SN/T 3505-2013
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标准简介
SN/T 3505-2013.Quarantine protocol for canine dirofilariasis.
1范围
SN/T 3505规定了犬恶丝虫的检疫技术规范。
SN/T 3505适用于犬恶丝虫的形态观察PCR检测及抗体检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用干本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3形态观察
3.1设备和器材
3.1.1 普通离心机。
3.1.2光学显微镜。
3.1.3 体视显微镜。
3.1.4 解剖器材。
3.2试剂和材料
3.2.1 2%(体积分数)甲醛水溶液
3.2.2 美蓝染色液,配制见附录A的A.1。
3.3 微丝蚴观察(改良柯氏试验)
采集待检动物外周血5 mL,每毫升加人9mL 2%甲醛水溶液，混合后1 500 r/min离心10 min,去上清液,取少量沉渣,美蓝染色,镜检观察，并拍照记录。犬恶丝虫微丝蚴的主要形态特征为:大小为(218 μm~329μm)×(5μm~7μm),无鞘膜,前段呈尖锥状,后端细长、较直。染色后虫体呈蓝色，参见附录B。
3.4 成虫观察
解剖患病动物,检查其右心室和肺动脉。成虫虫体呈微白色,细长粉丝状。口由6个不明显的乳突围绕。雄虫长为12 cm~20cm,后部呈螺旋状卷曲,有窄的尾翼膜,末端有尾乳突11 对(肛前5对、肛后6对),交合刺2根,长短不等。雌虫长为25cm~30cm,尾端钝圆,阴门开口于食道后端,参见附录B。
1范围
SN/T 3505规定了犬恶丝虫的检疫技术规范。
SN/T 3505适用于犬恶丝虫的形态观察PCR检测及抗体检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用干本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3形态观察
3.1设备和器材
3.1.1 普通离心机。
3.1.2光学显微镜。
3.1.3 体视显微镜。
3.1.4 解剖器材。
3.2试剂和材料
3.2.1 2%(体积分数)甲醛水溶液
3.2.2 美蓝染色液,配制见附录A的A.1。
3.3 微丝蚴观察(改良柯氏试验)
采集待检动物外周血5 mL,每毫升加人9mL 2%甲醛水溶液，混合后1 500 r/min离心10 min,去上清液,取少量沉渣,美蓝染色,镜检观察，并拍照记录。犬恶丝虫微丝蚴的主要形态特征为:大小为(218 μm~329μm)×(5μm~7μm),无鞘膜,前段呈尖锥状,后端细长、较直。染色后虫体呈蓝色，参见附录B。
3.4 成虫观察
解剖患病动物,检查其右心室和肺动脉。成虫虫体呈微白色,细长粉丝状。口由6个不明显的乳突围绕。雄虫长为12 cm~20cm,后部呈螺旋状卷曲,有窄的尾翼膜,末端有尾乳突11 对(肛前5对、肛后6对),交合刺2根,长短不等。雌虫长为25cm~30cm,尾端钝圆,阴门开口于食道后端,参见附录B。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3505-—2013
犬恶丝虫病检疫技术规范
Ouarantine protocol for canine dirofilariasis2013-03-01发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-09-16实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3505—2013
本标准起草单位：中华人民共和国四川出人境检验检疫局、四川农业大学、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：余华、杨光友、岳川、工景、严玉宝、李应国、刘洋洋、陈世界、周岷江、胡娟、崔鹏博。1范围
犬恶丝虫病检疫技术规范
本标准规定了犬恶丝虫的检疫技术规范。本标准适用于犬恶丝虫的形态观察、PCR检测及抗体检测。2规范性引用文件
SN/T3505—2013
凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文下列文件对于本文件的应用是必不可少的。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用十本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方3形态观察
设备和器材
普通离心机。
光学显微镜。bzxz.net
3.1.3体视显微镜。
解剖器材。
试剂和材料
3.2.12%（体积分数）甲醛水溶液美蓝染色液，配制见附录A
3.3微丝蝴观察（改良柯氏试验）采集待检动物外周血5mL，每毫开加人9mL甲醛水液
合后1500r/min离心10min，去
上清液，取少量沉渣，美蓝染色，镜检观察，并拍照记录。犬恶丝虫微丝蝴的主要形态特征为：大小为（218um329μm）×（5μm7μm），无鞘膜，前段呈尖锥状，后端细长，较直。染色后虫体呈蓝色，参见附录B。
3.4成虫观察
解剖患病动物，检查其右心室和肺动脉。成虫虫体呈微白色，细长粉丝状。口山6个不明显的乳突围绕，雄虫长为12cm～20cm，后部呈螺旋状卷曲，有窄的尾翼膜，末端有尾乳突11对（肛前5对、肛后6对），交合刺2根，长短不等。雌虫长为25cm～30cm，尾端钝圆，阴门开口于食道后端，参见附录B。4PCR检测
4.1设备和器材
4.1.1移液器（10ul200ul000μL各一支）SN/T3505—2013
4.1.2PCR仪。
4.1.3水平电泳槽。
4.1.4pH计
4.1.5电子天平。
4.1.6冷冻离心机。
4.1.7凝胶成像分析系统
电泳仪。
试剂和材料
4.2.1市售总DNA抽提试剂盒。
4.2.2引物：
DIDR-F15'-AGTGCGAATTGCAGACGCATTGAG-3DIDR-RI5-AGCGGGTAATCACGACTGAGTTGA-3。4.2.3市售PCR缓冲液（含Mg+、Taq聚合酶等）。4.2.4DL2000 DNAMarker。
5阳性对照品（恶丝虫阳性犬血浆）。阴性对照品（恶丝虫阴性犬血浆）。4.2.6
琼脂糖。
操作方法
DNA抽提
采集疑似病犬的血液，取1.OmL用总DVA试剂盒抽提血液中的DNA，操作步骤按照试剂盒说明书。DNA溶解于20叫L灭菌水中备用。4.3.2扩增和检测
25μL扩增体系含：2×PCR缓冲液12.5μL，引物DIDR-F1（10pmol/μL）、DIDR-R1（10pmol/μL)各1.0μL，血液总DNA1.0μL,H,010.5μL，混勾后稍加离心。按参数：95℃预变性5min；35个循环：95℃变性30s.60℃复性305，72℃延伸305；最后72℃延伸10min进行扩增。同时，以H,O代替模板DNA作空白对照。每次试验加做阴性、阳性质控对照。反应结束后，取5.0μLPCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳（10V/cm，30min）。4.4
结果分析
若PCR产物出现约520bp的目的片段，则对目的产物进行测序，序列应与GenBank中犬恶丝虫参考序列匹配率不小于93%。PCR产物参考序列参见附录C。5抗体检测（Dot-ELISA法）
设备和器材
恒温培养箱。
硝酸纤维素膜（NC膜）。
KAoNiKAca
5.1.3玻璃研钵。
5.1.4显微镜。
5.1.5-次性滤器（0.22um）。
5.2试剂和材料
SN/T3505—-2013
以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的二级水。5.2.1酶联葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)。5.2.2
2犬恶丝虫阳性血清。
犬恶丝虫阴性血清。
5.2.4包被缓冲液，配制见A.2
封闭液，配制见A.3。
PBS缓冲液，配制见A.4。
PBST洗涤液，配制见A.5。
底物溶液，配制见A.6。
操作步骤
虫体抗原制备
用PBS缓冲液将从动物体内收集到的犬恶丝虫虫体清洗3次，再用玻璃研体在冰浴上研磨·直到显微镜检查无完整虫体组织为止。然后将研磨好的组织勾浆倒人离心管中，一20℃反复冻融5次10000r/min4℃离心30min，取上清液，无菌过滤（0.22μm）后作为可溶性抗原，并测定蛋白质含量，分装后，一20℃保存备用。
5.3.2诊断膜制备
用铅笔在硝酸纤维素膜（NC膜）光滑面将膜划成5mmX5mm小方块，将NC膜在蒸馏水中浸泡20min，完全湿透后取出，室温晾干，备用。用包被缓冲液（pH9.6）将犬恶丝虫虫体粗抗原原液稀释至16.0μg/ml，备用。用微量加样器在小格中央滴加1L稀释好的虫体粗抗原，37℃保温30min；将包被好的NC膜浸入封闭液中，37℃封闭50min。将封闭好的膜片浸人PBST洗涤液中泡洗3次，每次5min。置室温晾干，即为诊断膜。可放入密闭干燥的塑料袋中备用。5.3.3ELISA检测
每只待检动物采集血液5ml分离血清用于检测。每次试验时均应设立阳性血清对照和阴性血清对照。检测步骤如下：
a）用PBS(pH7.4)缓冲液将待检血清按1：150稀释，酶联葡萄球菌A蛋白（HRP-SPA稀释到工作浓度备用：
b）将预备的诊断膜浸人稀释好的血清中，置37℃，反应60min；将诊断膜没入PBST洗涤液中泡洗3次，每次5min，取出用滤纸吸干；c
d）将诊断膜浸人稀释好的HRP-SPA溶液中，置37℃，反应60min；e）重复步骤；
f）将诊断膜浸人新鲜配制的底物溶液中，置37℃，避光显色20min；g）用自来水冲洗终止反应，晾干。3
YKAoNrAca
SN/T3505—2013
5.4结果判断
肉眼观察。阳性对照出现至少十，阴性无可见斑点，对照成立方可判定。依反应色泽深浅记录反应等级。十十十：斑点呈深蓝色：十十：斑点呈蓝色；十：斑点呈灰蓝色；一：无可见斑点，即为阴性。土（可疑）：仅有微弱的界限不清的斑点。对可疑者作重复检测，重复检测仍为可疑，判为阳性。综合判定
检出犬恶丝虫微丝蜘，且PCR或血清抗体检测结果阳性，即判定动物大恶丝虫病阳性。检出特征性的犬恶丝虫成虫，即其他情况时，均判定为阴性。
-iiKAoNrkAca
A.1美蓝染色液
附录A
（规范性附录）
试剂的配制
SN/T3505—2013
取0.5g美蓝，溶于30mL95%酒精中，加100mL0.01%氢氧化钾溶液，保存在棕色瓶内。A.2包被缓冲液（pH9.6）
分别称取NazCO,1.59g、NHO
加养馏水溶解并定容至1000mL.用NaOH调节pH至9.6。0.22um滤器过滤后，置于4℃保存备用A.3封闭液（10g/L）
取1gBSA（牛血清白蛋白）加蒸镭水定容至100mL.置手C保存。A.4PBS缓冲液(pH7.4)
取KHPO,·2H,O0.2g.Nas
调节pH至7.4，加蒸馏水定容至
5PBST洗涤液
取0.5mL吐温20加人
A.6底物溶液（现配现用）
JPO4·12H
）2.9gNaC18.0g，KCl0.2g.加蒸馏水至800mL，℃保存。
mL，置手
LPBSPH
取4.5mg4氯1酚溶于1.5
合后立即使用。
4）.搅拌混匀置4℃保存。
水甲醇中再加
mLPBS混合，最后加人2uL双氧水，混KAoNiKAca
SN/T3505—2013
附录B
（资料性附录）
疫病概述
犬恶丝虫（Dirofilariaimmitis）义称犬心丝虫（heartworm），为双瓣科、恶丝属（Dirofilaria）的虫种、犬恶丝虫的成虫寄生于犬心脏的右心室及肺动脉（少数见于胸腔、支气管、皮下结缔组织等处），引起循环障碍、呼吸困难、贫血、猝死等症状，即犬恶丝虫病，属于种丝虫病。除犬外，猫和多种野生动物以及人均可感染与发病。该病不仅危害犬、猫等动物的健康，而且对人类健康亦构成威胁。微丝（Microfilariac），为犬恶丝出虫的雌虫和维虫交配后，雌虫胎生产出的幼虫。微丝蜘通常生活于动物的外周血液中。
雌虫产出的微丝进人外周血液内，在外周血液中可生存1年或1年以上.但被中问宿主吞噬以前不能进一步发育。犬恶丝虫中间宿主为蚊子（如：中华按蚊、白纹伊蚊、浅色库蚊等）。夏季蚊子吸食动物血液，微丝蝴随血液进人蚊体内，在其体内约2周发育为第三期感染性幼虫。蚊刺吸犬、猫血液时，第三期幼虫从蚊了口器中逸出，迅速钻进动物宿主皮肤，在皮下结缔组织、肌间组织、脂肪组织和肌膜下发育，经第3次、第4次蜕皮成为童虫，然后进人静脉，移行到右心室及人血管内，继续发育为成虫。从蚊子叮咬感染到发育为成虫需6个7个月。成虫除寄生在右心室及肺动脉外，也可在后腔静脉、前腔静脉到肺动脉的毗连血管内寄生。在终宿主体内成虫可生存5年6年，并不断产生微丝坳。犬恶丝虫形态及生活史见图B.1-图B.2。
注：引自杨光友动物寄生虫病学》，2099。说明：
虫体头部；
堆虫阴门部：
雄虫尾端：
微丝蜘。
图B.1犬恶丝虫虫体形态
注：杨光友摄。
图B.2犬恶丝虫成虫形态
TTKAoNTKAca
注：Rishniw,2c06。
改良柯氏试验检查涂片中的犬恶丝虫微丝（40×）图B.3
注：引白Bowman(ParasitologyforVeterinarians(Seventh edition)》，1999图B.4
犬恶丝虫生活史
SN/T3505—2013
SN/T3505—2013
附录C
（资料性附录）
犬恶丝虫PCR产物参考序列
5'AGTGCGAATTGCAGACGCATTGAGCACAAAGATTTCGAATGCACATTGCACCATCGGGTTGATTCCCGATGGTACGTCTGGTTGAGGGTCAATATCGATCAGATTATCAAATAATATACCAAAATTGATACATATGATACATATGAATGATATATGTTTTGGATATATTATTTGTTAAAATTAATTCATCAGGTGATGATGTGATGATAATCATTGAAAAATGACAAAAATCCCCTGATTAAGTATAATAAAAATAGTAAGTAAAAAAGGCAAATTTTTACTTACAAAATATTACATATTGGAATAAATAATTTAATCTTTCATATATATAACTGTGATACATCATAAATATATATATAGCAAAAGAAAGATATAAATTATTATCATTTTTTTTGATCATTATTGCTATAATTATTATCCTGCTTGTTTAACTATAATAATAGCAATGAATGAATCAAAATTTAAATGATACGTTAAAATCCAACCAATATGTTATAAATTTTCTTTCATTTTTGACCTCAACTCAGTCGTGATTACCCGCT3
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犬恶丝虫病检疫技术规范
Ouarantine protocol for canine dirofilariasis2013-03-01发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-09-16实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3505—2013
本标准起草单位：中华人民共和国四川出人境检验检疫局、四川农业大学、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：余华、杨光友、岳川、工景、严玉宝、李应国、刘洋洋、陈世界、周岷江、胡娟、崔鹏博。1范围
犬恶丝虫病检疫技术规范
本标准规定了犬恶丝虫的检疫技术规范。本标准适用于犬恶丝虫的形态观察、PCR检测及抗体检测。2规范性引用文件
SN/T3505—2013
凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文下列文件对于本文件的应用是必不可少的。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用十本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方3形态观察
设备和器材
普通离心机。
光学显微镜。bzxz.net
3.1.3体视显微镜。
解剖器材。
试剂和材料
3.2.12%（体积分数）甲醛水溶液美蓝染色液，配制见附录A
3.3微丝蝴观察（改良柯氏试验）采集待检动物外周血5mL，每毫开加人9mL甲醛水液
合后1500r/min离心10min，去
上清液，取少量沉渣，美蓝染色，镜检观察，并拍照记录。犬恶丝虫微丝蝴的主要形态特征为：大小为（218um329μm）×（5μm7μm），无鞘膜，前段呈尖锥状，后端细长，较直。染色后虫体呈蓝色，参见附录B。
3.4成虫观察
解剖患病动物，检查其右心室和肺动脉。成虫虫体呈微白色，细长粉丝状。口山6个不明显的乳突围绕，雄虫长为12cm～20cm，后部呈螺旋状卷曲，有窄的尾翼膜，末端有尾乳突11对（肛前5对、肛后6对），交合刺2根，长短不等。雌虫长为25cm～30cm，尾端钝圆，阴门开口于食道后端，参见附录B。4PCR检测
4.1设备和器材
4.1.1移液器（10ul200ul000μL各一支）SN/T3505—2013
4.1.2PCR仪。
4.1.3水平电泳槽。
4.1.4pH计
4.1.5电子天平。
4.1.6冷冻离心机。
4.1.7凝胶成像分析系统
电泳仪。
试剂和材料
4.2.1市售总DNA抽提试剂盒。
4.2.2引物：
DIDR-F15'-AGTGCGAATTGCAGACGCATTGAG-3DIDR-RI5-AGCGGGTAATCACGACTGAGTTGA-3。4.2.3市售PCR缓冲液（含Mg+、Taq聚合酶等）。4.2.4DL2000 DNAMarker。
5阳性对照品（恶丝虫阳性犬血浆）。阴性对照品（恶丝虫阴性犬血浆）。4.2.6
琼脂糖。
操作方法
DNA抽提
采集疑似病犬的血液，取1.OmL用总DVA试剂盒抽提血液中的DNA，操作步骤按照试剂盒说明书。DNA溶解于20叫L灭菌水中备用。4.3.2扩增和检测
25μL扩增体系含：2×PCR缓冲液12.5μL，引物DIDR-F1（10pmol/μL）、DIDR-R1（10pmol/μL)各1.0μL，血液总DNA1.0μL,H,010.5μL，混勾后稍加离心。按参数：95℃预变性5min；35个循环：95℃变性30s.60℃复性305，72℃延伸305；最后72℃延伸10min进行扩增。同时，以H,O代替模板DNA作空白对照。每次试验加做阴性、阳性质控对照。反应结束后，取5.0μLPCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳（10V/cm，30min）。4.4
结果分析
若PCR产物出现约520bp的目的片段，则对目的产物进行测序，序列应与GenBank中犬恶丝虫参考序列匹配率不小于93%。PCR产物参考序列参见附录C。5抗体检测（Dot-ELISA法）
设备和器材
恒温培养箱。
硝酸纤维素膜（NC膜）。
KAoNiKAca
5.1.3玻璃研钵。
5.1.4显微镜。
5.1.5-次性滤器（0.22um）。
5.2试剂和材料
SN/T3505—-2013
以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的二级水。5.2.1酶联葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)。5.2.2
2犬恶丝虫阳性血清。
犬恶丝虫阴性血清。
5.2.4包被缓冲液，配制见A.2
封闭液，配制见A.3。
PBS缓冲液，配制见A.4。
PBST洗涤液，配制见A.5。
底物溶液，配制见A.6。
操作步骤
虫体抗原制备
用PBS缓冲液将从动物体内收集到的犬恶丝虫虫体清洗3次，再用玻璃研体在冰浴上研磨·直到显微镜检查无完整虫体组织为止。然后将研磨好的组织勾浆倒人离心管中，一20℃反复冻融5次10000r/min4℃离心30min，取上清液，无菌过滤（0.22μm）后作为可溶性抗原，并测定蛋白质含量，分装后，一20℃保存备用。
5.3.2诊断膜制备
用铅笔在硝酸纤维素膜（NC膜）光滑面将膜划成5mmX5mm小方块，将NC膜在蒸馏水中浸泡20min，完全湿透后取出，室温晾干，备用。用包被缓冲液（pH9.6）将犬恶丝虫虫体粗抗原原液稀释至16.0μg/ml，备用。用微量加样器在小格中央滴加1L稀释好的虫体粗抗原，37℃保温30min；将包被好的NC膜浸入封闭液中，37℃封闭50min。将封闭好的膜片浸人PBST洗涤液中泡洗3次，每次5min。置室温晾干，即为诊断膜。可放入密闭干燥的塑料袋中备用。5.3.3ELISA检测
每只待检动物采集血液5ml分离血清用于检测。每次试验时均应设立阳性血清对照和阴性血清对照。检测步骤如下：
a）用PBS(pH7.4)缓冲液将待检血清按1：150稀释，酶联葡萄球菌A蛋白（HRP-SPA稀释到工作浓度备用：
b）将预备的诊断膜浸人稀释好的血清中，置37℃，反应60min；将诊断膜没入PBST洗涤液中泡洗3次，每次5min，取出用滤纸吸干；c
d）将诊断膜浸人稀释好的HRP-SPA溶液中，置37℃，反应60min；e）重复步骤；
f）将诊断膜浸人新鲜配制的底物溶液中，置37℃，避光显色20min；g）用自来水冲洗终止反应，晾干。3
YKAoNrAca
SN/T3505—2013
5.4结果判断
肉眼观察。阳性对照出现至少十，阴性无可见斑点，对照成立方可判定。依反应色泽深浅记录反应等级。十十十：斑点呈深蓝色：十十：斑点呈蓝色；十：斑点呈灰蓝色；一：无可见斑点，即为阴性。土（可疑）：仅有微弱的界限不清的斑点。对可疑者作重复检测，重复检测仍为可疑，判为阳性。综合判定
检出犬恶丝虫微丝蜘，且PCR或血清抗体检测结果阳性，即判定动物大恶丝虫病阳性。检出特征性的犬恶丝虫成虫，即其他情况时，均判定为阴性。
-iiKAoNrkAca
A.1美蓝染色液
附录A
（规范性附录）
试剂的配制
SN/T3505—2013
取0.5g美蓝，溶于30mL95%酒精中，加100mL0.01%氢氧化钾溶液，保存在棕色瓶内。A.2包被缓冲液（pH9.6）
分别称取NazCO,1.59g、NHO
加养馏水溶解并定容至1000mL.用NaOH调节pH至9.6。0.22um滤器过滤后，置于4℃保存备用A.3封闭液（10g/L）
取1gBSA（牛血清白蛋白）加蒸镭水定容至100mL.置手C保存。A.4PBS缓冲液(pH7.4)
取KHPO,·2H,O0.2g.Nas
调节pH至7.4，加蒸馏水定容至
5PBST洗涤液
取0.5mL吐温20加人
A.6底物溶液（现配现用）
JPO4·12H
）2.9gNaC18.0g，KCl0.2g.加蒸馏水至800mL，℃保存。
mL，置手
LPBSPH
取4.5mg4氯1酚溶于1.5
合后立即使用。
4）.搅拌混匀置4℃保存。
水甲醇中再加
mLPBS混合，最后加人2uL双氧水，混KAoNiKAca
SN/T3505—2013
附录B
（资料性附录）
疫病概述
犬恶丝虫（Dirofilariaimmitis）义称犬心丝虫（heartworm），为双瓣科、恶丝属（Dirofilaria）的虫种、犬恶丝虫的成虫寄生于犬心脏的右心室及肺动脉（少数见于胸腔、支气管、皮下结缔组织等处），引起循环障碍、呼吸困难、贫血、猝死等症状，即犬恶丝虫病，属于种丝虫病。除犬外，猫和多种野生动物以及人均可感染与发病。该病不仅危害犬、猫等动物的健康，而且对人类健康亦构成威胁。微丝（Microfilariac），为犬恶丝出虫的雌虫和维虫交配后，雌虫胎生产出的幼虫。微丝蜘通常生活于动物的外周血液中。
雌虫产出的微丝进人外周血液内，在外周血液中可生存1年或1年以上.但被中问宿主吞噬以前不能进一步发育。犬恶丝虫中间宿主为蚊子（如：中华按蚊、白纹伊蚊、浅色库蚊等）。夏季蚊子吸食动物血液，微丝蝴随血液进人蚊体内，在其体内约2周发育为第三期感染性幼虫。蚊刺吸犬、猫血液时，第三期幼虫从蚊了口器中逸出，迅速钻进动物宿主皮肤，在皮下结缔组织、肌间组织、脂肪组织和肌膜下发育，经第3次、第4次蜕皮成为童虫，然后进人静脉，移行到右心室及人血管内，继续发育为成虫。从蚊子叮咬感染到发育为成虫需6个7个月。成虫除寄生在右心室及肺动脉外，也可在后腔静脉、前腔静脉到肺动脉的毗连血管内寄生。在终宿主体内成虫可生存5年6年，并不断产生微丝坳。犬恶丝虫形态及生活史见图B.1-图B.2。
注：引自杨光友动物寄生虫病学》，2099。说明：
虫体头部；
堆虫阴门部：
雄虫尾端：
微丝蜘。
图B.1犬恶丝虫虫体形态
注：杨光友摄。
图B.2犬恶丝虫成虫形态
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注：Rishniw,2c06。
改良柯氏试验检查涂片中的犬恶丝虫微丝（40×）图B.3
注：引白Bowman(ParasitologyforVeterinarians(Seventh edition)》，1999图B.4
犬恶丝虫生活史
SN/T3505—2013
SN/T3505—2013
附录C
（资料性附录）
犬恶丝虫PCR产物参考序列
5'AGTGCGAATTGCAGACGCATTGAGCACAAAGATTTCGAATGCACATTGCACCATCGGGTTGATTCCCGATGGTACGTCTGGTTGAGGGTCAATATCGATCAGATTATCAAATAATATACCAAAATTGATACATATGATACATATGAATGATATATGTTTTGGATATATTATTTGTTAAAATTAATTCATCAGGTGATGATGTGATGATAATCATTGAAAAATGACAAAAATCCCCTGATTAAGTATAATAAAAATAGTAAGTAAAAAAGGCAAATTTTTACTTACAAAATATTACATATTGGAATAAATAATTTAATCTTTCATATATATAACTGTGATACATCATAAATATATATATAGCAAAAGAAAGATATAAATTATTATCATTTTTTTTGATCATTATTGCTATAATTATTATCCTGCTTGTTTAACTATAATAATAGCAATGAATGAATCAAAATTTAAATGATACGTTAAAATCCAACCAATATGTTATAAATTTTCTTTCATTTTTGACCTCAACTCAGTCGTGATTACCCGCT3
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