SN/T 3485-2013
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标准简介
SN/T 3485-2013.Quarantine protocol for bovine babesiosis and theileriosis.
1范围
SN/T 3485规定了牛焦虫血虫体检查、聚合酶链式反应(PCR)、间接荧光抗体试验和补体结合试验等实验室检疫技术。
SN/T 3485适用于进出境牛焦虫病的诊断与检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是往日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
SN/T 1678梨形 虫病病原鉴定方法
SN/T2685泰勒氏焦虫检疫规范
3疾病概述
焦虫病是由焦虫纲焦虫目的原虫所引起的家畜各种疾病的总称。牛焦虫病主要包括牛巴贝斯虫病和泰勒氏焦虫病,牛巴贝斯虫病参见附录A,泰勒氏焦虫病参见附录B。
4诊断技术
4.1 病原学检查
4.1.1 血虫体检查
4.1.1.1 样品采集
4.1.1.1.1血液样品
无菌采集耳尖或尾尖采血样,也可颈静脉无菌采集用EDTA(1 mg/mL)作抗凝剂的抗凝血,4 °C保存。
4.1.1.1.2 组织标本
无菌穿刺,采集待检动物肩前淋巴结或腹股沟淋巴结组织、肝脏或脾脏制成组织涂片。
4.1.1.1.2组织标本
无菌穿刺，采集待检动物肩前淋巴结或腹股沟淋巴结组织、肝脏或脾脏制成组织涂片。
4.1.1.1.3 动物尸体
死亡动物应在其死亡后24 h内完成采样工作。病死牛样品除做血涂片外,还可采取大脑皮层、肾、肝、肺和骨髓等组织做涂片进行检查。
1范围
SN/T 3485规定了牛焦虫血虫体检查、聚合酶链式反应(PCR)、间接荧光抗体试验和补体结合试验等实验室检疫技术。
SN/T 3485适用于进出境牛焦虫病的诊断与检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是往日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
SN/T 1678梨形 虫病病原鉴定方法
SN/T2685泰勒氏焦虫检疫规范
3疾病概述
焦虫病是由焦虫纲焦虫目的原虫所引起的家畜各种疾病的总称。牛焦虫病主要包括牛巴贝斯虫病和泰勒氏焦虫病,牛巴贝斯虫病参见附录A,泰勒氏焦虫病参见附录B。
4诊断技术
4.1 病原学检查
4.1.1 血虫体检查
4.1.1.1 样品采集
4.1.1.1.1血液样品
无菌采集耳尖或尾尖采血样,也可颈静脉无菌采集用EDTA(1 mg/mL)作抗凝剂的抗凝血,4 °C保存。
4.1.1.1.2 组织标本
无菌穿刺,采集待检动物肩前淋巴结或腹股沟淋巴结组织、肝脏或脾脏制成组织涂片。
4.1.1.1.2组织标本
无菌穿刺，采集待检动物肩前淋巴结或腹股沟淋巴结组织、肝脏或脾脏制成组织涂片。
4.1.1.1.3 动物尸体
死亡动物应在其死亡后24 h内完成采样工作。病死牛样品除做血涂片外,还可采取大脑皮层、肾、肝、肺和骨髓等组织做涂片进行检查。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3485—2013
牛焦虫病检疫技术规范
Quarantine protocol for bovine babesiosis and theileriosis2013-03-01发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-09-16实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。SN/T3485—2013
本标准参考了OIE发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2010年版）中2.4.2牛巴贝斯虫病的血虫体检查、聚合酶链式反应（PCR）、间接免疫荧光试验与微量补体结合试验，并细化了血虫体检查的结果判定、PCR方法的实验操作与结果判定及补体结合试验的预备试验等内容。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、中华人民共和国宁夏出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准的主要起草人：石建平、孟日增、郝俊虎、宋战昀、孟庆峰、刘阳、鱼海琼、刘金华、王伟利。1范围
牛焦虫病检疫技术规范
SN/T34852013
本标准规定了牛焦虫血虫体检查、聚合酶链式反应（PCR）、间接荧光抗体试验和补体结合试验等实验室检疫技术。
本标准适用于进出境牛焦虫病的诊断与检疫。2
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法梨形虫病病原鉴定方法
SN/T1678
SN/T2685
3疾病概述
泰勒氏焦虫检疫规范
焦虫病是由焦虫纲焦虫目的原虫所引起的家备各种疾病的思称。牛焦虫病主要包括牛巴贝斯虫病和泰勒氏焦虫病，牛巴贝斯虫病参见附录A，泰勒氏焦出病参见附录B。4诊断技术
4.1病原学检查
4.1.1血虫体检查
4.1.1.1样品采集
4. 1. 1. 1. 1
血液样品
无菌采集耳尖或尾尖采血样，也可颈静脉无菌采集用EDTA（1mg/mL）作抗凝剂的抗凝血，4℃保存。
4.1.1.1.2组织标本
无菌穿刺，采集待检动物肩前淋巴结或腹股沟淋巴结组织、肝脏或脾脏制成组织涂片。4.1.1.1.3动物户体
死亡动物应在其死亡后24h内完成采样工作。病死牛样品除做血涂片外，还可采取大脑皮层，肾、肝、肺和骨髓等组织做涂片进行检查。4.1.1.2血涂片的制备
用洁净的载玻片端边缘蘸一小滴血，再用另一端边缘光滑的载玻片做推片，将推片的一端置于血滴SN/T3485—2013
之前，待血液沿推片端缘扩散后，均勾推成薄血膜，也可取一小滴血液（约501.)滴在干净的载玻片上，自然风干形成厚血片。
4.1.1.3组织涂片的制备
脏器涂片的制作可用一块洁净的载玻片轻触脏器的新鲜切面或以两块洁净的玻片轻夹一小块组织，沿玻片的纵向推压，使两玻片上都留下一层组织，涂片风干后，无水甲醇固定5min，再用10%姬姆萨（配制参见附录C的C.1)染色20min~30min。4.1.1.4血涂片或组织涂片的染色涂片待其自然风干后，无水甲醇固定1min，10%姬姆萨染色20min～30min；厚血片与组织涂片风干后80烘箱固定5min，10%姬姆萨染色15min~20min。4.1.1.5病原鉴定
按SN/T1678中规定的方法进行实验和结果判定。4.1.2牛巴贝斯焦虫聚合酶链式反应4.1.2.1试剂与材料
4.1.2.1.1牛巴贝斯焦虫参考虫株：由指定单位提供。4.1.2.1.2rTag酶：5U/μL，保存于一20℃避免反复冻融或温度剧烈变化，随用随取。4.1.2.1.310倍PCR缓冲液：含50mmol/LKCl,10mmol/LTrisHCl(pH8.5),2.5mmol/LMgCl2，0.001%明胶
4.1.2.1.410mmol/LdNTP混合液：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP4种脱氧核苷酸。4.1.2.1.5蛋白酶K：浓度为10mg/mL。4.1.2.1.6引物
本试验选用SSrRNA基因序列作为PCR扩增区，设计两条引物P1，P2，引物位置和序列如下：P1428-457)5-TTGGCATGGGGGCGACCTTCACCCTCGCCC-3P2(699~-670)5-CCAAAGTCAACCAACGGTACGACAGGGTCA3P1、P2引物扩增片段为272bp。
4.1.2.2其他试剂
实验用水按GB/T6682中规定准备，Tris碱、EDTA，SDS、苯酚、NaCI、HCI、乙醚和乙醇等均为市售分析纯。
4.1.2.3器材和设备
PCR扩增仪、电泳仪、微量移液器及吸头、凝胶成像分析仪、恒温培养箱、普通冰箱、低温冰箱、组织匀浆器或研磨器、灭菌离心管、离心机等。4.1.2.4操作方法
4.1.2.4.1样品采集与处理
4.1.2.4.1.1样品采集
取发病或可疑动物外周EDTA抗凝血20mL。2
KANiKAca
4.1.2.4.1.2样品处理
SN/T3485—2013
血液样品需离心取沉淀以去掉血浆蛋白，再用0.01mol/LpHI7.2的PBS充分洗涤、离心，血球泥大约2mL，快速冻融3次，虫体与细胞碎片用TE缓冲液洗涤两次，于12000r/min离心5min，收集沉淀备用。
4.1.2.4.2对照样品制备
4.1.2.4.2.1阳性样品：经培养增殖的参考虫体。4.1.2.4.2.2阴性样品：无虫体感染的正常牛红细胞。4.1.2.4.3基因组DNA抽提
4.1.2.4.3.1新鲜抗凝血，离心弃去清液。4.1.2.4.3.2取出4℃冰箱预冷的红细胞裂解液（ELS）.按1：6~1：10的比例向细胞沉淀中加人ELS裂解液（配制见C.2)(1mL细胞压积加人6mL~10mL裂解液），轻轻吹打混匀。4.1.2.4.3.31500r/min离心5min~8min，离心弃去上层红色清液。4.1.2.4.3.4红细胞裂解完全后收集沉淀部分，加入0.5mLTE离心，若裂解不完全可重复步骤4.1.2.4.3.2和4.1.2.4.3.3。
4.1.2.4.3.5加20%SDS.蛋白酶K（10mg/mL)至终浓度100μg/mL，用一玻璃棒温和地将酶混人黏滞的细胞裂解液中。
4.1.2.4.3.6将细胞裂解液置于60℃水浴3h不时旋转黏滞溶液。4.1.2.4.3.7将溶液冷却至室温，加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和颠转混匀3min。4.1.2.4.3.8空温6000r/min离心15min，取上层水相到另一1.5mL离心管中。4.1.2.4.3.9加等体积饱和酚，混勾，6000r/min离心15min，取上层水相到另一离心管中。4.1.2.4.3.10加等体积酚/三氯甲烷，轻轻混匀，6000r/min离心15min，取上层水相到另一离心管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。加等体积三氯甲烷，轻轻混匀，6000r/min离心15min，吸取上层水相到另离心4.1.2.4.3. 11
管中。
4.1.2.4.3.12
4.1.2.4.3.13
4.1.2.4.3.14
加1/10体积的3mol/L醋酸钠（pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。待絮状物出现后，6000r/min离心15min，弃上清液。沉淀用75%乙醇洗涤，12000r/min离心15min，弃上清液5室温下挥发或瞬时离心吸弃乙醇后，按0.1mL细胞加入1mL的比例加入TE缓冲4.1.2.4.3.15
液。将其置于摇床平台上，4C温和振荡过夜，直至DNA完全溶解，储存备用。也可用等效的商品化DNA提取试剂盒制备DNA样品，操作按说明书进行。4.1.2.4.4PCR扩增DNA
4.1.2.4.4.1PCR反应系统
PCR反应液组分见表1。
KANiKAca
SN/T3485-—2013
10×浓缩缓冲液
引物P1(10umol/L)
引物P2(10μmol/L）
rTaq酶(5U/uL)
DNA模板
总体积为50uL，瞬时离心。
4. 1.2.4.4.2
PCR反应程序
95℃，10min预变性；92℃,1
产物4℃保存。
表1PCR反应液组分
4.1.2.4.4.3PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳用量
in72℃，3min；35个循环，72℃保温10min；扩增用新鲜的1XTBE电泳缓冲液配制1.5%琼脂糖凝胶（EB浓度1ug/nL）并制板。将琼脂糖凝胶板水平放入电泳槽，使1×TBE电泳缓冲液刚好没过胶面。将5uL.PCR产物和1L上样缓冲液（6×LoadingBuffer）混勾后加入样晶孔30min，当溴酚蓝接近底部时终止电泳同时加人DNA标准分子量对照品（DL2000），5V/cm电泳紫外灯下观察核酸带并判断结果，或用凝胶成像分析仪分析结果4.1.2.5结果判定标准
4.1.2.5.1
成立。
阳性对照只出现
阴性对照和空白对照没有核酸条带，试验的DNA条带
若待检样品经电泳出现药272bp的DNA条带可判为阳性：若待检样品扩增经电泳未出现4.1.2.5.2
DNA条带，或者出现的条带不是272bp判为阴性，出现其4.2血清学检测
牛巴贝斯焦虫间接免疫荧光试验（IFA）4.2.1
4.2.1.1血涂片的制备
帮，应判为非特异性扩增，应重做试验，采领静脉血制备血涂片。采血时加入适当的抗凝剂（柠檬酸钠或EDTA），用5倍～10倍体积PBS至少洗涤3次，除去血浆蛋白与免疫球蛋白。洗涤后，将感染红细胞重悬于2倍体积PBS中，加人1%牛血清白蛋白（BSA）。取一滴血液滴在干净的玻片上，或采用手工推片法制成均勾的单层血涂片或将其置于细胞离心机旋转制得血涂片。血涂片自然风干后，80℃烘箱固定5tmin，用铝箔或棕色胶带纸密封，置于一70℃保存备用（最多可保存5年）。4.2.1.2血涂片区格划分与感作
用油性笔将抗原涂片划成8~10个疏水小区，并在每小格内加上块滤纸垫。用移液器在每小格4
-TTKAONIKAca
SN/T3485—2013
内滤纸垫上加人5uL～10μL稀释的阳性血清，将玻片放入湿盒内置37℃感作30min。在每张玻片上设弱阳性血清，阴性血清对照。4.2.1.3血涂片的洗涤和染色
孵育后，轻轻地用PBS将玻片上的滤纸垫冲掉，再用PBS和水先后浸泡10min，每次浸泡时均使用磁力搅拌器使PBS和水处于流动状态。在每小格内加入用异硫氰酸荧光素标记的抗牛IgG抗体。每批新结合物都应标定，其工作浓度通常为（1：400）～（1：1200）.加二抗的玻片置于室温孵育30min。4.2.1.4血涂片的洗涤和封固
孵育后，用PBS洗玻片1次，再用PBS和水依次各浸洗一次，每次lomin。
在湿片上滴加1：1甘油和PBS.盖玻片封片，置于标准的荧光显微镜下检查。4.2.1.5结果判定
结果判定如下：免费标准bzxz.net
a）（-)无荧光：
h）（土)极弱的可疑荧光；
c）（十）荧光较弱，但清楚可见：（十十）荧光明亮：
e）（+++或++++)荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“+”以上，而各种对照均成立，即可判定为阳性。4.2.2牛泰勒焦虫间接免疫荧光试见SN/T2685。
4.2.3微量补体结合试验
4.2.3.1标准试剂
4.2.3.1.1抗原：按附录C中方法自行制备，或由指定单位提供4.2.3.1.2溶血素：效价大于1：10004.2.3.1.3补体：取3只豚鼠新鲜血清混合而成，或由指定单位提供。4.2.3.1.41%绵羊红细胞：无菌采集健康绵羊肝素抗凝全血，加人2.5倍的阿氏液，可于4℃保存1个月。用时取适量红细胞悬液加5~10倍生理盐水，充分混勾，以2000r/min离心15min，上清和白细胞层，再加5～10倍生理盐水悬浮红细胞，充分混匀，以2000r/min离心15min，如此洗涤3次。最后将红细胞合并于一管以2500r/min水平转子离心15min，沉淀的红细胞用生理盐水配成1%悬液。
5对照血清：标准阳性血清与标准阴性血清均由指定单位提供。4.2.3.1.5
4.2.3.2材料与设备
96孔U型微量板、水浴锅、离心机和可调加样器等。4.2.3.3样品
被检血清：常规方法采集样品，分离血清2℃8℃冷藏或一20℃长期保存，4.2.3.3.1
-TrKAoNKAca
SN/T3485—2013
4.2.3.3.2灭活处理：使用前，将阳性血清、阴性血清、待检血清置58℃（土2℃）水浴30min灭活，用巴比要缓冲液按1：5~~1：320稀释。4.2.3.4预备试验
4.2.3.4.1溶血素效价的测定
4.2.3.4.1.1
先将溶血素稀释成1：500、1：600,1：700。4.2.3.4.1.2
4.2.3.4.1.3
4.2.3.4.1,4
稀释液/μul.
补体（1：50）
致敏红细胞
再将1：500、1：600、1：7003个滴度进行倍比稀释，使每个滴度孔中含有25L。加人等量的1%绵羊红细胞25αL，于37℃水浴30min.制备成致敏红细胞。将补体原液进行1：50稀释，根据表2按量滴加于96孔U型板中。表2溶血素效价测定
4.2.3.4.1.5
4.2.3. 4. 1. 6
1:10001:12001:1400
1:20001:240012800|1:40001:48001:800037℃振荡30min
将4.2.3.4.1.3中制备的致敏红细胞按表2中指示加人各孔。确定100%溶血时溶血素的最高稀释倍数为其效价；正式试验时使用2个单位溶血素制备致敏红细胞。
4.2.3.4.2
补体效价的测定
4.2.3.4.2.1，致敏红细胞悬液配制绵羊红细胞吸附了溶血素后即成为致敏红细胞，本标准配制方法是，取等量的1%绵羊红细胞加2单位溶血素，混合后置37℃水浴箱内感作30min。4℃保存，2d内可用。4.2.3.4.2.2补体的配制：取几瓶冻干补体用蒸馏水溶解，或几只豚鼠血清混合。用稀释液作1：50稀释。
4.2.3.4.2.3取96孔板加人不同体积的补体（1：50），然后用稀释液补加至75uL，如表3所示。表3补体效价测定
补体（1：50)/uL
稀释液/mL
致敏红细胞/μuL
溶血度/%
4.2.3.4.2.4置37℃水浴感作30min10
4.2.3.4.2.5每孔均加人致敏红细胞50L置37℃水浴感作30min，
4.2.3.4.2.6
37℃水浴感作30min
-TTKAONTKAca
SN/T3485—2013
4.2.3.4.2.7判定结果，能使标准量红细胞全部溶血的最小补体量为100%溶血（CH100)单位。能使50%红细胞溶血的补体量称为50%溶血（CH50）单位。将96孔U型板置500g离心5min，置酶标仪535nm处测定OD值，与标准比色孔进行比较，确定50%红细胞溶血的补体最高稀释倍数，即该反应体系下的1个补体标准单位。5单位的补体为工作效价。4.2.3.4.3抗原效价测定
分别将灭活的标准阳性血清、标准阴性血清按1：5～1：320稀释，每孔滴加25uL。4.2.3.4.3.1
2阴性对照血清不做稀释，每孔滴加25uL。4.2.3.4.3.2
4.2.3.4.3.3
抗原稀释倍数
1：20
1：80
抗原对照
工作效价补体
稀释液
第一次感作
致敏红细胞
第二次感作
结果判定
将抗原作10倍连续系列稀释后，于每“行”孔中均加人25L，见表4。表4抗原效价测定
阳性血清稀释倍数
1：160
37℃振荡感作40min
37℃振荡感作30min
对照设置
红细胞对照
阴性血清
补体对照
抗原，补体、阴性血清对照均为100%溶血，红细胞对照不发生自溶血，试验成立；抗原与血清在不同稀释度反应能发生抑制溶血的最高抗原稀释倍数即为1个抗原单位4.2.3.4.3.4每孔加人稀释好的2单位补体25L4.2.3.4.3.5对照管设置
红细胞对照：75uL稀释液+50μl致敏绵羊红细胞。补体对照：25uL补体+50μL稀释液+50mL致敏绵羊红细胞。抗原对照：25μL抗原+50L稀释液+50致敏绵羊红细胞。4.2.3.4.3.6将96孔U型板于振荡器上振荡20min，置37℃振荡感作40min。4.2.3.4.3.7加入50uL致敏绵羊红细胞，置37℃水浴30min。取出反应板进行结果判定并记录4.2.3.4.3.8
能与标准阳性血清最高稀释度发生100%抑制溶血（即不溶血）的抗原最大稀释倍数的倒数，就是抗原效价。
SN/T3485—2013
正式试验
4.2.3.5.1
试剂的稀释
4.2.3.5.1.1
将溶血索、抗原、补体按预试验测定的结果进行稀释。4.2.3.5.1.2将灭活后的被检血清、标准阳性血清、标准阴性血清分别做1：5~1：320系列稀释。标准阳性血清稀释倍数要大于其标注效价，阴性血清一般作3个连续稀释滴度。4.2.3.5.2试验程序
4.2.3.5.2.1将倍比稀释的被检血清标准阳性血清标准阴性血清分别加人对应的孔中.每个滴度加25L，具体操作程序见表5。
SN/T3485—2013
SN/T3485—2013
4.2. 3. 5.2.2
4.2.3.5.2.3
4.2.3.5.2.4
4.2.3.5.2.5
4.2.3.5.2.6
4.2.3.5.2.7
4.2.3.5.2.8
向各个稀释度的血清中加入25μuL抗原。加人5单位补体25pL。
同时设置抗原对照、红细胞对照、补体对照和血清抗补体对照。用稀释液将对照孔补加至75μl。置恒温箱37℃感作1h。
加人致敏红细胞50pL，先振荡20min，再置恒温箱37℃感作45min取出后将微量反应板置离心机，1000r/min离心5min，判定并记录结果4.2.3.5.3
结果判定标准
4.2. 3.5.3.1
各对照结果均成立时，方可判定被检血清效价。否则，重做试验红细胞对照：不溶血。
抗原对照：不溶血。
补体对照：50%以上溶血。
阴性血清：100%溶血。
阳性血清：抑制溶血，结果与已知效价相差士1个滴度。血清抗补体对照：一般不能抑制补体使用，100%溶血。否则视为血清抗补体，应重新采血或改用其他方法。
4.2.3.5.3.2被检血清效价的确定完全不溶血：十++十，25%溶血：十+十，50%溶血：十十，75%溶血：十，100%溶血：一。被检血清稀释度在1：5为十+以上时判为阳性，以+十血清稀释的最高倍数为判定结果。被检血清若抗补体，则选用IFA或ELISA试验检测。
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牛焦虫病检疫技术规范
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本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。SN/T3485—2013
本标准参考了OIE发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2010年版）中2.4.2牛巴贝斯虫病的血虫体检查、聚合酶链式反应（PCR）、间接免疫荧光试验与微量补体结合试验，并细化了血虫体检查的结果判定、PCR方法的实验操作与结果判定及补体结合试验的预备试验等内容。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、中华人民共和国宁夏出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准的主要起草人：石建平、孟日增、郝俊虎、宋战昀、孟庆峰、刘阳、鱼海琼、刘金华、王伟利。1范围
牛焦虫病检疫技术规范
SN/T34852013
本标准规定了牛焦虫血虫体检查、聚合酶链式反应（PCR）、间接荧光抗体试验和补体结合试验等实验室检疫技术。
本标准适用于进出境牛焦虫病的诊断与检疫。2
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法梨形虫病病原鉴定方法
SN/T1678
SN/T2685
3疾病概述
泰勒氏焦虫检疫规范
焦虫病是由焦虫纲焦虫目的原虫所引起的家备各种疾病的思称。牛焦虫病主要包括牛巴贝斯虫病和泰勒氏焦虫病，牛巴贝斯虫病参见附录A，泰勒氏焦出病参见附录B。4诊断技术
4.1病原学检查
4.1.1血虫体检查
4.1.1.1样品采集
4. 1. 1. 1. 1
血液样品
无菌采集耳尖或尾尖采血样，也可颈静脉无菌采集用EDTA（1mg/mL）作抗凝剂的抗凝血，4℃保存。
4.1.1.1.2组织标本
无菌穿刺，采集待检动物肩前淋巴结或腹股沟淋巴结组织、肝脏或脾脏制成组织涂片。4.1.1.1.3动物户体
死亡动物应在其死亡后24h内完成采样工作。病死牛样品除做血涂片外，还可采取大脑皮层，肾、肝、肺和骨髓等组织做涂片进行检查。4.1.1.2血涂片的制备
用洁净的载玻片端边缘蘸一小滴血，再用另一端边缘光滑的载玻片做推片，将推片的一端置于血滴SN/T3485—2013
之前，待血液沿推片端缘扩散后，均勾推成薄血膜，也可取一小滴血液（约501.)滴在干净的载玻片上，自然风干形成厚血片。
4.1.1.3组织涂片的制备
脏器涂片的制作可用一块洁净的载玻片轻触脏器的新鲜切面或以两块洁净的玻片轻夹一小块组织，沿玻片的纵向推压，使两玻片上都留下一层组织，涂片风干后，无水甲醇固定5min，再用10%姬姆萨（配制参见附录C的C.1)染色20min~30min。4.1.1.4血涂片或组织涂片的染色涂片待其自然风干后，无水甲醇固定1min，10%姬姆萨染色20min～30min；厚血片与组织涂片风干后80烘箱固定5min，10%姬姆萨染色15min~20min。4.1.1.5病原鉴定
按SN/T1678中规定的方法进行实验和结果判定。4.1.2牛巴贝斯焦虫聚合酶链式反应4.1.2.1试剂与材料
4.1.2.1.1牛巴贝斯焦虫参考虫株：由指定单位提供。4.1.2.1.2rTag酶：5U/μL，保存于一20℃避免反复冻融或温度剧烈变化，随用随取。4.1.2.1.310倍PCR缓冲液：含50mmol/LKCl,10mmol/LTrisHCl(pH8.5),2.5mmol/LMgCl2，0.001%明胶
4.1.2.1.410mmol/LdNTP混合液：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP4种脱氧核苷酸。4.1.2.1.5蛋白酶K：浓度为10mg/mL。4.1.2.1.6引物
本试验选用SSrRNA基因序列作为PCR扩增区，设计两条引物P1，P2，引物位置和序列如下：P1428-457)5-TTGGCATGGGGGCGACCTTCACCCTCGCCC-3P2(699~-670)5-CCAAAGTCAACCAACGGTACGACAGGGTCA3P1、P2引物扩增片段为272bp。
4.1.2.2其他试剂
实验用水按GB/T6682中规定准备，Tris碱、EDTA，SDS、苯酚、NaCI、HCI、乙醚和乙醇等均为市售分析纯。
4.1.2.3器材和设备
PCR扩增仪、电泳仪、微量移液器及吸头、凝胶成像分析仪、恒温培养箱、普通冰箱、低温冰箱、组织匀浆器或研磨器、灭菌离心管、离心机等。4.1.2.4操作方法
4.1.2.4.1样品采集与处理
4.1.2.4.1.1样品采集
取发病或可疑动物外周EDTA抗凝血20mL。2
KANiKAca
4.1.2.4.1.2样品处理
SN/T3485—2013
血液样品需离心取沉淀以去掉血浆蛋白，再用0.01mol/LpHI7.2的PBS充分洗涤、离心，血球泥大约2mL，快速冻融3次，虫体与细胞碎片用TE缓冲液洗涤两次，于12000r/min离心5min，收集沉淀备用。
4.1.2.4.2对照样品制备
4.1.2.4.2.1阳性样品：经培养增殖的参考虫体。4.1.2.4.2.2阴性样品：无虫体感染的正常牛红细胞。4.1.2.4.3基因组DNA抽提
4.1.2.4.3.1新鲜抗凝血，离心弃去清液。4.1.2.4.3.2取出4℃冰箱预冷的红细胞裂解液（ELS）.按1：6~1：10的比例向细胞沉淀中加人ELS裂解液（配制见C.2)(1mL细胞压积加人6mL~10mL裂解液），轻轻吹打混匀。4.1.2.4.3.31500r/min离心5min~8min，离心弃去上层红色清液。4.1.2.4.3.4红细胞裂解完全后收集沉淀部分，加入0.5mLTE离心，若裂解不完全可重复步骤4.1.2.4.3.2和4.1.2.4.3.3。
4.1.2.4.3.5加20%SDS.蛋白酶K（10mg/mL)至终浓度100μg/mL，用一玻璃棒温和地将酶混人黏滞的细胞裂解液中。
4.1.2.4.3.6将细胞裂解液置于60℃水浴3h不时旋转黏滞溶液。4.1.2.4.3.7将溶液冷却至室温，加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和颠转混匀3min。4.1.2.4.3.8空温6000r/min离心15min，取上层水相到另一1.5mL离心管中。4.1.2.4.3.9加等体积饱和酚，混勾，6000r/min离心15min，取上层水相到另一离心管中。4.1.2.4.3.10加等体积酚/三氯甲烷，轻轻混匀，6000r/min离心15min，取上层水相到另一离心管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。加等体积三氯甲烷，轻轻混匀，6000r/min离心15min，吸取上层水相到另离心4.1.2.4.3. 11
管中。
4.1.2.4.3.12
4.1.2.4.3.13
4.1.2.4.3.14
加1/10体积的3mol/L醋酸钠（pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。待絮状物出现后，6000r/min离心15min，弃上清液。沉淀用75%乙醇洗涤，12000r/min离心15min，弃上清液5室温下挥发或瞬时离心吸弃乙醇后，按0.1mL细胞加入1mL的比例加入TE缓冲4.1.2.4.3.15
液。将其置于摇床平台上，4C温和振荡过夜，直至DNA完全溶解，储存备用。也可用等效的商品化DNA提取试剂盒制备DNA样品，操作按说明书进行。4.1.2.4.4PCR扩增DNA
4.1.2.4.4.1PCR反应系统
PCR反应液组分见表1。
KANiKAca
SN/T3485-—2013
10×浓缩缓冲液
引物P1(10umol/L)
引物P2(10μmol/L）
rTaq酶(5U/uL)
DNA模板
总体积为50uL，瞬时离心。
4. 1.2.4.4.2
PCR反应程序
95℃，10min预变性；92℃,1
产物4℃保存。
表1PCR反应液组分
4.1.2.4.4.3PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳用量
in72℃，3min；35个循环，72℃保温10min；扩增用新鲜的1XTBE电泳缓冲液配制1.5%琼脂糖凝胶（EB浓度1ug/nL）并制板。将琼脂糖凝胶板水平放入电泳槽，使1×TBE电泳缓冲液刚好没过胶面。将5uL.PCR产物和1L上样缓冲液（6×LoadingBuffer）混勾后加入样晶孔30min，当溴酚蓝接近底部时终止电泳同时加人DNA标准分子量对照品（DL2000），5V/cm电泳紫外灯下观察核酸带并判断结果，或用凝胶成像分析仪分析结果4.1.2.5结果判定标准
4.1.2.5.1
成立。
阳性对照只出现
阴性对照和空白对照没有核酸条带，试验的DNA条带
若待检样品经电泳出现药272bp的DNA条带可判为阳性：若待检样品扩增经电泳未出现4.1.2.5.2
DNA条带，或者出现的条带不是272bp判为阴性，出现其4.2血清学检测
牛巴贝斯焦虫间接免疫荧光试验（IFA）4.2.1
4.2.1.1血涂片的制备
帮，应判为非特异性扩增，应重做试验，采领静脉血制备血涂片。采血时加入适当的抗凝剂（柠檬酸钠或EDTA），用5倍～10倍体积PBS至少洗涤3次，除去血浆蛋白与免疫球蛋白。洗涤后，将感染红细胞重悬于2倍体积PBS中，加人1%牛血清白蛋白（BSA）。取一滴血液滴在干净的玻片上，或采用手工推片法制成均勾的单层血涂片或将其置于细胞离心机旋转制得血涂片。血涂片自然风干后，80℃烘箱固定5tmin，用铝箔或棕色胶带纸密封，置于一70℃保存备用（最多可保存5年）。4.2.1.2血涂片区格划分与感作
用油性笔将抗原涂片划成8~10个疏水小区，并在每小格内加上块滤纸垫。用移液器在每小格4
-TTKAONIKAca
SN/T3485—2013
内滤纸垫上加人5uL～10μL稀释的阳性血清，将玻片放入湿盒内置37℃感作30min。在每张玻片上设弱阳性血清，阴性血清对照。4.2.1.3血涂片的洗涤和染色
孵育后，轻轻地用PBS将玻片上的滤纸垫冲掉，再用PBS和水先后浸泡10min，每次浸泡时均使用磁力搅拌器使PBS和水处于流动状态。在每小格内加入用异硫氰酸荧光素标记的抗牛IgG抗体。每批新结合物都应标定，其工作浓度通常为（1：400）～（1：1200）.加二抗的玻片置于室温孵育30min。4.2.1.4血涂片的洗涤和封固
孵育后，用PBS洗玻片1次，再用PBS和水依次各浸洗一次，每次lomin。
在湿片上滴加1：1甘油和PBS.盖玻片封片，置于标准的荧光显微镜下检查。4.2.1.5结果判定
结果判定如下：免费标准bzxz.net
a）（-)无荧光：
h）（土)极弱的可疑荧光；
c）（十）荧光较弱，但清楚可见：（十十）荧光明亮：
e）（+++或++++)荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“+”以上，而各种对照均成立，即可判定为阳性。4.2.2牛泰勒焦虫间接免疫荧光试见SN/T2685。
4.2.3微量补体结合试验
4.2.3.1标准试剂
4.2.3.1.1抗原：按附录C中方法自行制备，或由指定单位提供4.2.3.1.2溶血素：效价大于1：10004.2.3.1.3补体：取3只豚鼠新鲜血清混合而成，或由指定单位提供。4.2.3.1.41%绵羊红细胞：无菌采集健康绵羊肝素抗凝全血，加人2.5倍的阿氏液，可于4℃保存1个月。用时取适量红细胞悬液加5~10倍生理盐水，充分混勾，以2000r/min离心15min，上清和白细胞层，再加5～10倍生理盐水悬浮红细胞，充分混匀，以2000r/min离心15min，如此洗涤3次。最后将红细胞合并于一管以2500r/min水平转子离心15min，沉淀的红细胞用生理盐水配成1%悬液。
5对照血清：标准阳性血清与标准阴性血清均由指定单位提供。4.2.3.1.5
4.2.3.2材料与设备
96孔U型微量板、水浴锅、离心机和可调加样器等。4.2.3.3样品
被检血清：常规方法采集样品，分离血清2℃8℃冷藏或一20℃长期保存，4.2.3.3.1
-TrKAoNKAca
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4.2.3.3.2灭活处理：使用前，将阳性血清、阴性血清、待检血清置58℃（土2℃）水浴30min灭活，用巴比要缓冲液按1：5~~1：320稀释。4.2.3.4预备试验
4.2.3.4.1溶血素效价的测定
4.2.3.4.1.1
先将溶血素稀释成1：500、1：600,1：700。4.2.3.4.1.2
4.2.3.4.1.3
4.2.3.4.1,4
稀释液/μul.
补体（1：50）
致敏红细胞
再将1：500、1：600、1：7003个滴度进行倍比稀释，使每个滴度孔中含有25L。加人等量的1%绵羊红细胞25αL，于37℃水浴30min.制备成致敏红细胞。将补体原液进行1：50稀释，根据表2按量滴加于96孔U型板中。表2溶血素效价测定
4.2.3.4.1.5
4.2.3. 4. 1. 6
1:10001:12001:1400
1:20001:240012800|1:40001:48001:800037℃振荡30min
将4.2.3.4.1.3中制备的致敏红细胞按表2中指示加人各孔。确定100%溶血时溶血素的最高稀释倍数为其效价；正式试验时使用2个单位溶血素制备致敏红细胞。
4.2.3.4.2
补体效价的测定
4.2.3.4.2.1，致敏红细胞悬液配制绵羊红细胞吸附了溶血素后即成为致敏红细胞，本标准配制方法是，取等量的1%绵羊红细胞加2单位溶血素，混合后置37℃水浴箱内感作30min。4℃保存，2d内可用。4.2.3.4.2.2补体的配制：取几瓶冻干补体用蒸馏水溶解，或几只豚鼠血清混合。用稀释液作1：50稀释。
4.2.3.4.2.3取96孔板加人不同体积的补体（1：50），然后用稀释液补加至75uL，如表3所示。表3补体效价测定
补体（1：50)/uL
稀释液/mL
致敏红细胞/μuL
溶血度/%
4.2.3.4.2.4置37℃水浴感作30min10
4.2.3.4.2.5每孔均加人致敏红细胞50L置37℃水浴感作30min，
4.2.3.4.2.6
37℃水浴感作30min
-TTKAONTKAca
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4.2.3.4.2.7判定结果，能使标准量红细胞全部溶血的最小补体量为100%溶血（CH100)单位。能使50%红细胞溶血的补体量称为50%溶血（CH50）单位。将96孔U型板置500g离心5min，置酶标仪535nm处测定OD值，与标准比色孔进行比较，确定50%红细胞溶血的补体最高稀释倍数，即该反应体系下的1个补体标准单位。5单位的补体为工作效价。4.2.3.4.3抗原效价测定
分别将灭活的标准阳性血清、标准阴性血清按1：5～1：320稀释，每孔滴加25uL。4.2.3.4.3.1
2阴性对照血清不做稀释，每孔滴加25uL。4.2.3.4.3.2
4.2.3.4.3.3
抗原稀释倍数
1：20
1：80
抗原对照
工作效价补体
稀释液
第一次感作
致敏红细胞
第二次感作
结果判定
将抗原作10倍连续系列稀释后，于每“行”孔中均加人25L，见表4。表4抗原效价测定
阳性血清稀释倍数
1：160
37℃振荡感作40min
37℃振荡感作30min
对照设置
红细胞对照
阴性血清
补体对照
抗原，补体、阴性血清对照均为100%溶血，红细胞对照不发生自溶血，试验成立；抗原与血清在不同稀释度反应能发生抑制溶血的最高抗原稀释倍数即为1个抗原单位4.2.3.4.3.4每孔加人稀释好的2单位补体25L4.2.3.4.3.5对照管设置
红细胞对照：75uL稀释液+50μl致敏绵羊红细胞。补体对照：25uL补体+50μL稀释液+50mL致敏绵羊红细胞。抗原对照：25μL抗原+50L稀释液+50致敏绵羊红细胞。4.2.3.4.3.6将96孔U型板于振荡器上振荡20min，置37℃振荡感作40min。4.2.3.4.3.7加入50uL致敏绵羊红细胞，置37℃水浴30min。取出反应板进行结果判定并记录4.2.3.4.3.8
能与标准阳性血清最高稀释度发生100%抑制溶血（即不溶血）的抗原最大稀释倍数的倒数，就是抗原效价。
SN/T3485—2013
正式试验
4.2.3.5.1
试剂的稀释
4.2.3.5.1.1
将溶血索、抗原、补体按预试验测定的结果进行稀释。4.2.3.5.1.2将灭活后的被检血清、标准阳性血清、标准阴性血清分别做1：5~1：320系列稀释。标准阳性血清稀释倍数要大于其标注效价，阴性血清一般作3个连续稀释滴度。4.2.3.5.2试验程序
4.2.3.5.2.1将倍比稀释的被检血清标准阳性血清标准阴性血清分别加人对应的孔中.每个滴度加25L，具体操作程序见表5。
SN/T3485—2013
SN/T3485—2013
4.2. 3. 5.2.2
4.2.3.5.2.3
4.2.3.5.2.4
4.2.3.5.2.5
4.2.3.5.2.6
4.2.3.5.2.7
4.2.3.5.2.8
向各个稀释度的血清中加入25μuL抗原。加人5单位补体25pL。
同时设置抗原对照、红细胞对照、补体对照和血清抗补体对照。用稀释液将对照孔补加至75μl。置恒温箱37℃感作1h。
加人致敏红细胞50pL，先振荡20min，再置恒温箱37℃感作45min取出后将微量反应板置离心机，1000r/min离心5min，判定并记录结果4.2.3.5.3
结果判定标准
4.2. 3.5.3.1
各对照结果均成立时，方可判定被检血清效价。否则，重做试验红细胞对照：不溶血。
抗原对照：不溶血。
补体对照：50%以上溶血。
阴性血清：100%溶血。
阳性血清：抑制溶血，结果与已知效价相差士1个滴度。血清抗补体对照：一般不能抑制补体使用，100%溶血。否则视为血清抗补体，应重新采血或改用其他方法。
4.2.3.5.3.2被检血清效价的确定完全不溶血：十++十，25%溶血：十+十，50%溶血：十十，75%溶血：十，100%溶血：一。被检血清稀释度在1：5为十+以上时判为阳性，以+十血清稀释的最高倍数为判定结果。被检血清若抗补体，则选用IFA或ELISA试验检测。
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