SN/T 3492-2013
基本信息
标准号： SN/T 3492-2013
中文名称：传染性肌肉坏死检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3492-2013.Quarantine protocol for infectious myonecrosis.
1范围
SN/T 3492规定了传染性肌肉坏死病毒( Infectious myonecrosis virus,IMNV)的反转录聚合酶链式反应和实时荧光定量反转录聚合酶链式反应的检测方法。
SN/T 3492适用于具有临床症状的传染性肌肉坏死(Infectiousmyonecrosis,IMN)的检疫和诊断。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088出 人境动物检疫采样
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1反转录-聚合酶链式反应reverse transcription polymerase chain reaction; RT-PCRRNA在逆转录酶的作用下，在适宜反应条件下，被逆转录成cDNA,以cDNA为模板进行聚合酶链式反应。
3.2实时荧光定量反转录-聚合酶链式反应real-time RT-PCR
在常规RT-PCR的基础.上，加人一条特异性的黄光探针,荧光PCR仪器的监测系统可以接收到PCR反应中的荧光信号,每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成,使荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
3.3Ct值cycle threshold
Real-timeRT-PCR每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
1范围
SN/T 3492规定了传染性肌肉坏死病毒( Infectious myonecrosis virus,IMNV)的反转录聚合酶链式反应和实时荧光定量反转录聚合酶链式反应的检测方法。
SN/T 3492适用于具有临床症状的传染性肌肉坏死(Infectiousmyonecrosis,IMN)的检疫和诊断。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088出 人境动物检疫采样
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1反转录-聚合酶链式反应reverse transcription polymerase chain reaction; RT-PCRRNA在逆转录酶的作用下，在适宜反应条件下，被逆转录成cDNA,以cDNA为模板进行聚合酶链式反应。
3.2实时荧光定量反转录-聚合酶链式反应real-time RT-PCR
在常规RT-PCR的基础.上，加人一条特异性的黄光探针,荧光PCR仪器的监测系统可以接收到PCR反应中的荧光信号,每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成,使荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
3.3Ct值cycle threshold
Real-timeRT-PCR每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3492—2013
传染性肌肉坏死检疫技术规范
Quarantine protocol for infectious myonecrosis2013-03-01发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-09-16实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T3492—2013
本标准参考了OIE《水生动物疾病诊断手册（2011年版）》第2.2.3章，选取OTE手册中临床诊断内容和分子诊断中关于反转录-聚合酶链式反应和实时荧光定量反转录-聚合酶链式反应检测方法的内容。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国海南出人境检验检疫局、中华人民共和国湖南出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、本标准主要起草人：兰文升、郑晓聪、史秀杰、黄继徽、唐连飞、贾鹏、王津津、叶奕优、主红英。1
1范围
传染性肌肉坏死检疫技术规范
SN/T3492—2013
本标准规定了传染性肌肉坏死病毒（InfectiousmyonecrosisvirusIMNV）的反转录-聚合酶链式反应和实时荧光定量反转录-聚合酶链式反应的检测方法。本标准适用于具有临床症状的传染性肌肉坏死(Infectiousmyonecrosis，IMN)的检疫和诊断。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫来样
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
反转录-聚合酶链式反应reversetransseription polymerasechain reaction;RT-PCRRNA在逆转录酶的作用下，在适宜反应条件下，被逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行聚合酶链式反应。
实时荧光定量反转录-聚合酶链式反应在常规RT-PCR的基础上，加人
PCR反应中的荧光信号，每扩增
形成完全同步。
Ct值cycle threshold
RT-PCR
real-time
异性的荧光探针
，荧光PCR仪器的监测系统可以接收到一条DNA链，就有一
个荧光分子形成，使荧光信号的累积与PCR产物Real-timeRT-PCR每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。主要试剂和材料
除特别说明外，本标准仅使用确认为分析纯的试剂。4.2
水：应符合GB/T6682中一级水的规定。4.3Tag酶：-20℃保存。
4.4反转录酶：-20℃保存。
4.5RNase抑制剂：20℃保存。
4.6T7RNA聚合酶：一20℃保存。4.7DNasel:-20℃保存。
SN/T3492—2013
4.8pGEM-TEasyVector：-20C保存。4.9Pstl限制性内切酶：-20℃保存。4.10NTP：含CTP.GTP、ATP、TTP各2.5mmol/L的混合物，一20℃保存。dVTP：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L的混合物，一20C保存4.11
浓度为20umol/L，一20℃保存，其序列如下：正义引物（IMNV218F)：5'-GCTGGACTGTATTGGTTGAG-3；反义引物(IMNV682R):5-AACCAAGTTCTTCTTCTCCAGTT-3正义引物（4587F)：5'-CGACGCTGCTAACCATACAA-3'；反义引物(4914R)：5-ACTCGGCTGTTCGATCAAGT-3；正义引物(4725NF):5*-GGCACATGCTCAGAGACA-3°；反义引物（4863NR)：5'-AGCGCTGAGTCCAGTCTTG-3；正义引物(IMNV412F).5'-GGACCTATCATACATAGCGTTTGCA-3；反义引物（IMNV545R)：5-AACCCATATCTATTGTCGCTGGAT-3；探针（IMNVp1)：
5'-6FAM CCA CCT TTACTT TCA ATA CTA CAT CAT CCC CGG-TAMRA-3';引物用无RNA酶的去离子水配制成100(mol/L的储备液，在使用过程中根据需要配制不同工作浓度。
病毒RNA抽提试剂盒或其他抽提RNA的等效产品。澳化乙锭（EB）。
溴酚蓝DNA上样液（见附录A)。
TAE电泳缓冲液（见附录A）。
核酸分子量标准参照物
器材和设备
PCR扩增仪。
实时荧光定量PCR仪器（7500RealTimePCRSystem或其他等效设备）。电泳仪(OV~3V)和水平电泳槽。
微量移液器和微量移液器吸头。凝胶成像仪。
恒温培养箱。
普通冰箱和低温冰箱。
匀浆器。
台式高速离心机和离心管
制冰机。
电泳仪。
临床症状的诊断
行为变化
出现环境胁迫时，严重感染的虾表现为游动缓慢，持续进食；将虾体解剖，发现此时病虾的胃肠一般2
-iiKAoNiKAca
充满食物。
6.2发病症状
SN/T3492—2013
急性发病期虾样的骨骼肌呈现点状或者片状坏死区域，尤其是尾部腹节和尾肢，病灶区肌肉发白及不透明症状。显微镜观察，肌肉组织出现浮肿和淋巴器官中血细胞纤维化，在坏死的肌纤维和纤维化的血细胞之间有液体堆积，并常伴有深色包涵体7取样和样品处理
7.1样品的运输与保存
按照GB/T18088采样，样品至少应在4℃以下的环境中运输，实验室接收样品后应该尽快检测，如果暂时不能检测，应该将样品置于一80℃冰箱中保存。7.2取样
样品尽可能取后期幼体和成虫期虾样，取样器官是对虾条纹肌、结缔组织或血细胞（参见附录B）：可以把不超过5头的样本混合做混样。取每只虾的肌肉组织20tmg~50mg，合计100mg~250mg样品，研磨均匀待用。
7.3制样
将取好样品混合均勾后，再取20mg～50mg加人适量RNA抽提试剂盒中的裂解液，15℃下，用匀浆器将1.5mL离心管中样品均浆成糊状，取140L制备样品：同步制备已知感染IMNV和已知末感染IMNV的虾样分别作为阳性和阴性对照，然后，用病毒RNA抽提试剂盒抽提病毒RNA（提取步骤参照试剂盒操作手册）。如果无法获得已知阳性样品，用第7章的方法制备RNA阳性对照物用来代替阳性样品抽提的核酸。
7.4RNA样本的保存
制备的RNA样本应尽快进行RT-PCR或real-timeRT-PCR，如果暂时不能进行下一步反应，应该将样本置于一80℃保存备用，保存期不超过1周。8RNA阳性对照物的构建
8.1用RT-PCR从IMNV基因组扩增DNA片段选用如下引物IMVV218F和IMNV682R从阳性样本制备的RNA中用RTPCR方法（RTPCR方法参见9.2）扩增464bp的DNA片段，克隆至pGEM-TEasyVector载体，并转化大肠杆菌EscherichiacoliJM1o9细胞，然后按照质粒抽提试剂盒的方法抽提质粒。8.2RNA阳性对照物的制备
将上一步得到的重组质粒用PstI酶切使之线性化，作为T7RNA聚合酶的转录模板，37℃条件下，1ug质粒在20uL反应体系作用2h（反应体系参见表1）。转录产物然后用DVasel在37℃酶切30min（反应体系参见表2），然后加入2.5ul.0.5mol/LEDTA，混匀，80℃加热处理2min，热处理灭活DNasel，即得到合成的RNA对照物，置于一80C冰箱备用，可以作为后续RTPCR和Real-TimeRTPCR检测方法的阳性参考标准
-TTKAONTKAca
SN/T 3492—2013
表120μL反应体系的转录反应的反应体系组成反应试剂
10XT7RNA聚合酶Buffer
T7RVA聚合酶(10U/μl~-50L/μL)硫苏糖醇DTT（50mmol/L)
NTP混合物（各2.5mmol/L）
RNA酶抑制剂(4CU/uL)
模板DNA（50ng~500ng）
无RNA酸双蒸水
总体积
加样体积
表250μL反应体系的DNaseI酶切反应的反应体系组成反应试剂
10XDNaseIBuffer
DNaseI(无RNA酶，5U/μL)
RVA酶抑制剂(40U/uL)
转录产物（50ng-500ng）模板
无RNA酶双蒸水
总体积
嵌套式RT-PCR检测IMNV的核酉
设立对照
加样体积
20 μL
在7.3中的样品处理过程中应当设立阳性样品对照，阴性样品对照，空白对照。取含有已知含IMNV的病毒组织抽提的核酸或制各的RNA阳性对照物核酸作为阳性对照（参见8.2
取已知未含IMNV的对虾组织抽提核酸作为阴性对照。9.1.4
取等体积的水代替模板作为空白对照。9.2RT-PCR扩增
反应体系
反应体系按总体积50L和反应试剂以一步法试剂盒为例，各试剂浓度比例如表3所示。注：PCR反应体系可选择25μL、50al或100μl.反应体系进行，各组分按比例增加或减少。-rKAoNKAca
表350μuL反应体系的RT-PCR反应所需试剂组成反应试剂
10XOneStepRNAPCRBuffer
MgCl.(25mmol/L)
dNTP混合物（各10mmol/L）
RNA酶抑制剂（40U/μL)
AMVRTaseXL (5U/μl.)
AMV-OptimizedTaq(5U/μL)
4587FPrimer(20μmol/L)
4914RPrimer(20μmol/L)
抽提RNA样本
无RNA酶双蒸水
总体积
反应条件
双链RNA解链：100℃5min;RI
加样体积
SN/T3492—2013
试剂终浓度
5mmol/L
各1mmol/L
0.4μmol/l.
0.4 fuinol/L
min:反转录酶灭活：95℃，2min；PCR反应：95℃，45s，60℃，45s，29个循环；72℃.7min扩增片段长328bp。注：可使用其他等效的一步法或者两步法RT-PCR检测试剂盒，反应体系组分浓度和反应条件可以根据试剂生产商推荐的条件做相应调整。
9.3嵌套式-PCR扩增
反应体系
PCR反应体系可选择25m
OL反应体系进行：各组分按比例增加和减少，反应体系按总体积50uL为例，各试剂浓度比例如表4。表450反应体系的嵌套式-PCR反应所需试剂组成反应试剂
RT-PCR产物
10XPCRBuffer
dNTP混合物（各2.5mmol/L）
MgCl.(25mmol/L)
引物4725NF(20μmol/L）
引物4863NR（20μmol/L)
Tag(5U/μL)
双蒸水
总体积
加样体积
试剂终浓度
0.2mmol/L
0.4μmol/L
0.4 pμmol/1.
KAoNiKAca
SN/T3492—2013
9.3.2反应条件
95℃.2min：95℃，30s，65℃，30s，72℃.30s.39个循环：72℃.7min扩增片段长139bp注：可使用其他等效的PCR检测试剂盒，反应体系组分浓度和反应条件可以做相应调整。9.4琼脂糖电泳
用TAE（见附录A)电冰缓冲液配制1.5%的琼脂糖（含1ug/mLEB）平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6L样品和溴酚蓝指示剂溶液按比例混勾后加入样品孔。在电泳时使用核酸分子量标准参照物作对照，5V/cm电泳约0.5h，当溴酚监到达底部时停止。9.5结果判定
9.5.1在紫外灯下观察核酸带并判断结果。9.5.2第一次PCR产物电泳后，如果阴性对照和空白对照未出现条带，并且阳性对照出现预期大小为328bp扩增条带.待检样品也出现一条约328bp的DNA片段，则判断样品IMNVRT-PCR反应阳性，对获得的序列进行测序分析（参见附录C的C.1），确证IMNV检测阳性。如果待检样品未出现预期大小的扩增条带，则做第二轮嵌套式-PCR。9.5.3第二轮PCR产物电泳后，如果阴性对照和空白对照未出现条带，待检样品如果出现约139bp大小的条带，并且阳性对照出现预期大小为139bp大小的扩增条带，则判断待检样品IMNV嵌套式PCR反应阳性，对获得的序列进行测序分析（参见附录C的C.1），确证IMNV检测阳性。如果待检样品未出现预期人小的扩增条带，则判断IMNV阴性。10Rcal-TimeRT-PCR检测IMNV的核酸10.1在7.3中的样品处理过程中必须设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照，10.1.1取含有已知含IMNV的病毒组织抽提的核酸或制备的RNA阳性对照物核酸作为阳性对照（参见8.2）
10.1.2取已知末含IMNV的对虾组织抽提核酸作为阴性对照。3取等体积的水代替模板作为空白对照。10.1.3
Real-TimeRT-PCR的运行
反应体系
Real-timeRTPCR反应体系可选择10L、25μL或50μL反应体系进行，各组分按比例增加或减少，反应体系按总体积25uL为例，各试剂浓度比例如表5表525μL反应体系的Real-timeRT-PCR反应所需试剂组成反应试剂www.bzxz.net
OneStepRT-PCR缓冲液Ⅲ(2X)
PrineSeript RT enzyme mix IlTaKaRa Ex Taq HS(5 U/μl.)
引物IMNV412F(10μmol/L)
引物IMNV545R(1Cμmol/L)
加样体积
-iiKAorKAca
反应试剂
TagMan探针IMNVpl(10μmol/L)
无RNA酶的双蒸水
RNA模板
总体积
反应条件
表5（续）
SN/T3492—2013
加样体积
双链RNA解链，100℃，5min；48℃反应30min，95℃反应10min；95℃反应15s，600℃反应1min，40个循环，用基因扩增仪GeneAmp75001分析PCR反应结果10.3结果判定
待检样品的Ct值≥38时，则判断IMNV核酸检测阴性10.3.1
10.3.2待检样品的Ct值35时，则判断Real-TimeRT-PCR反应阳性。3待检样品的Ct值介于35和38之间时，应该重新进行检测。如果重新检测Ct值≥38时，则10.3.3
判断Real-TimeRT-PCR反应阴性，直接确证IMNV检测阴性。如果重新检测的Ct值介于35和38之间时，则判断Real-TimeRT-PCR反应阳性。11
结果的综合判定
具有临床症状的虾样品判定为IMN可疑，可疑样品经过RT-PCR或者Real-timeRT-PCR反应为阳性，则可确诊该虾样品为IMN阳性，否则判为IMN阴性。所给的信息是为方便标准使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，可使用这些等效产品。
SN/T3492—2013
A.1TAE电泳缓冲液（50倍储存液）Tris
冰醋酸
溴酚蓝DNA上样液
溴酚蓝
附录A
（规范性附录）
所用试剂及配制
定容至1000ml
定容至100ml
A.3实验所涉及到的引物和探针可由经过验证具有同等检测效果的公司合成，涉及到的限制性内切酶和DNA聚合酶也可购自经过验证具有同等检测效果的公司1样品的病毒核酸抽提试剂盒可购自具有同等效果的商业公司。A.4
附录B
（资料性附录）
传染性肌肉坏死概述
SN/T 3492—2013
传染性肌肉坏死是由传染性肌肉坏死病毒（Infectiousmyonecrosisvirus，IMNV)造成的病毒性疾病，主要宿主是凡纳滨对虾（Penaeusuannamei）、细角滨对虾（Litopenaeusstylirostris）、斑节对虾（Penaeusmonodon）、东南褐虾（Farfantepenaeussubtiltis），均可感染传染性肌肉坏死病毒，环境胁迫行为如捕捞、投食以及水域盐分和温度的突然改变等可造成由传染性肌肉坏死病毒引起的对虾高死亡率，从疫区引进的稚虾、幼虾和成虾易，严重染病的虾遇到外界胁迫攻击前可以不断进食直至消化道满食。发病虾的临床症状表现为：停食，反应迟钝，聚集在池塘的角落体色发白：病虾腹节发红，尾部肌肉组织呈点状或扩散的坏死，开始在腹节末梢和尾扇，移去腹节的表皮，感染处可见白色或不透明的白色组织，严重感染的虾不断死亡，这种死亡状态可以维持数天。虽然传染性肌肉坏死病毒可以感染对虾的所有生活阶段，但是卵和幼虫期病毒量较低，这些阶段不适合取样检测，最适合的取样时机是后期幼体和成虫期。传染性肌肉坏死病毒主要感染中胚层起源的组织，在急性感染期，感染对虾条纹肌、结缔组织和血细胞。在慢性感染期，淋巴器官是主要的靶器管，因此，血细胞或者腹肢可以作为取样器官。传染性肌肉坏死病毒属整体病毒科（Totiviridae的成员，病毒颗粒是二十面体，直径4Cnm，病毒是一种无囊膜双链RNA病毒，基因组长度7560bP，包括2个开放阅读框（ORF1、ORF2）其中ORF1编码一个RNA结合蛋白和一个衣壳蛋白，ORF2编码一个由736个氨基酸组成的依赖于RNA的无论RT-PCR还是Real-timeRT-PCR方法，OIERNA聚合酶（RNAdependentRNA-polymerasS
推荐引物位置均在ORFI基因上（GenBankID：AY570982），PCR扩增反应具有很高的特异性。SN/T3492—2013
嵌套式-PCR引物位置
附录C
（资料性附录）
ACTCGACGCT GCTAACCATA CAAAACCTTT TGCTATTGAA GGAGGAAGAC TCGTATATTT4587F
GGGTGGAACA ATTGCAAATA CAACCAATGT GGTAAACGCA ATGCAGAGGA AACAAAGGCTTTCAAAACCGGCATTCAAGTGGGCACATGCTCAGAGACAACGTGTATATGACAGCAGTCG
1725NF
TCCAGGGATG GACGCAATCA CAAAGTTGTG TGCACGAAAG TCGGGTTTTA TGAAIGCCCGTTCCACAGCA ATGATGGCAC CCAAGACTGG ACTCAGCGCTGTTATAGATCAAGCACCAAA4863NR
TACATCTCAA GACTTGATCG AACAGCCGAG TCAGCAAGAG4914R
Real-timeRT-PCR引物位置
GGACCTATCA
IMNV412F
TGCATTTGCAAGAACTGGTTCAGTATGGACACCTGCCACCTACATAGCGT
ATCCCCGGGT AGACTGCAAG TACAAATGTC ATCCAGCGACTTTACTTTCAATACTACATC
IMNV545R
AATAGATATGGGTT
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传染性肌肉坏死检疫技术规范
Quarantine protocol for infectious myonecrosis2013-03-01发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-09-16实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T3492—2013
本标准参考了OIE《水生动物疾病诊断手册（2011年版）》第2.2.3章，选取OTE手册中临床诊断内容和分子诊断中关于反转录-聚合酶链式反应和实时荧光定量反转录-聚合酶链式反应检测方法的内容。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国海南出人境检验检疫局、中华人民共和国湖南出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、本标准主要起草人：兰文升、郑晓聪、史秀杰、黄继徽、唐连飞、贾鹏、王津津、叶奕优、主红英。1
1范围
传染性肌肉坏死检疫技术规范
SN/T3492—2013
本标准规定了传染性肌肉坏死病毒（InfectiousmyonecrosisvirusIMNV）的反转录-聚合酶链式反应和实时荧光定量反转录-聚合酶链式反应的检测方法。本标准适用于具有临床症状的传染性肌肉坏死(Infectiousmyonecrosis，IMN)的检疫和诊断。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫来样
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
反转录-聚合酶链式反应reversetransseription polymerasechain reaction;RT-PCRRNA在逆转录酶的作用下，在适宜反应条件下，被逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行聚合酶链式反应。
实时荧光定量反转录-聚合酶链式反应在常规RT-PCR的基础上，加人
PCR反应中的荧光信号，每扩增
形成完全同步。
Ct值cycle threshold
RT-PCR
real-time
异性的荧光探针
，荧光PCR仪器的监测系统可以接收到一条DNA链，就有一
个荧光分子形成，使荧光信号的累积与PCR产物Real-timeRT-PCR每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。主要试剂和材料
除特别说明外，本标准仅使用确认为分析纯的试剂。4.2
水：应符合GB/T6682中一级水的规定。4.3Tag酶：-20℃保存。
4.4反转录酶：-20℃保存。
4.5RNase抑制剂：20℃保存。
4.6T7RNA聚合酶：一20℃保存。4.7DNasel:-20℃保存。
SN/T3492—2013
4.8pGEM-TEasyVector：-20C保存。4.9Pstl限制性内切酶：-20℃保存。4.10NTP：含CTP.GTP、ATP、TTP各2.5mmol/L的混合物，一20℃保存。dVTP：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L的混合物，一20C保存4.11
浓度为20umol/L，一20℃保存，其序列如下：正义引物（IMNV218F)：5'-GCTGGACTGTATTGGTTGAG-3；反义引物(IMNV682R):5-AACCAAGTTCTTCTTCTCCAGTT-3正义引物（4587F)：5'-CGACGCTGCTAACCATACAA-3'；反义引物(4914R)：5-ACTCGGCTGTTCGATCAAGT-3；正义引物(4725NF):5*-GGCACATGCTCAGAGACA-3°；反义引物（4863NR)：5'-AGCGCTGAGTCCAGTCTTG-3；正义引物(IMNV412F).5'-GGACCTATCATACATAGCGTTTGCA-3；反义引物（IMNV545R)：5-AACCCATATCTATTGTCGCTGGAT-3；探针（IMNVp1)：
5'-6FAM CCA CCT TTACTT TCA ATA CTA CAT CAT CCC CGG-TAMRA-3';引物用无RNA酶的去离子水配制成100(mol/L的储备液，在使用过程中根据需要配制不同工作浓度。
病毒RNA抽提试剂盒或其他抽提RNA的等效产品。澳化乙锭（EB）。
溴酚蓝DNA上样液（见附录A)。
TAE电泳缓冲液（见附录A）。
核酸分子量标准参照物
器材和设备
PCR扩增仪。
实时荧光定量PCR仪器（7500RealTimePCRSystem或其他等效设备）。电泳仪(OV~3V)和水平电泳槽。
微量移液器和微量移液器吸头。凝胶成像仪。
恒温培养箱。
普通冰箱和低温冰箱。
匀浆器。
台式高速离心机和离心管
制冰机。
电泳仪。
临床症状的诊断
行为变化
出现环境胁迫时，严重感染的虾表现为游动缓慢，持续进食；将虾体解剖，发现此时病虾的胃肠一般2
-iiKAoNiKAca
充满食物。
6.2发病症状
SN/T3492—2013
急性发病期虾样的骨骼肌呈现点状或者片状坏死区域，尤其是尾部腹节和尾肢，病灶区肌肉发白及不透明症状。显微镜观察，肌肉组织出现浮肿和淋巴器官中血细胞纤维化，在坏死的肌纤维和纤维化的血细胞之间有液体堆积，并常伴有深色包涵体7取样和样品处理
7.1样品的运输与保存
按照GB/T18088采样，样品至少应在4℃以下的环境中运输，实验室接收样品后应该尽快检测，如果暂时不能检测，应该将样品置于一80℃冰箱中保存。7.2取样
样品尽可能取后期幼体和成虫期虾样，取样器官是对虾条纹肌、结缔组织或血细胞（参见附录B）：可以把不超过5头的样本混合做混样。取每只虾的肌肉组织20tmg~50mg，合计100mg~250mg样品，研磨均匀待用。
7.3制样
将取好样品混合均勾后，再取20mg～50mg加人适量RNA抽提试剂盒中的裂解液，15℃下，用匀浆器将1.5mL离心管中样品均浆成糊状，取140L制备样品：同步制备已知感染IMNV和已知末感染IMNV的虾样分别作为阳性和阴性对照，然后，用病毒RNA抽提试剂盒抽提病毒RNA（提取步骤参照试剂盒操作手册）。如果无法获得已知阳性样品，用第7章的方法制备RNA阳性对照物用来代替阳性样品抽提的核酸。
7.4RNA样本的保存
制备的RNA样本应尽快进行RT-PCR或real-timeRT-PCR，如果暂时不能进行下一步反应，应该将样本置于一80℃保存备用，保存期不超过1周。8RNA阳性对照物的构建
8.1用RT-PCR从IMNV基因组扩增DNA片段选用如下引物IMVV218F和IMNV682R从阳性样本制备的RNA中用RTPCR方法（RTPCR方法参见9.2）扩增464bp的DNA片段，克隆至pGEM-TEasyVector载体，并转化大肠杆菌EscherichiacoliJM1o9细胞，然后按照质粒抽提试剂盒的方法抽提质粒。8.2RNA阳性对照物的制备
将上一步得到的重组质粒用PstI酶切使之线性化，作为T7RNA聚合酶的转录模板，37℃条件下，1ug质粒在20uL反应体系作用2h（反应体系参见表1）。转录产物然后用DVasel在37℃酶切30min（反应体系参见表2），然后加入2.5ul.0.5mol/LEDTA，混匀，80℃加热处理2min，热处理灭活DNasel，即得到合成的RNA对照物，置于一80C冰箱备用，可以作为后续RTPCR和Real-TimeRTPCR检测方法的阳性参考标准
-TTKAONTKAca
SN/T 3492—2013
表120μL反应体系的转录反应的反应体系组成反应试剂
10XT7RNA聚合酶Buffer
T7RVA聚合酶(10U/μl~-50L/μL)硫苏糖醇DTT（50mmol/L)
NTP混合物（各2.5mmol/L）
RNA酶抑制剂(4CU/uL)
模板DNA（50ng~500ng）
无RNA酸双蒸水
总体积
加样体积
表250μL反应体系的DNaseI酶切反应的反应体系组成反应试剂
10XDNaseIBuffer
DNaseI(无RNA酶，5U/μL)
RVA酶抑制剂(40U/uL)
转录产物（50ng-500ng）模板
无RNA酶双蒸水
总体积
嵌套式RT-PCR检测IMNV的核酉
设立对照
加样体积
20 μL
在7.3中的样品处理过程中应当设立阳性样品对照，阴性样品对照，空白对照。取含有已知含IMNV的病毒组织抽提的核酸或制各的RNA阳性对照物核酸作为阳性对照（参见8.2
取已知未含IMNV的对虾组织抽提核酸作为阴性对照。9.1.4
取等体积的水代替模板作为空白对照。9.2RT-PCR扩增
反应体系
反应体系按总体积50L和反应试剂以一步法试剂盒为例，各试剂浓度比例如表3所示。注：PCR反应体系可选择25μL、50al或100μl.反应体系进行，各组分按比例增加或减少。-rKAoNKAca
表350μuL反应体系的RT-PCR反应所需试剂组成反应试剂
10XOneStepRNAPCRBuffer
MgCl.(25mmol/L)
dNTP混合物（各10mmol/L）
RNA酶抑制剂（40U/μL)
AMVRTaseXL (5U/μl.)
AMV-OptimizedTaq(5U/μL)
4587FPrimer(20μmol/L)
4914RPrimer(20μmol/L)
抽提RNA样本
无RNA酶双蒸水
总体积
反应条件
双链RNA解链：100℃5min;RI
加样体积
SN/T3492—2013
试剂终浓度
5mmol/L
各1mmol/L
0.4μmol/l.
0.4 fuinol/L
min:反转录酶灭活：95℃，2min；PCR反应：95℃，45s，60℃，45s，29个循环；72℃.7min扩增片段长328bp。注：可使用其他等效的一步法或者两步法RT-PCR检测试剂盒，反应体系组分浓度和反应条件可以根据试剂生产商推荐的条件做相应调整。
9.3嵌套式-PCR扩增
反应体系
PCR反应体系可选择25m
OL反应体系进行：各组分按比例增加和减少，反应体系按总体积50uL为例，各试剂浓度比例如表4。表450反应体系的嵌套式-PCR反应所需试剂组成反应试剂
RT-PCR产物
10XPCRBuffer
dNTP混合物（各2.5mmol/L）
MgCl.(25mmol/L)
引物4725NF(20μmol/L）
引物4863NR（20μmol/L)
Tag(5U/μL)
双蒸水
总体积
加样体积
试剂终浓度
0.2mmol/L
0.4μmol/L
0.4 pμmol/1.
KAoNiKAca
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9.3.2反应条件
95℃.2min：95℃，30s，65℃，30s，72℃.30s.39个循环：72℃.7min扩增片段长139bp注：可使用其他等效的PCR检测试剂盒，反应体系组分浓度和反应条件可以做相应调整。9.4琼脂糖电泳
用TAE（见附录A)电冰缓冲液配制1.5%的琼脂糖（含1ug/mLEB）平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6L样品和溴酚蓝指示剂溶液按比例混勾后加入样品孔。在电泳时使用核酸分子量标准参照物作对照，5V/cm电泳约0.5h，当溴酚监到达底部时停止。9.5结果判定
9.5.1在紫外灯下观察核酸带并判断结果。9.5.2第一次PCR产物电泳后，如果阴性对照和空白对照未出现条带，并且阳性对照出现预期大小为328bp扩增条带.待检样品也出现一条约328bp的DNA片段，则判断样品IMNVRT-PCR反应阳性，对获得的序列进行测序分析（参见附录C的C.1），确证IMNV检测阳性。如果待检样品未出现预期大小的扩增条带，则做第二轮嵌套式-PCR。9.5.3第二轮PCR产物电泳后，如果阴性对照和空白对照未出现条带，待检样品如果出现约139bp大小的条带，并且阳性对照出现预期大小为139bp大小的扩增条带，则判断待检样品IMNV嵌套式PCR反应阳性，对获得的序列进行测序分析（参见附录C的C.1），确证IMNV检测阳性。如果待检样品未出现预期人小的扩增条带，则判断IMNV阴性。10Rcal-TimeRT-PCR检测IMNV的核酸10.1在7.3中的样品处理过程中必须设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照，10.1.1取含有已知含IMNV的病毒组织抽提的核酸或制备的RNA阳性对照物核酸作为阳性对照（参见8.2）
10.1.2取已知末含IMNV的对虾组织抽提核酸作为阴性对照。3取等体积的水代替模板作为空白对照。10.1.3
Real-TimeRT-PCR的运行
反应体系
Real-timeRTPCR反应体系可选择10L、25μL或50μL反应体系进行，各组分按比例增加或减少，反应体系按总体积25uL为例，各试剂浓度比例如表5表525μL反应体系的Real-timeRT-PCR反应所需试剂组成反应试剂www.bzxz.net
OneStepRT-PCR缓冲液Ⅲ(2X)
PrineSeript RT enzyme mix IlTaKaRa Ex Taq HS(5 U/μl.)
引物IMNV412F(10μmol/L)
引物IMNV545R(1Cμmol/L)
加样体积
-iiKAorKAca
反应试剂
TagMan探针IMNVpl(10μmol/L)
无RNA酶的双蒸水
RNA模板
总体积
反应条件
表5（续）
SN/T3492—2013
加样体积
双链RNA解链，100℃，5min；48℃反应30min，95℃反应10min；95℃反应15s，600℃反应1min，40个循环，用基因扩增仪GeneAmp75001分析PCR反应结果10.3结果判定
待检样品的Ct值≥38时，则判断IMNV核酸检测阴性10.3.1
10.3.2待检样品的Ct值35时，则判断Real-TimeRT-PCR反应阳性。3待检样品的Ct值介于35和38之间时，应该重新进行检测。如果重新检测Ct值≥38时，则10.3.3
判断Real-TimeRT-PCR反应阴性，直接确证IMNV检测阴性。如果重新检测的Ct值介于35和38之间时，则判断Real-TimeRT-PCR反应阳性。11
结果的综合判定
具有临床症状的虾样品判定为IMN可疑，可疑样品经过RT-PCR或者Real-timeRT-PCR反应为阳性，则可确诊该虾样品为IMN阳性，否则判为IMN阴性。所给的信息是为方便标准使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，可使用这些等效产品。
SN/T3492—2013
A.1TAE电泳缓冲液（50倍储存液）Tris
冰醋酸
溴酚蓝DNA上样液
溴酚蓝
附录A
（规范性附录）
所用试剂及配制
定容至1000ml
定容至100ml
A.3实验所涉及到的引物和探针可由经过验证具有同等检测效果的公司合成，涉及到的限制性内切酶和DNA聚合酶也可购自经过验证具有同等检测效果的公司1样品的病毒核酸抽提试剂盒可购自具有同等效果的商业公司。A.4
附录B
（资料性附录）
传染性肌肉坏死概述
SN/T 3492—2013
传染性肌肉坏死是由传染性肌肉坏死病毒（Infectiousmyonecrosisvirus，IMNV)造成的病毒性疾病，主要宿主是凡纳滨对虾（Penaeusuannamei）、细角滨对虾（Litopenaeusstylirostris）、斑节对虾（Penaeusmonodon）、东南褐虾（Farfantepenaeussubtiltis），均可感染传染性肌肉坏死病毒，环境胁迫行为如捕捞、投食以及水域盐分和温度的突然改变等可造成由传染性肌肉坏死病毒引起的对虾高死亡率，从疫区引进的稚虾、幼虾和成虾易，严重染病的虾遇到外界胁迫攻击前可以不断进食直至消化道满食。发病虾的临床症状表现为：停食，反应迟钝，聚集在池塘的角落体色发白：病虾腹节发红，尾部肌肉组织呈点状或扩散的坏死，开始在腹节末梢和尾扇，移去腹节的表皮，感染处可见白色或不透明的白色组织，严重感染的虾不断死亡，这种死亡状态可以维持数天。虽然传染性肌肉坏死病毒可以感染对虾的所有生活阶段，但是卵和幼虫期病毒量较低，这些阶段不适合取样检测，最适合的取样时机是后期幼体和成虫期。传染性肌肉坏死病毒主要感染中胚层起源的组织，在急性感染期，感染对虾条纹肌、结缔组织和血细胞。在慢性感染期，淋巴器官是主要的靶器管，因此，血细胞或者腹肢可以作为取样器官。传染性肌肉坏死病毒属整体病毒科（Totiviridae的成员，病毒颗粒是二十面体，直径4Cnm，病毒是一种无囊膜双链RNA病毒，基因组长度7560bP，包括2个开放阅读框（ORF1、ORF2）其中ORF1编码一个RNA结合蛋白和一个衣壳蛋白，ORF2编码一个由736个氨基酸组成的依赖于RNA的无论RT-PCR还是Real-timeRT-PCR方法，OIERNA聚合酶（RNAdependentRNA-polymerasS
推荐引物位置均在ORFI基因上（GenBankID：AY570982），PCR扩增反应具有很高的特异性。SN/T3492—2013
嵌套式-PCR引物位置
附录C
（资料性附录）
ACTCGACGCT GCTAACCATA CAAAACCTTT TGCTATTGAA GGAGGAAGAC TCGTATATTT4587F
GGGTGGAACA ATTGCAAATA CAACCAATGT GGTAAACGCA ATGCAGAGGA AACAAAGGCTTTCAAAACCGGCATTCAAGTGGGCACATGCTCAGAGACAACGTGTATATGACAGCAGTCG
1725NF
TCCAGGGATG GACGCAATCA CAAAGTTGTG TGCACGAAAG TCGGGTTTTA TGAAIGCCCGTTCCACAGCA ATGATGGCAC CCAAGACTGG ACTCAGCGCTGTTATAGATCAAGCACCAAA4863NR
TACATCTCAA GACTTGATCG AACAGCCGAG TCAGCAAGAG4914R
Real-timeRT-PCR引物位置
GGACCTATCA
IMNV412F
TGCATTTGCAAGAACTGGTTCAGTATGGACACCTGCCACCTACATAGCGT
ATCCCCGGGT AGACTGCAAG TACAAATGTC ATCCAGCGACTTTACTTTCAATACTACATC
IMNV545R
AATAGATATGGGTT
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