SN/T 3558-2013
基本信息
标准号： SN/T 3558-2013
中文名称：马尔堡病毒RT-PCR和实时荧光 RT-PCR检测方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：1941562
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3558-2013.RT-PCR and real time RT-PCR detection methods of Marburg virus.
1范围
SN/T 3558规定了国境口岸马尔堡出血热检测的生物安全要求,标本的采集、运输和保存标本的处理,马尔堡病毒RT-PCR检测和实时荧光RT-PCR检测方法。
SN/T 3558适用于国境口岸入出境人员携带马尔堡病毒的分子生物学检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB19489实验室生物安全通用要求
人间传染的病原微生物名录(卫生部)
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
RT-PCR:反转录-聚合酶链反应
实时荧光RT- PCR:实时荧光反转录聚合酶链反应
Ct值:每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数
RNA:核糖核酸
FAM:FAM荧光染料,一种荧光报告基团
4术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
4.1马尔堡出血热Marburg hemorrhagic fever;MHF
由马尔堡病毒(MarburgVirus)引起的、以急性发热伴有严重出血为主要临床表现的传染性疾病，经密切接触传播,传染性强,病死率高。由于马尔堡病毒来自于非洲绿猴并主要在非洲流行，又被称为青猴病和非洲出血热。
1范围
SN/T 3558规定了国境口岸马尔堡出血热检测的生物安全要求,标本的采集、运输和保存标本的处理,马尔堡病毒RT-PCR检测和实时荧光RT-PCR检测方法。
SN/T 3558适用于国境口岸入出境人员携带马尔堡病毒的分子生物学检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB19489实验室生物安全通用要求
人间传染的病原微生物名录(卫生部)
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
RT-PCR:反转录-聚合酶链反应
实时荧光RT- PCR:实时荧光反转录聚合酶链反应
Ct值:每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数
RNA:核糖核酸
FAM:FAM荧光染料,一种荧光报告基团
4术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
4.1马尔堡出血热Marburg hemorrhagic fever;MHF
由马尔堡病毒(MarburgVirus)引起的、以急性发热伴有严重出血为主要临床表现的传染性疾病，经密切接触传播,传染性强,病死率高。由于马尔堡病毒来自于非洲绿猴并主要在非洲流行，又被称为青猴病和非洲出血热。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3558—2013
马尔堡病毒RT-PCR和实时荧光
RT-PCR检测方法
RT-PCR and real time RT-PCR detection methods of Marburg virus2013-03-01发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-09-16实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3558—2013
本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中国科学院武汉病毒研究所本标准主要起草人：洪烨、师永霞、袁志明、郑、相大鹏、黄代、李小波、黄吉城、幸芦琴、郭波旋、钟玉清、李燕。
1范围
马尔堡病毒RT-PCR和实时荧光
RT-PCR检测方法
SN/T3558—2013
本标准规定了国境口岸马尔堡出血热检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理，马尔堡病毒RT-PCR检测和实时荧光RT-PCR检测方法，本标准适用于国境口岸入出境人员携带马尔堡病毒的分子生物学检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（合GB19489实验室生物安全通用要求人问传染的病原微生物名录（卫生部3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
RT-PCR：反转录-聚合酶链反应
实时荧光RT-PCR：实时荧光反转Ct值：每个反应管内的荧光信号RNA：核糖核酸
FAM:FAM荧光染料：一种荧光报告4术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文所有的修
改单）适用于本文件。
酶链反
的阅值时所经历的循环数
Marburg hemorrhagic fever:MHF马尔堡出血热
由马尔保病毒（MarburgVirus)引起的、以急性发热伴有严重出血为主要临床表现的传染性疾病经密切接触传播，传染性强，病死率高。山于马尔堡病毒来自于非洲绿猴并主要在非洲流行，又被称为青猴病和非洲出血热，
Marburgvirus
马尔堡病毒
属丝状病毒科，病毒基因组为单股负链RNA，长约19kb，编码7种病毒蛋白，包括N蛋白（NP）、病毒蛋白35（VP35）、病毒蛋白30（VP30）、病毒蛋白24（VP24）、糖蛋白4（gP4）、RNA依赖的RNA聚合酶主要成分糖蛋白7（gp7)和次要成分病毒蛋白40（VP40）。5生物安全要求
按照GB19489和人间传染的病原微生物名录》的要求，马尔堡病毒相关材料的生物安全要求SN/T3558-2013
如下：
马尔堡病毒相关的病毒培养和动物感染实验操作应在生物安全IV级（BSL-4或ABSL4)实验室内进行；
马尔堡病毒相关的未经培养的感染性材料的操作应在生物安全Ⅲ级（BSI-3)实验室内进行；马尔堡病毒相关的灭活材料的操作应在生物安全IⅡ级（BSI-2)实验室内进行：马尔堡病毒感染材料的运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。6人体血清标本的采集、运输和保存无菌采集疑似病例发病3天内静脉血3mL~5ml，室温静置30min使其凝固，500g离心10min，收集血清于2mL无菌螺门塑料管中，用耐低温油性记号笔记上编号，低温送到实验室检测。如24h内不能送到实验室，将血清置于一70℃保存。7血清标本的处理
血清标本直接进行分子生物学核酸的提取，如24h不能及时检测应存放在一70℃冰箱。8马尔堡病毒的RT-PCR检测
8.1主要仪器
本方法使用的主要仪器如下：
PCR扩增仪：
一千分之一天平，
超净工作台；
Ⅱ级生物安全柜；
高压灭菌锅；
低温高速离心机：最大离心力20000g；电泳仪；
凝胶成像分析系统；
旋涡振荡器：
冰箱：4℃、-20℃和-70℃
移液器：10μl.20μL、100μl.200μL和1mL：恒温水浴锅。
8.2主要试剂
除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。本方法使用的主要试剂如下：核酸提取试剂：用美国Qiagen公司QIAampViralRNAKit提取病毒核酸；RT-PCR试剂：美国Qiagen公司OnestepRT-PCRkiti无RNA酶的DEPC水；
1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方使本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品：2
TYKAONiKAca
SN/T3558—2013
RT-PCR检测的引物：上游引物MBGV-FP（5*-CGATGGGCTTTCAGGACAGG-3'）和下游引物MBGV-RP（5-CACGAGGGTTTTGACCTTGAAT-3），预期扩增片段为190bP；电泳缓冲液（50×TAE）：称取242gTris碱，溶于700mL的重蒸水中，加人100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）57.1mL冰乙酸，至充分溶解后用水定容至1L，室温储存：使用前用重蒸水稀释至1×TAE进行倒胶和DNA电泳。
—10mg/mL溴化乙锭（EB）：在100mL水中加人1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。使用浓度为0.5ug/mI.。8.3检测步骤
8.3.1核酸提取
吸取140μL血清样本加人溶解的560μl.裂解液AVL。8.3.1.2脉冲混匀15s，置于室温10min。短暂离心，加入560L乙醇（96%~100%）脉冲混勾15s。8.3.1.3
短暂离心。
8.3.1.5将QIAamp旋转柱置于2mL收集管中。吸取8.3.1.3中溶液630μL转移至旋转柱上，6000g离心1min，将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管8.3.1.6打开旋转柱盖，重复8.3.1.5。8.3.1.7打开旋转柱盖，加人500μL洗液AW1，盖紧盖子，6000g离心1min：将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。8.3.1.8打开旋转柱盖，加入500μL洗液AW2，盖紧盖子，20000g离心3min。将旋转柱放至干净的收集管上，20000g再离心1min。将旋转柱放至干净的1.5ml离心管上，丢弃包含过滤液的收集管。
打开旋转柱盖，加入60uL室温平衡的缓冲液AVE。8.3.1.9
盖紧盖子，空温放置1min。
8.3.1.116000g离心1min。
8.3.1.12收集滤出液，用于RT-PCR扩增。-20℃或-70℃储存RNA。8.3.2RT-PCR检测
8.3.2.1准备RT-PCR反应液，设50uL反应体系，每个待检标本反应液的组成为：5XRT-PCR缓冲液10μL.10mmol/LdNTP2μL,10μmol/LMBGV-FP5μL,10μmol/LMBGV-RP5μL,RT-PCREnzymemix2uL，无RNA酶的DEPC水21μL，RNA模板5μL同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为根据马尔堡病毒核昔酸序列体外转录的RNA片段：阴性对照模板为不含马尔堡病毒核酸的标本或无RNA酶的水。
8.3.2.2将PCR反应管置于PCR扩增仪上进行操作，RT-PCR反应程序为：50℃逆转录30min，95℃预变性15min；94℃变性1min，52℃复性1min，72℃延伸30s.35个循环72℃延伸10min：4℃。8.3.3凝胶电泳
扩增结束后，在5μL扩增产物中加1μL6×DNA上样缓冲液，用含0.5g/mL溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物.用凝胶成像系统照相记录结果。8.4结果判断
8.4.1质量控制
反应结果应同时符合以下2个条件：3
riKAoNrKAca
SN/T3558—2013
阴性对照未出现特异性条带；
阳性对照出现预期190bp大小的扩增条带。8.4.2结果分析
在实验结果有效情况下，如待测样品出现预期190bp大小的扩增条带，则可判断待测样品马尔堡病毒核酸PCR阳性，判断为阳性结果的样品可通过复检和核酸序列测定进行确认；如待测样品中未出现预期大小的扩增产物.则可判断待测样品马尔堡病毒核酸PCR阴性。8.5测序
对于首发病例，应将PCR扩增产物进行序列测定，确定其碱基组成布的马尔堡病毒序列的同源性，判断9
实时荧光RT-PCR检测
9.1主要仪器
本方法使用的主要仪器如下：
荧光定量PCR仪：
超净工作台；
Ⅱ级生物安全柜；
高压灭菌锅；
低温高速离心机：最大离心
旋涡振荡器；
冰箱：4℃、-20℃和-7
广增产物是否为马尔堡病毒核酸o
移液器：10mL、20μL、100ML
9.2主要试剂
本方法使用的主要试剂如下：
使用BLAST分析其与已公
核酸提取试剂：用美国Qiagen公司QIAampViralRNAKit提取病毒核酸：实时荧光RT-PCR通用试剂：Ag-Path-IDiMOnesiepRT-PCRKit，美国Anbion公司产品?OnestepRT-PCRkit，美国Qiagen公司产品；无RNA酶的DEPC水；
引物和探针：引物和探针序列见表12）由指定单位提供，给出这一一信息是为了方便木标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。4
KAOiKAca
引物/探针名称
mnp-Prohe
表1马尔堡病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和探针序列（5*-3）
CATCTGATGGGATTCACACTGAG
TGGGAGGTACACCTGTCCTGAAbzxZ.net
FAM-aaa+Gtt+Get+Gat+Te+Ccet-BHQIGGTCAAACTAGATTCTCAGGACTTC
GTCACCCCTGAATCAGTTTTTT
FAM TGTGAAAACAGTTCTCGAGTTC
注：等效的引物和探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用MRA
“Mp为TagMan-LNA探针，探针序列中前面带-\号的盛基表示LNA修饰碱基。9.3
核酸提取
见8.3.1。
实时荧光RT-PCR检测
靶目标为GP基因的实时荧光RT-PCR检测9.4.1.1加样
使用AgPath-IDTMOnestepR
的组成为：2XRT-PCR缓冲液10
PCRkit进
行体系配置，设
25XRT-PCREnzymeMix0.8
3模板
为根据马尔堡病毒核苷酸序列体外转无RNA酶的水。
实时荧光RT-PCR扩增反
SN/T35582013
扩增片段
GP基因片段，预期
扩增片段为108bp
NP基因片段，预期
扩增片段为80bp
20uL反应体系，每个待检标本反应液Mfolμloumol/L.Mro1ul5pmol/LMp1uL、RNA6.2
同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板的RNA片段，阴性对照模板为不含马尔堡病毒核酸的标本或在不同的荧光定量PCR仪上.TagMan探针实时荧装光RTPcR的反应条件略有不同，以RocheLightCycler或ABI7900HT荧光定量PCR仪为95℃10min;95℃5s.60℃20s收集装光求设置具体的反应条件。
寸荧光RTPCR检测扩增程序为：50℃10min，例，实时
号），45个
靶目标为NP基因的实时荧光RT-PCR检测9.4.2
9.4.2.1加样
如使用其他仪器，应根据其他仪器的要使用OnestepRT-PCRkit进行体系配置，设25ul.反应体系，每个待检标本反应液的组成为：5×RT-PCR缓冲液5μL、10μmol/Lmnp-F1μL、1oμmol/LmnpR1μL、5μmol/LmnpProbe0.5μL、RT-PCREnzymeMix1μL、模板RNA3μL，重蒸水13.5μL。同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为根据马尔堡病毒核酸序列体外转录的RNA片段，阴性对照模板为不含马尔堡病毒核酸的标本或无RNA酶的水。
9.4.2.2实时荧光RT-PCR扩增反应在不同的荧光定量PCR仪上，TagMan探针实时荧光RT-PCR的反应条件略有不同。以Roche5
riKAoNhiKAca
SN/T3558—2013
LightCycler或BioRadDNAEngineOpticon为例，实时荧光RT-PCR检测扩增程序为：5030min95℃15min；95℃15s，60℃30s（收集荧光信号），45个循环。如使用其他仪器，应根据其他仪器的要求设置具体的反应条件。
9.5结果分析
9.5.1值确定
阈值确定的方法对所有的样品都是统一的，一般是以荧光PCR反应的前3个～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号：以本底信号标准差的10倍作为荧光值，以样品扩增产生的荧光信号达到灾光值时所对应的循环数为循环阅值（Ct值）。9.5.2
质量控制
反应结果应同时符合以下2个条件：阴性对照无扩增曲线：
阳性对照Ct值<35并有明显扩增曲线。9.5.3结果判定
根据以下条件进行结果判定：
无明显扩增曲线，判断为马尔堡病毒荧光RT-PCR检测阴性；有明显扩增曲线，且Ct值≤40，初步判断为马尔堡病毒荧光RT-PCR检测阳性：一有明显扩增曲线，且40Ct值≤45的标本应重做，重做后只要出现扩增曲线，则判断为马尔堡病毒荧光RTPCR检测阳性.否则为阴性9.5.3.2阳性标本的确认：荧光RTPCR结果阳性的标本可进步进行RT-PCR扩增。对于首发病例，应对扩增片断进行测序和序列比对,确认是否为马尔堡病毒核酸阳性，6
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马尔堡病毒RT-PCR和实时荧光
RT-PCR检测方法
RT-PCR and real time RT-PCR detection methods of Marburg virus2013-03-01发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-09-16实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3558—2013
本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中国科学院武汉病毒研究所本标准主要起草人：洪烨、师永霞、袁志明、郑、相大鹏、黄代、李小波、黄吉城、幸芦琴、郭波旋、钟玉清、李燕。
1范围
马尔堡病毒RT-PCR和实时荧光
RT-PCR检测方法
SN/T3558—2013
本标准规定了国境口岸马尔堡出血热检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理，马尔堡病毒RT-PCR检测和实时荧光RT-PCR检测方法，本标准适用于国境口岸入出境人员携带马尔堡病毒的分子生物学检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（合GB19489实验室生物安全通用要求人问传染的病原微生物名录（卫生部3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
RT-PCR：反转录-聚合酶链反应
实时荧光RT-PCR：实时荧光反转Ct值：每个反应管内的荧光信号RNA：核糖核酸
FAM:FAM荧光染料：一种荧光报告4术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文所有的修
改单）适用于本文件。
酶链反
的阅值时所经历的循环数
Marburg hemorrhagic fever:MHF马尔堡出血热
由马尔保病毒（MarburgVirus)引起的、以急性发热伴有严重出血为主要临床表现的传染性疾病经密切接触传播，传染性强，病死率高。山于马尔堡病毒来自于非洲绿猴并主要在非洲流行，又被称为青猴病和非洲出血热，
Marburgvirus
马尔堡病毒
属丝状病毒科，病毒基因组为单股负链RNA，长约19kb，编码7种病毒蛋白，包括N蛋白（NP）、病毒蛋白35（VP35）、病毒蛋白30（VP30）、病毒蛋白24（VP24）、糖蛋白4（gP4）、RNA依赖的RNA聚合酶主要成分糖蛋白7（gp7)和次要成分病毒蛋白40（VP40）。5生物安全要求
按照GB19489和人间传染的病原微生物名录》的要求，马尔堡病毒相关材料的生物安全要求SN/T3558-2013
如下：
马尔堡病毒相关的病毒培养和动物感染实验操作应在生物安全IV级（BSL-4或ABSL4)实验室内进行；
马尔堡病毒相关的未经培养的感染性材料的操作应在生物安全Ⅲ级（BSI-3)实验室内进行；马尔堡病毒相关的灭活材料的操作应在生物安全IⅡ级（BSI-2)实验室内进行：马尔堡病毒感染材料的运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。6人体血清标本的采集、运输和保存无菌采集疑似病例发病3天内静脉血3mL~5ml，室温静置30min使其凝固，500g离心10min，收集血清于2mL无菌螺门塑料管中，用耐低温油性记号笔记上编号，低温送到实验室检测。如24h内不能送到实验室，将血清置于一70℃保存。7血清标本的处理
血清标本直接进行分子生物学核酸的提取，如24h不能及时检测应存放在一70℃冰箱。8马尔堡病毒的RT-PCR检测
8.1主要仪器
本方法使用的主要仪器如下：
PCR扩增仪：
一千分之一天平，
超净工作台；
Ⅱ级生物安全柜；
高压灭菌锅；
低温高速离心机：最大离心力20000g；电泳仪；
凝胶成像分析系统；
旋涡振荡器：
冰箱：4℃、-20℃和-70℃
移液器：10μl.20μL、100μl.200μL和1mL：恒温水浴锅。
8.2主要试剂
除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。本方法使用的主要试剂如下：核酸提取试剂：用美国Qiagen公司QIAampViralRNAKit提取病毒核酸；RT-PCR试剂：美国Qiagen公司OnestepRT-PCRkiti无RNA酶的DEPC水；
1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方使本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品：2
TYKAONiKAca
SN/T3558—2013
RT-PCR检测的引物：上游引物MBGV-FP（5*-CGATGGGCTTTCAGGACAGG-3'）和下游引物MBGV-RP（5-CACGAGGGTTTTGACCTTGAAT-3），预期扩增片段为190bP；电泳缓冲液（50×TAE）：称取242gTris碱，溶于700mL的重蒸水中，加人100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）57.1mL冰乙酸，至充分溶解后用水定容至1L，室温储存：使用前用重蒸水稀释至1×TAE进行倒胶和DNA电泳。
—10mg/mL溴化乙锭（EB）：在100mL水中加人1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。使用浓度为0.5ug/mI.。8.3检测步骤
8.3.1核酸提取
吸取140μL血清样本加人溶解的560μl.裂解液AVL。8.3.1.2脉冲混匀15s，置于室温10min。短暂离心，加入560L乙醇（96%~100%）脉冲混勾15s。8.3.1.3
短暂离心。
8.3.1.5将QIAamp旋转柱置于2mL收集管中。吸取8.3.1.3中溶液630μL转移至旋转柱上，6000g离心1min，将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管8.3.1.6打开旋转柱盖，重复8.3.1.5。8.3.1.7打开旋转柱盖，加人500μL洗液AW1，盖紧盖子，6000g离心1min：将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。8.3.1.8打开旋转柱盖，加入500μL洗液AW2，盖紧盖子，20000g离心3min。将旋转柱放至干净的收集管上，20000g再离心1min。将旋转柱放至干净的1.5ml离心管上，丢弃包含过滤液的收集管。
打开旋转柱盖，加入60uL室温平衡的缓冲液AVE。8.3.1.9
盖紧盖子，空温放置1min。
8.3.1.116000g离心1min。
8.3.1.12收集滤出液，用于RT-PCR扩增。-20℃或-70℃储存RNA。8.3.2RT-PCR检测
8.3.2.1准备RT-PCR反应液，设50uL反应体系，每个待检标本反应液的组成为：5XRT-PCR缓冲液10μL.10mmol/LdNTP2μL,10μmol/LMBGV-FP5μL,10μmol/LMBGV-RP5μL,RT-PCREnzymemix2uL，无RNA酶的DEPC水21μL，RNA模板5μL同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为根据马尔堡病毒核昔酸序列体外转录的RNA片段：阴性对照模板为不含马尔堡病毒核酸的标本或无RNA酶的水。
8.3.2.2将PCR反应管置于PCR扩增仪上进行操作，RT-PCR反应程序为：50℃逆转录30min，95℃预变性15min；94℃变性1min，52℃复性1min，72℃延伸30s.35个循环72℃延伸10min：4℃。8.3.3凝胶电泳
扩增结束后，在5μL扩增产物中加1μL6×DNA上样缓冲液，用含0.5g/mL溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物.用凝胶成像系统照相记录结果。8.4结果判断
8.4.1质量控制
反应结果应同时符合以下2个条件：3
riKAoNrKAca
SN/T3558—2013
阴性对照未出现特异性条带；
阳性对照出现预期190bp大小的扩增条带。8.4.2结果分析
在实验结果有效情况下，如待测样品出现预期190bp大小的扩增条带，则可判断待测样品马尔堡病毒核酸PCR阳性，判断为阳性结果的样品可通过复检和核酸序列测定进行确认；如待测样品中未出现预期大小的扩增产物.则可判断待测样品马尔堡病毒核酸PCR阴性。8.5测序
对于首发病例，应将PCR扩增产物进行序列测定，确定其碱基组成布的马尔堡病毒序列的同源性，判断9
实时荧光RT-PCR检测
9.1主要仪器
本方法使用的主要仪器如下：
荧光定量PCR仪：
超净工作台；
Ⅱ级生物安全柜；
高压灭菌锅；
低温高速离心机：最大离心
旋涡振荡器；
冰箱：4℃、-20℃和-7
广增产物是否为马尔堡病毒核酸o
移液器：10mL、20μL、100ML
9.2主要试剂
本方法使用的主要试剂如下：
使用BLAST分析其与已公
核酸提取试剂：用美国Qiagen公司QIAampViralRNAKit提取病毒核酸：实时荧光RT-PCR通用试剂：Ag-Path-IDiMOnesiepRT-PCRKit，美国Anbion公司产品?OnestepRT-PCRkit，美国Qiagen公司产品；无RNA酶的DEPC水；
引物和探针：引物和探针序列见表12）由指定单位提供，给出这一一信息是为了方便木标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。4
KAOiKAca
引物/探针名称
mnp-Prohe
表1马尔堡病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和探针序列（5*-3）
CATCTGATGGGATTCACACTGAG
TGGGAGGTACACCTGTCCTGAAbzxZ.net
FAM-aaa+Gtt+Get+Gat+Te+Ccet-BHQIGGTCAAACTAGATTCTCAGGACTTC
GTCACCCCTGAATCAGTTTTTT
FAM TGTGAAAACAGTTCTCGAGTTC
注：等效的引物和探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用MRA
“Mp为TagMan-LNA探针，探针序列中前面带-\号的盛基表示LNA修饰碱基。9.3
核酸提取
见8.3.1。
实时荧光RT-PCR检测
靶目标为GP基因的实时荧光RT-PCR检测9.4.1.1加样
使用AgPath-IDTMOnestepR
的组成为：2XRT-PCR缓冲液10
PCRkit进
行体系配置，设
25XRT-PCREnzymeMix0.8
3模板
为根据马尔堡病毒核苷酸序列体外转无RNA酶的水。
实时荧光RT-PCR扩增反
SN/T35582013
扩增片段
GP基因片段，预期
扩增片段为108bp
NP基因片段，预期
扩增片段为80bp
20uL反应体系，每个待检标本反应液Mfolμloumol/L.Mro1ul5pmol/LMp1uL、RNA6.2
同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板的RNA片段，阴性对照模板为不含马尔堡病毒核酸的标本或在不同的荧光定量PCR仪上.TagMan探针实时荧装光RTPcR的反应条件略有不同，以RocheLightCycler或ABI7900HT荧光定量PCR仪为95℃10min;95℃5s.60℃20s收集装光求设置具体的反应条件。
寸荧光RTPCR检测扩增程序为：50℃10min，例，实时
号），45个
靶目标为NP基因的实时荧光RT-PCR检测9.4.2
9.4.2.1加样
如使用其他仪器，应根据其他仪器的要使用OnestepRT-PCRkit进行体系配置，设25ul.反应体系，每个待检标本反应液的组成为：5×RT-PCR缓冲液5μL、10μmol/Lmnp-F1μL、1oμmol/LmnpR1μL、5μmol/LmnpProbe0.5μL、RT-PCREnzymeMix1μL、模板RNA3μL，重蒸水13.5μL。同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为根据马尔堡病毒核酸序列体外转录的RNA片段，阴性对照模板为不含马尔堡病毒核酸的标本或无RNA酶的水。
9.4.2.2实时荧光RT-PCR扩增反应在不同的荧光定量PCR仪上，TagMan探针实时荧光RT-PCR的反应条件略有不同。以Roche5
riKAoNhiKAca
SN/T3558—2013
LightCycler或BioRadDNAEngineOpticon为例，实时荧光RT-PCR检测扩增程序为：5030min95℃15min；95℃15s，60℃30s（收集荧光信号），45个循环。如使用其他仪器，应根据其他仪器的要求设置具体的反应条件。
9.5结果分析
9.5.1值确定
阈值确定的方法对所有的样品都是统一的，一般是以荧光PCR反应的前3个～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号：以本底信号标准差的10倍作为荧光值，以样品扩增产生的荧光信号达到灾光值时所对应的循环数为循环阅值（Ct值）。9.5.2
质量控制
反应结果应同时符合以下2个条件：阴性对照无扩增曲线：
阳性对照Ct值<35并有明显扩增曲线。9.5.3结果判定
根据以下条件进行结果判定：
无明显扩增曲线，判断为马尔堡病毒荧光RT-PCR检测阴性；有明显扩增曲线，且Ct值≤40，初步判断为马尔堡病毒荧光RT-PCR检测阳性：一有明显扩增曲线，且40Ct值≤45的标本应重做，重做后只要出现扩增曲线，则判断为马尔堡病毒荧光RTPCR检测阳性.否则为阴性9.5.3.2阳性标本的确认：荧光RTPCR结果阳性的标本可进步进行RT-PCR扩增。对于首发病例，应对扩增片断进行测序和序列比对,确认是否为马尔堡病毒核酸阳性，6
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