SN/T 3448-2012
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标准简介
SN/T 3448-2012.Detection and identification of peach yellows phytoplasma.
1范围
SN/T 3448规定了桃树黄化植原体的检疫和鉴定方法。
SN/T 3448适用于进出境桃树苗木及接穗中桃树黄化植原体的检疫和鉴定。
2原理
2.1 基本信息
桃树黄化植原体( peach yellows phytoplasma)，软壁菌门(Tendericutes) ,柔膜菌纲( Mollicuteria),
菌原体目(Mycoplasmatales) ,非醇原体科(Acholeplasmataceae) ,植原体候选属(candidatus phytoplas-ma),16 Sr I植原体组。
2.2 方法原理
植原体的生物学特性和基因序列等分子生物学信息是该检疫鉴定方法的依据。
DAPI作为一种初步筛选植原体的方法; PCR技术灵敏度高、特异性好,RFLP技术目前是国际上植原体鉴定分类的主要方法,在本标准中PCR技术与RFLP技术结合作为鉴定桃树黄化植原体的最终方法。
3器材和试剂
PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机,台式小型离心机、超低温
冰箱、冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、荧光显微镜、电子显微镜。
4检测鉴定方法
4.1症状观察
仔细观察桃树种苗、叶片等,症状描述参见附录A的A.1。
4.2 DAPI 染色
选取幼嫩组织(新叶叶梗,枝梢,茎杆及根部韧皮部组织)，切片,用1μg/mL DAPI溶液(4',6-二脒基-2苯基吲哚)染色,在460nm激发条件,荧光显微镜观察,在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。因植株内植原体分布不均,故每个样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。
1范围
SN/T 3448规定了桃树黄化植原体的检疫和鉴定方法。
SN/T 3448适用于进出境桃树苗木及接穗中桃树黄化植原体的检疫和鉴定。
2原理
2.1 基本信息
桃树黄化植原体( peach yellows phytoplasma)，软壁菌门(Tendericutes) ,柔膜菌纲( Mollicuteria),
菌原体目(Mycoplasmatales) ,非醇原体科(Acholeplasmataceae) ,植原体候选属(candidatus phytoplas-ma),16 Sr I植原体组。
2.2 方法原理
植原体的生物学特性和基因序列等分子生物学信息是该检疫鉴定方法的依据。
DAPI作为一种初步筛选植原体的方法; PCR技术灵敏度高、特异性好,RFLP技术目前是国际上植原体鉴定分类的主要方法,在本标准中PCR技术与RFLP技术结合作为鉴定桃树黄化植原体的最终方法。
3器材和试剂
PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机,台式小型离心机、超低温
冰箱、冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、荧光显微镜、电子显微镜。
4检测鉴定方法
4.1症状观察
仔细观察桃树种苗、叶片等,症状描述参见附录A的A.1。
4.2 DAPI 染色
选取幼嫩组织(新叶叶梗,枝梢,茎杆及根部韧皮部组织)，切片,用1μg/mL DAPI溶液(4',6-二脒基-2苯基吲哚)染色,在460nm激发条件,荧光显微镜观察,在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。因植株内植原体分布不均,故每个样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3448—2012
桃树黄化植原体检疫鉴定方法
Detection and identification of peach yellows phytoplasma2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1：2009给出的规则起节。本标准由国家认证认可监督管期委员会提出并归口。SN/13448—2012
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁夏出人境检验检疫局，中华人民共和国迁宁出人境检验检疫局，
本标准主要起草人：牟海青、陈林、李萍、杨毅、赵文军、术水芳、王有福。1
1范围
桃树黄化植原体检疫鉴定方法
本标准规定了桃树黄化植原体的检疫和鉴定方法。本标准适用于进出境桃树苗木及接穗中桃树黄化植原体的检疫和鉴定。2原理
2.1基本信息
SN/T3448—2012
桃树黄化植原体（peachyellowsphytoplasma），软壁菌门（Tendericutes），柔膜菌纲（Mollicuteria），茵原体目（Mycoplasmatales），非醇原体科Acholeplasmataceae），植原体候选属（candidatusphytoplas-ma），16SrI植原体组。
2.2方法原理
植原体的生物学特性和基因序列等分了生物学信息是该检疫鉴定方法的依据。DAPI作为一种初步筛选植原体的方法：PCR技术灵敏度高、特异性好，RFLP技术目前是国际上植原体鉴定分类的主要方法，在本标准中PCR技术与RFLP技术结合作为鉴定桃树黄化植原体的最终方法。
3器材和试剂
PCR仪、超净工作台、灭菌锅制水机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机，台式小型离心机、超低温冰箱、冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、荧光显微镜、电子显微镜。DAPI(4'，6-二胀基-2-苯基吲哚）PCR缓冲液、MgCl2dNTP、TaqDNA聚合酶、引物等。4检测鉴定方法
4.1症状观察
仔细观察桃树种苗、叶片等，症状描述参见附录A的A.1。4.2DAPI染色
选取幼嫩组织（新叶叶梗，枝梢，茎杆及根部韧皮部组织），切片，用1μg/mLDAPI溶液（4，6-二基-2-苯基吲哚）染色，在460nm激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。因植株内植原体分布不均，故每个样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。4.3电子显微镜观察
将采集的样品制备超薄切片，通过电子显微镜观察植物韧皮部是否存在植原体粒体。方法参见附录B。
SN/T 3448—2012
通用引物PCR，电泳检测.产物测序并比对分析4.4
发病植物样品总DNA提取方法参见附录C通用引物PCR凝胶电泳并测序（见附录D)。4.5RILP图谱检测bzxZ.net
沈录E
5结果判定
5.1表现病状与A.1描述一效［L1.2检测实验中DAPI染色观察结果显示蓝色荧光：可初步判定可能为桃树黄化植原体，仙需通过4.4.4.5方案进一步检测，5.2在4.3检测中，若通过电子显微镜观察，发现桃树韧皮部筛管中含有直径为500I~-1000m的圆形、椭圆形，不规则形状等的菌原体，则可初步判定可能为桃树黄化植原体，但需要1.4、4.5力案的进-步检测。
5.3在4.4检测中，若PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性，可初步判定为桃树黄化梢原体，经序列测定并比对后,若与ID.4中序列同源性大下97.5还.则可用4. 5检测方法进步确认。5.4在1.5检测中，若经通用引物扩增所得序列经17种限制性内切酶酶切后与图E.1-致可判定该样品携带桃树黄化植原体！
6样品保存与核
6.1样品保存与处理
样品经登记和经于人签字后妥善保存。对检出桃树英化植原休的样品应保存丁一20℃冰箱中，以备复核。该类样黏保存期满后应经高压灭菌后方可处理。6.2结果记录与资料保存
完整的实验记求包括：样品的来源种类、时间，实验的时间，地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PC:R凝胶电泳检测需有电泳结果照片。6.3复核
由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负贞。七要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。KAoNiKAca
A,1 症状
附录A
(资料性附录）
植原体生物学特性
SN/T 3448-2012
主要对桃树叶片以及果实进行症状观察。该植原体病害最典型症状为叶片黄化,果实较小,植株长势衰退、提前落叶
A.2寄主范围
桃树是主要的奇主，包括碧桃（Prunurpersica），毛桃（Anygdalurhersica）等，A.3传播途径
主要由取食植株韧皮部的介体昆虫传播，如叶蝉（ireriettfturii）、蚜虫（Aphiue）等;感病桃树种苗、接穗等调运可以使植原体病原远距离传播。桃植株之间的嫁接可以传播桃黄化病，另外，嫁接能够将植原体从挑树传到长春花上，A.4地理分布
北京、四川等，其他国家无报道。KAoNiKAca
SN/T3448-2012
B.1试剂试材
B.1.1钱酸固定液
巴比妥乙酸缓冲液的1%银酸固定液①溶液
巴比妥钠CHNON
乙酸钠（CHCOONa)
加双蒸馏水至100mL
②溶液
取2%钱酸水溶液
①溶液
0.1mol/L盐酸（HCI)
加双蒸馏水至25.0ml
混合后用0.1mol/L盐酸凋至pH
B.1.2戊二醛固定液
一般为25%戊二醛水溶液
B.1.3环氧树脂
Epon812
顺丁烯二酸酐DDSA）
邻苯二甲酸二丁酯（D.BP）
二乙基苯胺（D.M.P-30）
附录B
（资料性附录）
电子显微镜观察
使固定液，在冰箱保存备用。
可配制在除色比要以外的任何缓冲液中使用，终浓度为25%。5ml
将EpOn812倒入烧杯中，置80温箱融化备用。按上述比例，顺序加人DDSA，充分搅拌，待熔化呈透明，至室温，再加人邻苯二甲酸二丁酯行细搅拌，然后慢侵逐滴加人二乙基苯胺，边加边搅拌，至包埋剂呈红棕色。
B.1.4Formvar膜
将聚乙烯醇缩甲醛溶于三氯甲烷，配成0.2%～3%溶液，存于冰箱备用。制膜时取一块干净玻璃片插入溶液中，取出倾斜待三氟甲烷挥发，用镊子沿玻璃边划痕，再将玻璃倾斜浸人蒸馏水中，薄膜即从玻璃上脱落下米漂浮于水面，取干净的铜网摆上，压紧，在用一块滤纸覆盖其上，捞起后置干培养Ⅲ干燥备用。
B.2实验步骤
B.2.1取材
选取呈现症状的桃树叶片或者幼嫩茎，用刀片切取叶脉、叶柄或者幼嫩枝条，大小为3mm。取健TTKAoNiKAca
康桃树叶片作为阴性对照。
B.2.2固定
SN/T3448—2012
采用戌二醛-钱酸双固定法。样品在25%戊二醛进行前固定2h后，PBS(0.2mol/LpH7.4）清洗三次。然后用1%银酸后固定2h，PBS清洗三次。B.2.3脱水
采用乙醇和系列梯度脱水：30%乙醇/15min→50%乙醇/15min→70%乙醇/15min→80%丙酮/15min→90%丙酮/15min→100%丙酮/15min。样品可在70%乙醇中停留过夜。B.2.4渗透
脱水后的组织块在丙酮/树脂(1：1)中渗透3d,再在全树脂中渗透1d。B.2.5包理
用环氧树脂做包埋剂。将组织块放在胶囊中央，滴入包埋剂。于37℃下24h，45℃下24h，60℃下24h。
B.2.6切片
在超薄切片机上将固化的组织块作切片。选择好的切片，将切片用二甲苯蒸发展开，用载有Formvar膜的铜网捞起，置培养血内于燥、保存。B.2.7切片染色
采用乙酸双氧铀和柠檬酸铅双染色。取染色蜡盘数个，将乙酸双氧铀染色滴人蜡盘上。取带切片的铜网，插人染色滴中，染20min~30min，然后取出铜网.蒸馏水洗去多余染液滤纸吸干：将铜网再放人另一蜡盘，滴人柠檬酸铅染液，使铜网翻扣在染色液滴上，染20min~30min，再用0.1mol/L氢氧化钠漂洗干净，滤纸吸干。
B.2.8显微镜观察
透射电子显微镜观察植原体形态，如图B.1。图B.1植原体形态（引自Bertaccini，2007）5
KAONiKAca
SN/T 3448—2012
c.1植原体细胞的富集
C.T.1溶液配制
附录C
（资料性附录）
植原体 DNA 的提取
植原体细胞富集缓冲液（100mI.)：无水K,HP().1.(7g，KHPO.0.41g，照糖10g牛血清白蛋白0.15g.PVP-IC2g维牛素C0.53g+用5mol/I.的K(H调节pH值至7.6。C1.2植原体细胞的富集方法
称取新鲜样品叶中脉1、g，加人7tm.~8tm.新制备的富集缓冲液，50tg的右英砂，于研体中研磨。冰上放置10min～15min，加入5ml.相同的缓冲液并摇晃均勾；将悬浊液转移率15ml离心管，5000r/min使用冷的离心转头（BeckmanJA20)4℃离心5min，将上清液移全另一个离心管中，19000)r/min离心20min1，下燥沉淀并用60℃预热的2ml.2必（A3溶波，重悬沉淀；60℃水浴中温浴，并不定期的摇动。
C.2DNA提取
C.2.1溶液配制
DNA提取缓冲液：2以CTAB(50C左右游解）.1.4mol/LNaCl.20mmol/LED)TA，100mmol/ITris-HCl pH8.
C.2.2DNA提取方法
将1tiL富集伴品转移至2mL离心管，加人1mLJVA提取缓冲液，将离心管置于65℃水浴中温浴1h~1.5h，每厢20min左右将离心管颠倒混勺;2000g，1C离心2min；将离心后的上清液转移至—-个新的离心管，加人二氛甲烷/异戊婷21/1)1mL混匀，形成乳浊液；将乳独液在13000g的条件下，离心5min：将上清液转人新管，加人800μL顶冷的异丙醇，15000g条件下，离心1门mit：弃上清液加人500pL的70%乙醇，在15000g的条件下，离心5min；弃掉1清液，于燥沉淀加人100l.的灭菌蒸馅水溶解。
其他的DNA提取方法也可以借鉴，他可以选择使用商业TXA提取试剂盒，提取的LNA在--8O的条件下可以冻存1年，
KAoNiKAca
引物序列
植原体通用引物：
附录D
（规范性附录》
通用引物 PCR 检测
R16F2n:5'-GAA ACG ACT GCT AAG ACT GC-3R16R2;5'-TGA CGG GCG GIG TGT ACA AAC CCC G-3D.2
PCR反应体系及参数
D.2.1PCR反应体系
见表 D.1。
表 D.1PCR反应体系
试剂名称
10× PCR 反应缓冲液
正向引物
反向引物
Tay DNA聚合醇
DVA模板
补0至
注：IDNA模板的取量应根据 INA的提取浓度、纯度而调节。阴性对照、阳性对照和空白对照的设置D.2. 2
阴性对照：以健康的桃树叶片 TDN4为模板。终浓度
2.5 mmol/1
0.1 mmol/L
o. 5 μmol/L
0.5 μmol/1.
阳性对照：以携带有桃树黄化植原体16S rDNA序列的质粒为模板。PCR反应的空白对照以水代替DVA模板，D.2.3PCR的反应参数
SN/T 3448-2012
R16F2n/R16R2:94 ℃/2 min:91 ℃/1 min, 60 ℃/30 S,72 :/1 min.35 个循环;72 ℃ 10 min:注：不同仪器可据仅器要求将反应参数作适当训整，1).3琼脂糖凝胶电泳
制备 1为的琼脂糖凝胶,以 DNAMarkcr作为相对分了质量标记，进行电泳分析,电泳结束后在凝SN/T34482012
胶成像仪观察并记录结果。
4序列测定
序列如下：
5-GAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAGACAAGAAGGCATCTTCTTGTTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGGGAGGAGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGACTATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTACGTAAAGTTCTTTTATTAGGGAAGAATAAATGATGGAAAAAT
ACTAAIGAATAAGCOCCGGCTAACT
ATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTA
AAGGGTGCGTAGGCGGTTAAATAAGTTTATGGIOTAAGTGCAATGCTCAACATTGTGATGOTATAAAAACTGTTTAGCTAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGTGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTAAACGTTGGTTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAAGCTCACCAGGTCTTGACATGCTTCTGCAAAGCTGTAGAAACACAGLGGAGGTTATCAGTTGGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAOGAGOGCAACCCTTATTGTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCAAGACTGCOAGTGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGGGTAGCTGAAGCGCAAGTT
GAAGTCTGCAACTCGACTTCATG
TTTGGCGAATCTCAAAAAAACAGTCTCAGTTCGGATTAGTTGGAATCGCTAGT
AATCGCGAATCAGCATGTCG
CGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCOTCA3'D.5
结果判断
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳可以对检测结果进行初步鉴定、引物R16F2n/R16R2扩增1.24kb左右大小的条带。R16F2n/R16R2引物扩增产物经克隆后测序获得D.4序列，则判定结果为阳性。通过测得16STDNA序列的方法鉴定植原体，需要测得的DNA序列至少为1.24kb左右，即R16F2n/R16R2引物扩增的片段长度。
E.1引物序列
附录E
（规范性附录）
RFLP指纹图谱分析
R16F2n:5°-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3'R16R2.5-TGACGGGCGGTCTC
E.2PCR反应体系
同D.2.1。
E.3PCR的反应参数
同D.2.3。
注，不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调菌E.4RFLP分析
SN/T3448—2012
序列输人模拟RFLPiPhyelassifier软件（http：/（plantpa-将D,4中大小为1246bp的16SDNA
thology.ba,ars.usda.gov/phytoplasma.htm，经17种限制性内切酶AtuI，BamHI，BfaI，BstUIDra IEcoRIHae,Hha
SspI、TaqI)切后RFLP图谱如图
HpaIKpn
IMboIMseIRsaI
SN/T 3448--2012
桃树黄化植原体 16SrDNA序列RFLP模式图图E1
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桃树黄化植原体检疫鉴定方法
Detection and identification of peach yellows phytoplasma2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1：2009给出的规则起节。本标准由国家认证认可监督管期委员会提出并归口。SN/13448—2012
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁夏出人境检验检疫局，中华人民共和国迁宁出人境检验检疫局，
本标准主要起草人：牟海青、陈林、李萍、杨毅、赵文军、术水芳、王有福。1
1范围
桃树黄化植原体检疫鉴定方法
本标准规定了桃树黄化植原体的检疫和鉴定方法。本标准适用于进出境桃树苗木及接穗中桃树黄化植原体的检疫和鉴定。2原理
2.1基本信息
SN/T3448—2012
桃树黄化植原体（peachyellowsphytoplasma），软壁菌门（Tendericutes），柔膜菌纲（Mollicuteria），茵原体目（Mycoplasmatales），非醇原体科Acholeplasmataceae），植原体候选属（candidatusphytoplas-ma），16SrI植原体组。
2.2方法原理
植原体的生物学特性和基因序列等分了生物学信息是该检疫鉴定方法的依据。DAPI作为一种初步筛选植原体的方法：PCR技术灵敏度高、特异性好，RFLP技术目前是国际上植原体鉴定分类的主要方法，在本标准中PCR技术与RFLP技术结合作为鉴定桃树黄化植原体的最终方法。
3器材和试剂
PCR仪、超净工作台、灭菌锅制水机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机，台式小型离心机、超低温冰箱、冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、荧光显微镜、电子显微镜。DAPI(4'，6-二胀基-2-苯基吲哚）PCR缓冲液、MgCl2dNTP、TaqDNA聚合酶、引物等。4检测鉴定方法
4.1症状观察
仔细观察桃树种苗、叶片等，症状描述参见附录A的A.1。4.2DAPI染色
选取幼嫩组织（新叶叶梗，枝梢，茎杆及根部韧皮部组织），切片，用1μg/mLDAPI溶液（4，6-二基-2-苯基吲哚）染色，在460nm激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。因植株内植原体分布不均，故每个样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。4.3电子显微镜观察
将采集的样品制备超薄切片，通过电子显微镜观察植物韧皮部是否存在植原体粒体。方法参见附录B。
SN/T 3448—2012
通用引物PCR，电泳检测.产物测序并比对分析4.4
发病植物样品总DNA提取方法参见附录C通用引物PCR凝胶电泳并测序（见附录D)。4.5RILP图谱检测bzxZ.net
沈录E
5结果判定
5.1表现病状与A.1描述一效［L1.2检测实验中DAPI染色观察结果显示蓝色荧光：可初步判定可能为桃树黄化植原体，仙需通过4.4.4.5方案进一步检测，5.2在4.3检测中，若通过电子显微镜观察，发现桃树韧皮部筛管中含有直径为500I~-1000m的圆形、椭圆形，不规则形状等的菌原体，则可初步判定可能为桃树黄化植原体，但需要1.4、4.5力案的进-步检测。
5.3在4.4检测中，若PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性，可初步判定为桃树黄化梢原体，经序列测定并比对后,若与ID.4中序列同源性大下97.5还.则可用4. 5检测方法进步确认。5.4在1.5检测中，若经通用引物扩增所得序列经17种限制性内切酶酶切后与图E.1-致可判定该样品携带桃树黄化植原体！
6样品保存与核
6.1样品保存与处理
样品经登记和经于人签字后妥善保存。对检出桃树英化植原休的样品应保存丁一20℃冰箱中，以备复核。该类样黏保存期满后应经高压灭菌后方可处理。6.2结果记录与资料保存
完整的实验记求包括：样品的来源种类、时间，实验的时间，地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PC:R凝胶电泳检测需有电泳结果照片。6.3复核
由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负贞。七要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。KAoNiKAca
A,1 症状
附录A
(资料性附录）
植原体生物学特性
SN/T 3448-2012
主要对桃树叶片以及果实进行症状观察。该植原体病害最典型症状为叶片黄化,果实较小,植株长势衰退、提前落叶
A.2寄主范围
桃树是主要的奇主，包括碧桃（Prunurpersica），毛桃（Anygdalurhersica）等，A.3传播途径
主要由取食植株韧皮部的介体昆虫传播，如叶蝉（ireriettfturii）、蚜虫（Aphiue）等;感病桃树种苗、接穗等调运可以使植原体病原远距离传播。桃植株之间的嫁接可以传播桃黄化病，另外，嫁接能够将植原体从挑树传到长春花上，A.4地理分布
北京、四川等，其他国家无报道。KAoNiKAca
SN/T3448-2012
B.1试剂试材
B.1.1钱酸固定液
巴比妥乙酸缓冲液的1%银酸固定液①溶液
巴比妥钠CHNON
乙酸钠（CHCOONa)
加双蒸馏水至100mL
②溶液
取2%钱酸水溶液
①溶液
0.1mol/L盐酸（HCI)
加双蒸馏水至25.0ml
混合后用0.1mol/L盐酸凋至pH
B.1.2戊二醛固定液
一般为25%戊二醛水溶液
B.1.3环氧树脂
Epon812
顺丁烯二酸酐DDSA）
邻苯二甲酸二丁酯（D.BP）
二乙基苯胺（D.M.P-30）
附录B
（资料性附录）
电子显微镜观察
使固定液，在冰箱保存备用。
可配制在除色比要以外的任何缓冲液中使用，终浓度为25%。5ml
将EpOn812倒入烧杯中，置80温箱融化备用。按上述比例，顺序加人DDSA，充分搅拌，待熔化呈透明，至室温，再加人邻苯二甲酸二丁酯行细搅拌，然后慢侵逐滴加人二乙基苯胺，边加边搅拌，至包埋剂呈红棕色。
B.1.4Formvar膜
将聚乙烯醇缩甲醛溶于三氯甲烷，配成0.2%～3%溶液，存于冰箱备用。制膜时取一块干净玻璃片插入溶液中，取出倾斜待三氟甲烷挥发，用镊子沿玻璃边划痕，再将玻璃倾斜浸人蒸馏水中，薄膜即从玻璃上脱落下米漂浮于水面，取干净的铜网摆上，压紧，在用一块滤纸覆盖其上，捞起后置干培养Ⅲ干燥备用。
B.2实验步骤
B.2.1取材
选取呈现症状的桃树叶片或者幼嫩茎，用刀片切取叶脉、叶柄或者幼嫩枝条，大小为3mm。取健TTKAoNiKAca
康桃树叶片作为阴性对照。
B.2.2固定
SN/T3448—2012
采用戌二醛-钱酸双固定法。样品在25%戊二醛进行前固定2h后，PBS(0.2mol/LpH7.4）清洗三次。然后用1%银酸后固定2h，PBS清洗三次。B.2.3脱水
采用乙醇和系列梯度脱水：30%乙醇/15min→50%乙醇/15min→70%乙醇/15min→80%丙酮/15min→90%丙酮/15min→100%丙酮/15min。样品可在70%乙醇中停留过夜。B.2.4渗透
脱水后的组织块在丙酮/树脂(1：1)中渗透3d,再在全树脂中渗透1d。B.2.5包理
用环氧树脂做包埋剂。将组织块放在胶囊中央，滴入包埋剂。于37℃下24h，45℃下24h，60℃下24h。
B.2.6切片
在超薄切片机上将固化的组织块作切片。选择好的切片，将切片用二甲苯蒸发展开，用载有Formvar膜的铜网捞起，置培养血内于燥、保存。B.2.7切片染色
采用乙酸双氧铀和柠檬酸铅双染色。取染色蜡盘数个，将乙酸双氧铀染色滴人蜡盘上。取带切片的铜网，插人染色滴中，染20min~30min，然后取出铜网.蒸馏水洗去多余染液滤纸吸干：将铜网再放人另一蜡盘，滴人柠檬酸铅染液，使铜网翻扣在染色液滴上，染20min~30min，再用0.1mol/L氢氧化钠漂洗干净，滤纸吸干。
B.2.8显微镜观察
透射电子显微镜观察植原体形态，如图B.1。图B.1植原体形态（引自Bertaccini，2007）5
KAONiKAca
SN/T 3448—2012
c.1植原体细胞的富集
C.T.1溶液配制
附录C
（资料性附录）
植原体 DNA 的提取
植原体细胞富集缓冲液（100mI.)：无水K,HP().1.(7g，KHPO.0.41g，照糖10g牛血清白蛋白0.15g.PVP-IC2g维牛素C0.53g+用5mol/I.的K(H调节pH值至7.6。C1.2植原体细胞的富集方法
称取新鲜样品叶中脉1、g，加人7tm.~8tm.新制备的富集缓冲液，50tg的右英砂，于研体中研磨。冰上放置10min～15min，加入5ml.相同的缓冲液并摇晃均勾；将悬浊液转移率15ml离心管，5000r/min使用冷的离心转头（BeckmanJA20)4℃离心5min，将上清液移全另一个离心管中，19000)r/min离心20min1，下燥沉淀并用60℃预热的2ml.2必（A3溶波，重悬沉淀；60℃水浴中温浴，并不定期的摇动。
C.2DNA提取
C.2.1溶液配制
DNA提取缓冲液：2以CTAB(50C左右游解）.1.4mol/LNaCl.20mmol/LED)TA，100mmol/ITris-HCl pH8.
C.2.2DNA提取方法
将1tiL富集伴品转移至2mL离心管，加人1mLJVA提取缓冲液，将离心管置于65℃水浴中温浴1h~1.5h，每厢20min左右将离心管颠倒混勺;2000g，1C离心2min；将离心后的上清液转移至—-个新的离心管，加人二氛甲烷/异戊婷21/1)1mL混匀，形成乳浊液；将乳独液在13000g的条件下，离心5min：将上清液转人新管，加人800μL顶冷的异丙醇，15000g条件下，离心1门mit：弃上清液加人500pL的70%乙醇，在15000g的条件下，离心5min；弃掉1清液，于燥沉淀加人100l.的灭菌蒸馅水溶解。
其他的DNA提取方法也可以借鉴，他可以选择使用商业TXA提取试剂盒，提取的LNA在--8O的条件下可以冻存1年，
KAoNiKAca
引物序列
植原体通用引物：
附录D
（规范性附录》
通用引物 PCR 检测
R16F2n:5'-GAA ACG ACT GCT AAG ACT GC-3R16R2;5'-TGA CGG GCG GIG TGT ACA AAC CCC G-3D.2
PCR反应体系及参数
D.2.1PCR反应体系
见表 D.1。
表 D.1PCR反应体系
试剂名称
10× PCR 反应缓冲液
正向引物
反向引物
Tay DNA聚合醇
DVA模板
补0至
注：IDNA模板的取量应根据 INA的提取浓度、纯度而调节。阴性对照、阳性对照和空白对照的设置D.2. 2
阴性对照：以健康的桃树叶片 TDN4为模板。终浓度
2.5 mmol/1
0.1 mmol/L
o. 5 μmol/L
0.5 μmol/1.
阳性对照：以携带有桃树黄化植原体16S rDNA序列的质粒为模板。PCR反应的空白对照以水代替DVA模板，D.2.3PCR的反应参数
SN/T 3448-2012
R16F2n/R16R2:94 ℃/2 min:91 ℃/1 min, 60 ℃/30 S,72 :/1 min.35 个循环;72 ℃ 10 min:注：不同仪器可据仅器要求将反应参数作适当训整，1).3琼脂糖凝胶电泳
制备 1为的琼脂糖凝胶,以 DNAMarkcr作为相对分了质量标记，进行电泳分析,电泳结束后在凝SN/T34482012
胶成像仪观察并记录结果。
4序列测定
序列如下：
5-GAAACGACTGCTAAGACTGGATAGGAGACAAGAAGGCATCTTCTTGTTTTTAAAAGACCTAGCAATAGGTATGCTTAGGGAGGAGCTTGCGTCACATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGACTATGATGTGTAGCCGGGCTGAGAGGTTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGAGGAAACTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGTATTTCGGTACGTAAAGTTCTTTTATTAGGGAAGAATAAATGATGGAAAAAT
ACTAAIGAATAAGCOCCGGCTAACT
ATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTA
AAGGGTGCGTAGGCGGTTAAATAAGTTTATGGIOTAAGTGCAATGCTCAACATTGTGATGOTATAAAAACTGTTTAGCTAGAGTAAGATAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGTGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTTTACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTACTAAACGTTGGTTAAAACCAGTGTTGAAGTTAACACATTAAGTACTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTTAAAGGAATTGACGGGACTCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGGTACCCGAAAAAGCTCACCAGGTCTTGACATGCTTCTGCAAAGCTGTAGAAACACAGLGGAGGTTATCAGTTGGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAOGAGOGCAACCCTTATTGTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGGACTTTAGCAAGACTGCOAGTGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGTTACAAAGGGTAGCTGAAGCGCAAGTT
GAAGTCTGCAACTCGACTTCATG
TTTGGCGAATCTCAAAAAAACAGTCTCAGTTCGGATTAGTTGGAATCGCTAGT
AATCGCGAATCAGCATGTCG
CGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCOTCA3'D.5
结果判断
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳可以对检测结果进行初步鉴定、引物R16F2n/R16R2扩增1.24kb左右大小的条带。R16F2n/R16R2引物扩增产物经克隆后测序获得D.4序列，则判定结果为阳性。通过测得16STDNA序列的方法鉴定植原体，需要测得的DNA序列至少为1.24kb左右，即R16F2n/R16R2引物扩增的片段长度。
E.1引物序列
附录E
（规范性附录）
RFLP指纹图谱分析
R16F2n:5°-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3'R16R2.5-TGACGGGCGGTCTC
E.2PCR反应体系
同D.2.1。
E.3PCR的反应参数
同D.2.3。
注，不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调菌E.4RFLP分析
SN/T3448—2012
序列输人模拟RFLPiPhyelassifier软件（http：/（plantpa-将D,4中大小为1246bp的16SDNA
thology.ba,ars.usda.gov/phytoplasma.htm，经17种限制性内切酶AtuI，BamHI，BfaI，BstUIDra IEcoRIHae,Hha
SspI、TaqI)切后RFLP图谱如图
HpaIKpn
IMboIMseIRsaI
SN/T 3448--2012
桃树黄化植原体 16SrDNA序列RFLP模式图图E1
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