取 [0 I.扩增产物加人 2 μL溴蓝上样缓冲液,混.加样于1. 5%琼脂糖凝腔(含0. 5 μ/mI溴化乙锭)胶孔中.以5V/cm稳定电压也脉30min,用凝胶减像系统观察是季出现月的条节（3sbp）C.5
结果判定
如明性对照利空问对照未出现条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扌增条带（片段大小为3c9bp),则可初步判定该样品莱姆病螺旋体 1CR检验阳性,应进-步进行测序验证；如果待测样昂中末山现PCR扩增产物·则可判断待测样品莱姆病螺旋体PCR检验阴性。SN/T 3392-2012
D.1初培养
（规范性附录）
莱姆病媒旋体的离体培养鉴定
将疑似患者戴宿主动物的而疫标本，直接滴入BSKI培养基中，培养基与培养物的体积比一般在8~10：1（下同），加塞后33℃培养3d~7d不少于3d），COz浓度5%（下同）。每传代一次，取样一滴，加盖玻片后湿片400俯暗视野进行观察。媒介样品培养操作方法与结果和血液样品相同。0. 2
传代培养
取D.1初培养中阳性培养物两滴到三滴，加入新鲜BSKⅡ培养基，加塞后33℃培养2d～7d。按D.1取样观察，当观察剑每视鼾有螺旋体10-~20条即可冻存，D.3冻存保种
取上述培养物，80001/min离心15min，弃上清液，将沉淀物用新鲜BSKⅡ培养基滤勾，分别取150μL加入冷冻管内，等量加入冻存液。先放人4℃冰箱2h后，冰浴5mir～10min后再放人液氮罐中冻存。
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