SN/T 3504-2013
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标准简介
SN/T 3504-2013.Quarantine protocol for metacercaria of Para gonimus in crustaceans.
1范围
SN/T 3504规定了并殖吸虫囊蚴的形态学鉴定和PCR检测方法。
SN/T 3504适用于蟹、虾等甲壳类水产品中并殖吸虫囊蚴的检疫、流行病学调查和监测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T18088出人境动物检疫采样
3概述
并殖吸虫俗称肺吸虫,主要寄生于人、犬、猫、鼠等哺乳动物的肺内。人因食人生的、未煮熟的含有并殖吸虫囊蚴的蟹类、蜊蛄和沼虾等水产品而感染。并殖吸虫的分类、分布及生活史参见附录A。
4设备和材料
4.1仪器和器材
4.1.1 生物显微镜。
4.1.2 体视显微镜。
4.1.3 PCR扩增仪。
4.1.4 电泳仪。
4.1.5 凝胶成像系统。
4.1.6 网筛(10目,40目)
4.1.7 玻璃珠(425 μm~600 μm)。
4.2试剂和溶液
4.2.1 Taq酶(5 U/μL)。
4.2.2 2. 5 mmol/L dNTP,
5检验步骤
5.1样品采集
临床上采集的样品为溪蟹、蜊蛄和沼虾等甲壳类水产品。采样比例按照GB/T 18088 执行。
1范围
SN/T 3504规定了并殖吸虫囊蚴的形态学鉴定和PCR检测方法。
SN/T 3504适用于蟹、虾等甲壳类水产品中并殖吸虫囊蚴的检疫、流行病学调查和监测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T18088出人境动物检疫采样
3概述
并殖吸虫俗称肺吸虫,主要寄生于人、犬、猫、鼠等哺乳动物的肺内。人因食人生的、未煮熟的含有并殖吸虫囊蚴的蟹类、蜊蛄和沼虾等水产品而感染。并殖吸虫的分类、分布及生活史参见附录A。
4设备和材料
4.1仪器和器材
4.1.1 生物显微镜。
4.1.2 体视显微镜。
4.1.3 PCR扩增仪。
4.1.4 电泳仪。
4.1.5 凝胶成像系统。
4.1.6 网筛(10目,40目)
4.1.7 玻璃珠(425 μm~600 μm)。
4.2试剂和溶液
4.2.1 Taq酶(5 U/μL)。
4.2.2 2. 5 mmol/L dNTP,
5检验步骤
5.1样品采集
临床上采集的样品为溪蟹、蜊蛄和沼虾等甲壳类水产品。采样比例按照GB/T 18088 执行。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T35042013
甲壳类水产品中并殖吸虫囊检疫技术规范
Quarantine protocol for metacercaria of Paragonimus in crustaceans2013-03-01发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-09-16实施
本标准按照GB/T1.-2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3504—2013
本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、广西大学。
本标准主要起草人：李树清、陈韶红、黄维义、张永年、陈志飞、李雯雯、王巧全、张强、王艳、李健、常正山、陈盈。
1范围
甲壳类水产品中并殖吸虫囊检疫技术规范
本标准规定了并殖吸虫囊坳的形态学鉴定和PCR检测方法。SN/T3504—2013
本标准适用于蟹、虾等甲壳类水产品中并殖吸虫囊蚜的检疫、流行病学调查和监测。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法8出人境动物检疫采样
GB/T18088
3概述
并殖吸虫俗称肺吸虫·主要寄生于人、犬、猫、鼠等哺乳动物的肺内。人因食人生的、未煮熟的含有并殖吸虫囊蚜的蟹类、和沼虾等水产品而感染。并殖吸虫的分类、分布及生活史参见附录A。4
设备和材料
仪器和器材
生物显微镜。
体视显微镜。
PCR扩增仪。
电泳仪。
凝胶成像系统。
网筛（10目，40目）
玻璃珠（425μm~600μm）。
试剂和溶液
Taq酶(5U/μL)。
2.5mmol/LdNTP。
25mmol/LMgClz。
10XPCR缓冲液（无Mg+）。
分子量指示物：100bp2000bpDNAmarkcr。水（符合GB/T6682中一级水的规定）。人工消化液、Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）、琼脂糖凝胶、6X加样缓冲液（配制见附录B）。SN/T3504—2013
4.3引物
扩增并殖吸虫核糖体DNA第二内转录间隔区（ITS2)引物序列为：F游引物3S:5GGTACCGGTGGATCACTCGGCTCGTG3F游I物A28:5-GGGATCCTGGTTAGT TTCTTTTCCTCCGC-35检验步骤
5.1样品采集
临床上采集的样品为溪蟹、站和沼虾等中壳类水产品采样比例按照GB/T18088执行。5.2样品处理
5.2.1捣碎法
为保证囊的完整性，推荐使用竹筒和竹棒（或其他类似替代品）捣碎样品，用生理盐水清洗，用10目网筛过滤，除去粗蟹壳。滤液再用401网筛过滤滤液置于锥形量简内，加水至量简的最人刻度处，沉淀洗涤至水清，全部沉渣吸人玻璃平压，在体视显微镜下，收集囊蜘，用生物显微镜按照5.3进行形态鉴定。
5.2.2消化法
样品量多时，可使用消化法。将样品用竹筒和竹棒降移入烧杯中，按照样品与人工消化液1：5的比例加入消化液，于37℃消化至无可免的肉组织。消化后的悬液用10目网筛过滤，除去粗蟹壳。滤液再用40目网筛过滤，滤液置于锥形量筒内，加水至量筒的最大刻度处，沉淀洗涤全水清。全部沉渣吸入玻璃平皿，在体视显微镜下，收集囊勉-用生物显微镜按照5.3进行形态鉴定。5.2.3囊保存
鉴定后的部分囊坳保存于75酒精中或于少量生理盐水巾
按5.4.1提取DNA，
5.3并殖吸虫囊蝴形态鉴定
并殖吸虫囊蝴一般呈球形或近球形通常速冻，另取部分形态一致的囊坳有2层囊壁，但因虫种不同，可有3层囊壁或仅1层囊壁。后尾坳折登卷曲在囊内，能看见充满黑色颗粒的排泄囊和两侧弯曲的肠管。口吸盘有时可见到，而腹吸盘则常被排泄囊所遮盖，后尾坳与囊壁间可有明显的空隙，也可无空隙。不同种的并殖吸虫衰坳大小有差异，如卫氏并殖吸虫小囊蜘直径为320um~360m，人囊蚜直径为376um~400m。斯氏并殖吸虫囊蜘，直径为400um左右。并殖吸虫囊坳模式图及实物图参见附录C。由于并殖吸虫种类多，囊蜘形态相似，仪凭囊蚜形态很难准确鉴定并殖吸虫虫种。因此，需要结合分子生物学方法进一步鉴定虫种。
5.4并殖吸虫囊蝴分子生物学鉴定5.4.1样品DNA提取
5.4.1.1DNA提取方法可选用等效商品化试剂盒，下面以QIAGENI公司的DNA抽提试剂盒使用QIAGEN公司的DNA试剂盒进行描述只是为了叙述方便，并不代表推荐QIAGEN的产品，标准的使用人可以使用其他公司的同类产品，2
TrKAONKAca
SN/T3504—2013
(DNeasyBlood&.Tissuekit)进行DNA提取。取主要形态特征一致的囊坳1个～10个放人1.5ml离心管中，加人100LPBS和少量玻璃珠振荡5min10min，再加人蛋白酶K（600Mau/mL，活力单位/mL)20uL与ATL缓冲液180μL,56℃消化1h3h。期间不时振荡，至囊充分裂解。5.4.1.2消化完全后，涡旋振荡15s，加200uL缓冲液AI，立即涡旋振荡混匀，再加入200μL乙醇（96%~100%），涡旋振荡混匀。5.4.1.3将离心柱置于收集管上：将上一步的混合物吸入离心柱中，8000r/min离心1min，弃收集管。
5.4.1.4将离心柱置于新的收集管中，加500l缓冲液AW1，8000r/min离心1min，弃收集管。5.4.1.5将离心柱置于新的收集管中-加509缓冲液AW2，14000/min离心3min，充收集管。5.4.1.6将离心柱置于火菌的1.55mL离心管中，加人200L缓冲液AE室温孵育1min.8000r/min离心min，离心所得DNA于一20
冰箱保存备用。
5.4.2PCR扩增
5.4.2.1PCR扩增体系
总体积为25μL。模板DNA2上下游引物（10mol/L）各0.5μL，dNTPs2μL,MgCl，2.5uL10×缓冲液2.5μLTaq酶（5U/mL）0.2l.补充灭菌水至25L5.4.2.2PCR扩增条件
95℃预变性1min；94℃变性50s，68℃退火1min.68℃延伸1min35个循环：72℃延伸7min5.4.2.3电泳
15%琼脂
用1XTAE电泳缓冲液配制
糖电泳凝胶·制胶。在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面没过胶面。取10μL产物与2μL6
6加样bzxZ.net
在1XTAE缓冲液中3V/cm-4
像系统分析。
5.4.3对照
冲液混合，加样于含溴化乙链的1.5%琼脂糖凝胶中。/cm电泳约30min，当藻酚监到达底部时停止电泳，用凝胶成检测过程中分别设阳性对照和空自对照。阻性对照为并殖吸虫的囊坳或成虫，空白对照为灭菌水。5.4.4PCR结果判定
PCR扩增并殖吸虫囊蜘，扩增片段约为520bp（包括102bp的5.8S序列，ITS2全序列和53bp的28S序列）。空白对照未出现扩增条带，阳性对照出现预期大小的特征条带，满足条件者，可进行样品判定。待测样品出现520bp左右扩增条带，判为阳性：将阳性样品的PCR产物进行测序，序列与GenBank上的并殖吸虫ITS2序列进行比对。5.5结果判定
根据囊嫩的形态进行初步鉴定，对疑似并殖吸虫的囊需进一步分子生物学鉴定。结合形态学鉴定结果和序列分析结果，最终判定并殖吸虫虫种。3
-irKAoNhrKAca
SN/T3504—2013
A.1并殖吸虫分类
附录A
（资料性附录）
并殖吸虫概述
并殖吸虫隶属于扁形动物门（Platyhelminthes）、吸虫纲（Trematoda）、复殖目（Digenea）并殖科（Paragonimidae）、并殖吸虫属（Paragonimus）。目前世界上报道的并殖吸虫有5o多种（包括同种异名、亚种及变种），中国报道有32种。公认的对人体致病的有8种：卫氏并殖吸虫（Paragonimuswestermani）、斯氏并殖吸虫（Paragonimusskrjabini）、宫崎并殖吸虫（Paragonimusmiyazakii）、异盘并殖吸虫（ParagomimusHeterotremus）、非洲并殖吸虫（ParagoninusAfricanus）、双侧宫并殖吸虫（Para-goninusuterobilateralis）、墨西哥并殖吸虫（Paragonimusmericanus），克氏并殖吸虫（Paragonimuskellicotti)。
A.2并殖吸虫分布
并殖吸虫是世界性分布的寄生虫，主要分布在中国、日本、朝鲜、俄罗斯、菲律宾、马来西亚、印度、泰国以及非洲、南美洲。中国分布丁山东、江苏、安徽、江西、浙江、福建、广东、河南、湖北、湖南、四川、贵州、广西、云南、台湾、甘肃、陕西、山西、河北、辽宁、吉林、黑龙江等26个省、市、白治区，西藏、新疆、内蒙古、青海、宁夏未见报道。中间宿主分布在山区、丘陵的小溪小河中。A.3生活史
卫氏并殖吸虫虫卵入水后，在适宜条件下约经3周左右发育成熟并孵出毛蚜。毛蝴在水中活动，如遇第中间宿主川卷螺.则侵人螺体，经过胞坳、母雷蝴、子雷坳的发育和无性增殖阶段，最后形成许多成熟的尾蜘从螺体逸出后，侵人第二中间宿主淡水蟹或站，或随螺体一起被吞人第二中间宿主体内形成囊蜘。当终宿主哺乳动物或人食人了含有囊蜘类，囊蜘在小肠内幼虫脱囊而出，经过1周～3周移行后，穿过腩经胸腔进入肺。自囊坳进入终宿主到在肺成熟产卵，约需2个多月。虫体在宿主体内存活的期限与宿主体内寄居条件有关。卫氏并殖吸虫在人体一般可存活10年，记载有20年或更长。并殖吸虫每天产卵的数量的波动范围大，有报道可达到2000025000个。4
-iiKAoNirKAca
B.1人工消化液的配制
胃蛋白酶
浓盐酸
搅拌溶解，现配现用。
附录B
（规范性附录）
试剂的配制
1000mL
B.2Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE)的配制B.2.150×TAE的配制
三（羟甲基)氨基甲烷(Tris碱）冰乙酸
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
加水定容至1000mL，混勾至4℃保存备用。使用前作50倍稀释。1×TAE使用液的配制
50XTAE
加水定容至1000mL，混勾备用
10mg/mL溴化乙锭（EB）的配制
加水定容至100mL，磁力搅拌至完全溶解，室温避光保存B.41.5%琼脂糖凝胶的配制
琼脂糖
SN/T3504—2013
加1XTAE定容至100mL，完全融化后，溶液冷却至60℃，加10mg/mLEB5αL（终浓度0.5ug/mL），轻轻混匀后，倒板B.5
6×加样缓冲液的配制
溴酚蓝
加水至100mL。
置4℃保存备用。
irKAoNrKAca
SN/T3504—2013
口暖盘
腰吸盘一
卫氏并殖吸虫
中层囊壁
排泄囊
团山并殖吸虫
附录C
（资料性附录）
并殖吸虫囊蝴模式图及实物图
口吸盘
腹吸盘
排泄囊
福建并殖吸虫
股吸盘
并殖吸虫模式图2
斯氏狸殖吸虫
口吸盘
2)http://pathobio.sdu.edu.cn/sdjsc/parepics/peragonimus%20westermani.html.6
外层瑟壁
内层囊壁
-排泄囊
云南并殖吸虫
rkAoNrKAca
图C.2卫氏并殖吸虫囊实物图（10×10倍）图C.3斯氏并殖吸虫囊蝴实物图（10×10倍）SN/T3504—2013
SN/T3504—2013
参考文献
[i]Blair D,Agatsuma T,Watanobe F,et al.Geographical genetic structure within the humanlung fluke.Paragonimus westerinani,dercetcd from DNA sequencesLJ.Parasitology,1997.115:411-417.
Bowles.j.,Blair.d.&.Memanus,d.p..Amolecular phylogeny ofthehuman schistosomes［2]
JI.MolecularPhylogeneticsandEvolution,1995.4(2):1o3109._3]SugiyanaH,MorishimaY,Kameoka Yetal,Polymerase chain reaction(PCR)basedmolecular discrirnination betwecn Paragonimus westermani and P.mniyazakil at the rnelaeercarial stageLJ_.Mol Cell Probes,2002,16(3):231-236.［4]吴观陵.人休寄生虫学.3版[M].北京：人民生出版社，2005
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甲壳类水产品中并殖吸虫囊检疫技术规范
Quarantine protocol for metacercaria of Paragonimus in crustaceans2013-03-01发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-09-16实施
本标准按照GB/T1.-2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3504—2013
本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、广西大学。
本标准主要起草人：李树清、陈韶红、黄维义、张永年、陈志飞、李雯雯、王巧全、张强、王艳、李健、常正山、陈盈。
1范围
甲壳类水产品中并殖吸虫囊检疫技术规范
本标准规定了并殖吸虫囊坳的形态学鉴定和PCR检测方法。SN/T3504—2013
本标准适用于蟹、虾等甲壳类水产品中并殖吸虫囊蚜的检疫、流行病学调查和监测。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法8出人境动物检疫采样
GB/T18088
3概述
并殖吸虫俗称肺吸虫·主要寄生于人、犬、猫、鼠等哺乳动物的肺内。人因食人生的、未煮熟的含有并殖吸虫囊蚜的蟹类、和沼虾等水产品而感染。并殖吸虫的分类、分布及生活史参见附录A。4
设备和材料
仪器和器材
生物显微镜。
体视显微镜。
PCR扩增仪。
电泳仪。
凝胶成像系统。
网筛（10目，40目）
玻璃珠（425μm~600μm）。
试剂和溶液
Taq酶(5U/μL)。
2.5mmol/LdNTP。
25mmol/LMgClz。
10XPCR缓冲液（无Mg+）。
分子量指示物：100bp2000bpDNAmarkcr。水（符合GB/T6682中一级水的规定）。人工消化液、Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）、琼脂糖凝胶、6X加样缓冲液（配制见附录B）。SN/T3504—2013
4.3引物
扩增并殖吸虫核糖体DNA第二内转录间隔区（ITS2)引物序列为：F游引物3S:5GGTACCGGTGGATCACTCGGCTCGTG3F游I物A28:5-GGGATCCTGGTTAGT TTCTTTTCCTCCGC-35检验步骤
5.1样品采集
临床上采集的样品为溪蟹、站和沼虾等中壳类水产品采样比例按照GB/T18088执行。5.2样品处理
5.2.1捣碎法
为保证囊的完整性，推荐使用竹筒和竹棒（或其他类似替代品）捣碎样品，用生理盐水清洗，用10目网筛过滤，除去粗蟹壳。滤液再用401网筛过滤滤液置于锥形量简内，加水至量简的最人刻度处，沉淀洗涤至水清，全部沉渣吸人玻璃平压，在体视显微镜下，收集囊蜘，用生物显微镜按照5.3进行形态鉴定。
5.2.2消化法
样品量多时，可使用消化法。将样品用竹筒和竹棒降移入烧杯中，按照样品与人工消化液1：5的比例加入消化液，于37℃消化至无可免的肉组织。消化后的悬液用10目网筛过滤，除去粗蟹壳。滤液再用40目网筛过滤，滤液置于锥形量筒内，加水至量筒的最大刻度处，沉淀洗涤全水清。全部沉渣吸入玻璃平皿，在体视显微镜下，收集囊勉-用生物显微镜按照5.3进行形态鉴定。5.2.3囊保存
鉴定后的部分囊坳保存于75酒精中或于少量生理盐水巾
按5.4.1提取DNA，
5.3并殖吸虫囊蝴形态鉴定
并殖吸虫囊蝴一般呈球形或近球形通常速冻，另取部分形态一致的囊坳有2层囊壁，但因虫种不同，可有3层囊壁或仅1层囊壁。后尾坳折登卷曲在囊内，能看见充满黑色颗粒的排泄囊和两侧弯曲的肠管。口吸盘有时可见到，而腹吸盘则常被排泄囊所遮盖，后尾坳与囊壁间可有明显的空隙，也可无空隙。不同种的并殖吸虫衰坳大小有差异，如卫氏并殖吸虫小囊蜘直径为320um~360m，人囊蚜直径为376um~400m。斯氏并殖吸虫囊蜘，直径为400um左右。并殖吸虫囊坳模式图及实物图参见附录C。由于并殖吸虫种类多，囊蜘形态相似，仪凭囊蚜形态很难准确鉴定并殖吸虫虫种。因此，需要结合分子生物学方法进一步鉴定虫种。
5.4并殖吸虫囊蝴分子生物学鉴定5.4.1样品DNA提取
5.4.1.1DNA提取方法可选用等效商品化试剂盒，下面以QIAGENI公司的DNA抽提试剂盒使用QIAGEN公司的DNA试剂盒进行描述只是为了叙述方便，并不代表推荐QIAGEN的产品，标准的使用人可以使用其他公司的同类产品，2
TrKAONKAca
SN/T3504—2013
(DNeasyBlood&.Tissuekit)进行DNA提取。取主要形态特征一致的囊坳1个～10个放人1.5ml离心管中，加人100LPBS和少量玻璃珠振荡5min10min，再加人蛋白酶K（600Mau/mL，活力单位/mL)20uL与ATL缓冲液180μL,56℃消化1h3h。期间不时振荡，至囊充分裂解。5.4.1.2消化完全后，涡旋振荡15s，加200uL缓冲液AI，立即涡旋振荡混匀，再加入200μL乙醇（96%~100%），涡旋振荡混匀。5.4.1.3将离心柱置于收集管上：将上一步的混合物吸入离心柱中，8000r/min离心1min，弃收集管。
5.4.1.4将离心柱置于新的收集管中，加500l缓冲液AW1，8000r/min离心1min，弃收集管。5.4.1.5将离心柱置于新的收集管中-加509缓冲液AW2，14000/min离心3min，充收集管。5.4.1.6将离心柱置于火菌的1.55mL离心管中，加人200L缓冲液AE室温孵育1min.8000r/min离心min，离心所得DNA于一20
冰箱保存备用。
5.4.2PCR扩增
5.4.2.1PCR扩增体系
总体积为25μL。模板DNA2上下游引物（10mol/L）各0.5μL，dNTPs2μL,MgCl，2.5uL10×缓冲液2.5μLTaq酶（5U/mL）0.2l.补充灭菌水至25L5.4.2.2PCR扩增条件
95℃预变性1min；94℃变性50s，68℃退火1min.68℃延伸1min35个循环：72℃延伸7min5.4.2.3电泳
15%琼脂
用1XTAE电泳缓冲液配制
糖电泳凝胶·制胶。在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面没过胶面。取10μL产物与2μL6
6加样bzxZ.net
在1XTAE缓冲液中3V/cm-4
像系统分析。
5.4.3对照
冲液混合，加样于含溴化乙链的1.5%琼脂糖凝胶中。/cm电泳约30min，当藻酚监到达底部时停止电泳，用凝胶成检测过程中分别设阳性对照和空自对照。阻性对照为并殖吸虫的囊坳或成虫，空白对照为灭菌水。5.4.4PCR结果判定
PCR扩增并殖吸虫囊蜘，扩增片段约为520bp（包括102bp的5.8S序列，ITS2全序列和53bp的28S序列）。空白对照未出现扩增条带，阳性对照出现预期大小的特征条带，满足条件者，可进行样品判定。待测样品出现520bp左右扩增条带，判为阳性：将阳性样品的PCR产物进行测序，序列与GenBank上的并殖吸虫ITS2序列进行比对。5.5结果判定
根据囊嫩的形态进行初步鉴定，对疑似并殖吸虫的囊需进一步分子生物学鉴定。结合形态学鉴定结果和序列分析结果，最终判定并殖吸虫虫种。3
-irKAoNhrKAca
SN/T3504—2013
A.1并殖吸虫分类
附录A
（资料性附录）
并殖吸虫概述
并殖吸虫隶属于扁形动物门（Platyhelminthes）、吸虫纲（Trematoda）、复殖目（Digenea）并殖科（Paragonimidae）、并殖吸虫属（Paragonimus）。目前世界上报道的并殖吸虫有5o多种（包括同种异名、亚种及变种），中国报道有32种。公认的对人体致病的有8种：卫氏并殖吸虫（Paragonimuswestermani）、斯氏并殖吸虫（Paragonimusskrjabini）、宫崎并殖吸虫（Paragonimusmiyazakii）、异盘并殖吸虫（ParagomimusHeterotremus）、非洲并殖吸虫（ParagoninusAfricanus）、双侧宫并殖吸虫（Para-goninusuterobilateralis）、墨西哥并殖吸虫（Paragonimusmericanus），克氏并殖吸虫（Paragonimuskellicotti)。
A.2并殖吸虫分布
并殖吸虫是世界性分布的寄生虫，主要分布在中国、日本、朝鲜、俄罗斯、菲律宾、马来西亚、印度、泰国以及非洲、南美洲。中国分布丁山东、江苏、安徽、江西、浙江、福建、广东、河南、湖北、湖南、四川、贵州、广西、云南、台湾、甘肃、陕西、山西、河北、辽宁、吉林、黑龙江等26个省、市、白治区，西藏、新疆、内蒙古、青海、宁夏未见报道。中间宿主分布在山区、丘陵的小溪小河中。A.3生活史
卫氏并殖吸虫虫卵入水后，在适宜条件下约经3周左右发育成熟并孵出毛蚜。毛蝴在水中活动，如遇第中间宿主川卷螺.则侵人螺体，经过胞坳、母雷蝴、子雷坳的发育和无性增殖阶段，最后形成许多成熟的尾蜘从螺体逸出后，侵人第二中间宿主淡水蟹或站，或随螺体一起被吞人第二中间宿主体内形成囊蜘。当终宿主哺乳动物或人食人了含有囊蜘类，囊蜘在小肠内幼虫脱囊而出，经过1周～3周移行后，穿过腩经胸腔进入肺。自囊坳进入终宿主到在肺成熟产卵，约需2个多月。虫体在宿主体内存活的期限与宿主体内寄居条件有关。卫氏并殖吸虫在人体一般可存活10年，记载有20年或更长。并殖吸虫每天产卵的数量的波动范围大，有报道可达到2000025000个。4
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B.1人工消化液的配制
胃蛋白酶
浓盐酸
搅拌溶解，现配现用。
附录B
（规范性附录）
试剂的配制
1000mL
B.2Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE)的配制B.2.150×TAE的配制
三（羟甲基)氨基甲烷(Tris碱）冰乙酸
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
加水定容至1000mL，混勾至4℃保存备用。使用前作50倍稀释。1×TAE使用液的配制
50XTAE
加水定容至1000mL，混勾备用
10mg/mL溴化乙锭（EB）的配制
加水定容至100mL，磁力搅拌至完全溶解，室温避光保存B.41.5%琼脂糖凝胶的配制
琼脂糖
SN/T3504—2013
加1XTAE定容至100mL，完全融化后，溶液冷却至60℃，加10mg/mLEB5αL（终浓度0.5ug/mL），轻轻混匀后，倒板B.5
6×加样缓冲液的配制
溴酚蓝
加水至100mL。
置4℃保存备用。
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SN/T3504—2013
口暖盘
腰吸盘一
卫氏并殖吸虫
中层囊壁
排泄囊
团山并殖吸虫
附录C
（资料性附录）
并殖吸虫囊蝴模式图及实物图
口吸盘
腹吸盘
排泄囊
福建并殖吸虫
股吸盘
并殖吸虫模式图2
斯氏狸殖吸虫
口吸盘
2)http://pathobio.sdu.edu.cn/sdjsc/parepics/peragonimus%20westermani.html.6
外层瑟壁
内层囊壁
-排泄囊
云南并殖吸虫
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图C.2卫氏并殖吸虫囊实物图（10×10倍）图C.3斯氏并殖吸虫囊蝴实物图（10×10倍）SN/T3504—2013
SN/T3504—2013
参考文献
[i]Blair D,Agatsuma T,Watanobe F,et al.Geographical genetic structure within the humanlung fluke.Paragonimus westerinani,dercetcd from DNA sequencesLJ.Parasitology,1997.115:411-417.
Bowles.j.,Blair.d.&.Memanus,d.p..Amolecular phylogeny ofthehuman schistosomes［2]
JI.MolecularPhylogeneticsandEvolution,1995.4(2):1o3109._3]SugiyanaH,MorishimaY,Kameoka Yetal,Polymerase chain reaction(PCR)basedmolecular discrirnination betwecn Paragonimus westermani and P.mniyazakil at the rnelaeercarial stageLJ_.Mol Cell Probes,2002,16(3):231-236.［4]吴观陵.人休寄生虫学.3版[M].北京：人民生出版社，2005
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