SN/T 3586-2013.Quarantine protocol for scrapie resistance gene genotyping.
1范围
SN/T 3586规定了羊痒病抗性基因型检测方法。
SN/T 3586适用于绵羊血液样本的羊痒病朊蛋白编码基因的分型。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
PRNP:1朊 蛋白编码基因( prion protein)
Real-Time PCR : Real-Time Polymerase Chain Reaction实时荧光定量 PCR
DNA :deoxyribonucleic acid脱 氧核糖核酸
4试验原理
羊痒病概述参见附录A。
引起羊痒病的病原朊蛋白是一种正常的唾液酸糖蛋白(PrP*)在二级结构发生改变后形成的异常蛋白。该病的发生与绵羊朊蛋白编码基因PRNP遗传多样性密切相关,主要表现在PRNP第136、154和171位密码子组成的PRNP基因型与绵羊对痒病的抗病性的联系。根据GenBank报道的PRNP序列,设计合成了3套特异性的引物和Taqman探针，借助实时荧光定量PCR检测体系及其之后的终点读板模式,对PRNP的第136、154和171位密码子进行检测,用来判定被检测羊是否含有传染性羊痒病抗性基因。
5试验材料
5.1试剂
5.1.1 各型绵羊PRNP标准品:136纯合子、154纯合子、171-1纯合子、171-2纯合子。
5.1.2基因扩增预混液:TaqmanUniversalPCRMasterMix或其他基因扩增预混液。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3586—2013
羊痒病抗性基因型检测方法
Quarantine protocol for scrapie resistance gene genotyping2013-08-30发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-03-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准出国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3586—2013
本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国烟台出人境检验检疫局。
本标准主要起草人董志珍、肖妍、栾慎顺、陈本龙、方绍庆。1范围
羊痒病抗性基因型检测方法
本标准规定了羊痒病抗性基因型检测方法。本标准适用于绵羊血液样本的羊痒病蛋白编码基因的分型。2规范性引用文件
SN/T3586—2013
下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
PRNP：1蛋白编码基因（prionprotein）Real-TimePCR：Real-TimePolymeraseChainReaction实时荧光定量PCRDNA：deoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸EDTA二钾盐.CH.KN,O
4试验原理
羊痒病概述参见附录A。免费标准bzxz.net
胺四乙酸钾盐
引起羊痒病的病原蛋白是种正常的睡液酸糖蛋白（PrP在级结构发生改变后形成的异常蛋白（PrP）。该病的发生与绵羊阮蛋白编码基因PRNP遗传多样性密切相关，主要表现在PRNP第136、154和171位密码子组成的PRNP基因型与绵羊对痒病的抗病性的联系。根据GcnBank报道的PRNP序列，设计合成了3套特异性的引物和Taqman探针，借助实时荧光定量PCR检测体系及其之后的终点读板模式，对PRNP的第136，154和171位密码子进行检测，用来判定被检测羊是否含有传染性羊痒病抗性基因。
5试验材料
5.1试剂
各型绵羊PRNP标准品：136纯合子、154纯合子，1711纯合子，171-2纯合子。基因扩增预混液：TagmanUniversalPCRMasterMix或其他基因扩增预混液。5.1.3
基因组DNA提取试剂盒。
50mg/mL的EDTA
双蒸水。符合GB/T6682的要求。5.1.6注射用水。
SN/T3586—2013
检测引物和探针，见表1。
检测引物和探针
引物和探针序列
上游引物：136-1：5”CTGCAGCTGGAGCAGTGGTA-3”136位密码子检测用
154位密码了检测用
171位密码子检测用
仪器和耗材
实时荧光定量PCR仪。
高速台式冷冻离心机。
恒温水浴锅。
生物安全柜。
涡旋振荡器。
下游引物：136-2：5-ACTTGGTTGGGGTAACGGTAC-3A型检测探针：136-A.5'-FAM-TCATGGCACTTCC-MGB-3V型检测操针136-A：5'-VIC-CTCATGACACTTCCMGB-3上游引物：154-1+5-GGCAATGACTATGAGGACCG-3下游引物：154-2.5*-GCACAAAGTTGTTCTGGTTAC-3R型检测探针：154-R：5*-FAM-ACTATCGTGAAAACAT-MGB3H型检测探针：154-H:5*-VIC-TACTATCATGAAAACATG-MGB-3L游引物：171-1.52-CCCAACCAAGTGTACTAC-3*下游引物：171-2：5?-TGACTGTGTGTTGCTTGACTG-3R型检测探针：171-R:5*-FAM-CCAGTGGATCGGTATA-MGB-3H型检测探针：171H:5*VIC-ACCAGTGGATCATTAT-MGB-3*Q型检测探针：171-Q：5-VICACCAGTGGATCAGTATA-MGB-3微量可调移液器及配套带滤芯吸头。冰箱（2℃～8℃，20℃，70℃三种）。荧光PCR管（板）及管盖（封口膜）。1.5mLEppendorf管
10mL真空灭菌采血管。
操作方法
样品采集
使用含有2mg/mL注人EDTA抗避剂的采血管，颈静脉采绵羊血2mL～5mL，密封后贴上标签，于保温箱中加冰、密封后以最快的方式运送到实验室。采集的样品在2℃～8℃条件下保存不应超过24h；若需长期保存，应放置于一70℃冰箱，冻融不超过3次。6.2
绵羊基因组DNA的提取
按照DVA抽提试剂盒操作说明要求提取基因组DNA作为模板。2
YKAOMIKAca
6.3荧光定量PCR反应体系
SN/T3586—2013
在反应混合物配置区进行。以各型绵羊PRNP标准品为阳性对照，以水为阴性对照。设n为被检样品总数，反应体系配制见表2。并将总样品反应组份涡旋，充分混勾，向每个荧光PCR管中各分装18μL，转移至样本处理区。
2荧光定量PCR反应体系
基因扩增预混液
上游引物
下游引物
FAM标记的探钊
VIC标记的探针
双蒸水
反应体系体积
6.4加样
贮存液浓度
10μmol/L
10μmol/L
10μmol/L
10μmol/L
每个样品反应组分用量/μL
总样本反应组分用量/μL
10×(n+2)
2x(n+2)
2x(n+2)
0.5×(n±2)
0.5×(n+2)
3×(n+2)
在样本处理区进行，在各设定的荧光PCR管中分别加入6.2中制备的DNA溶液2uL，反应体系总体积为20μL，盖紧管盖，500r/min离心30s。6.5循环条件设置
样品放入荧光定量PCR扩增仪进行检测，其实时荧光定量PCR扩增程序如下：50℃2min；95℃10min；95℃15s，60℃1min，共35个～40个循环，每个循环延伸末期采集数据。6.6终点读板分型程序设置
实时荧光定量PCR反应结束后立即进行终点读板分型，选择标记探针的两种检测信号FAM和VTC，程序如下：61℃预热1s，60℃连续读板，同时收集5个信号机器将根据记录的数据将两种荧光信号进行比较计算，自动分型。结果描述及判定
7.1结果描述
荧光定量PCR仪采用终点读板基因分型模式（EndpointGenotyping）检测483nm~533nm通道（FAM）和523nm~568nm通道（VIC）的数据，经过计算比较两者的比值，得到基因分型散点图（见图1）。FAM标记的纯合子在483nm~533nm通道（FAM）即X轴附近聚集（如图1中b所指点所示），VIC标记的纯合子在523nm~568nm通道（VIC）即Y轴附近聚集（如图1中a所指点所示），杂合子在中间区域聚集（如图1中e所指点所示）。TIKAoNrKAca
SN/T3586—2013
wEndpoinFimorescencescateciotgasessecZoom32.000
18:000
16:000m
14:000
：13:000
20:000
00024.000.26.000.28:op0.30.00032.00020000006.00.8.00810.00012.000.14.00016.00018.00020.00022说明：
VIC标记检测物，其对应标准品基因型从上至下依次为171QQ36VV、154HH、171HQ、171HQ.171HH；h
FAM标记检测纯合子，其对应标准品基因型从左至右依饮为136A4.154HH、171RR；杂合子，其对应标准品基因型从上室下依次为154RH.136VA.171RH1.171RQ：阴性对照。
各标准品基因分型结果
样品结果判定
在原点附近聚集，如图1中d所指点所示样品基因型结果判定
样品基因型结果判定见表3。
样品基因型结果表
136位编码的氨基酸
154位编码的氨基酸
171位编码的氨基酸
ARR/ARR
ARR/ARH
ARR/ARQ
AHQ/AHQ
KoNKAca
136位编码的氨基酸
表3（续）
154位编码的氨基酸
注：A为丙氨酸Alanine；V为缬氨酸Valine；H胺Glutanine
基因型抗性情况
基因型抗性情况见表4。
基因型
ARR/ARR
ARR/ARQ
ARR/ARH
AHQ/AHQ
ARQ/ARH
AHQ/ARH
ARQ/AHQ
ARQ/ARQ
ARR/VRQ
ARQ/VRQ
AHQ/VRQ
VRQ/VRQ
171位编码的氨基酸
SN/T3586—2013
ARQ/ARH
ARH/AHQ
ARQ/AHQ
ARQ/ARQ
ARR/VRQ
ARQ/VRQ
AHQ/VRQ
VRQ/VRQ
细酸Hisidit
cR为精氢酸Arginine：Q为谷氨酰绵羊PrP基因型与羊痒病发生的危险性发生关痒病的危险
对羊痒病最具抗性
好羊痒病具有抗性，但是后代的易感性依赖于其他父母代的基因型此基因型的绵关及后代对羊痒病有较高的危险性对羊痒病易感，但是可以用做筛选ARR抗性基因的品种来源，绵羊及其后代对羊痒病的易感性最高
-TKAoNiKAca
SN/T3586—2013
附录A
（资料性附录）
羊痒病概述
羊痒病（Scrapie)俗称“瘙痒病”是由痒病肌病毒引起成年绵羊和山羊的一种慢性进行性的、致死性神经系统疾病。其特征为潜伏期长、剧痒、精神委顿、肌肉震颤、运动失调、衰弱、瘫痪和最终死亡。羊痒病病原是一种无核酸的蛋白质侵染颗粒（即肌病毒），足由宿主神经细胞表面正常的一种唾液酸糖蛋白(PrPc)在三维结构发生改变后形成的异常蛋白（PrPSC）。研究表明，羊痒病的发生与绵羊肌蛋白编码基因PRNP遗传多样性密切相关，主要表现在绵羊PRNP第136、154和171位密码子组成的PRNP基因型与绵羊对痒病的抗病性相关。在密码了136、154和171分别编码不同的氨基酸，用代表特定氨基酸的字母来衣示，如一只绵羊的PRNP基因型表示为ARQ/AHQ，表示密码子136上编码的2个氨基酸是内氨酸，密码子154上编码的2个氨基酸分别是精氨酸和组氨酸，密码子171上编码的2个氢基酸都是谷氨酰胺。患有TSE的病羊其基因组中的3个等位基因发生了突变，即136位点上的A突变成了V、154位点上的R基因突变成了IHI基因，171位点上的Q基因突变成了R或H.研究表明野生基因型ARR/ARR或ARR/ARQ是抗性基因型，具有此基因型的羊基本上不会感染Scrapie，VRQ/VRQ基因型绵羊对羊痒病最易感，但不是所有品种的绵羊都有VRQ型PRNP等位基因，例如萨福克羊，而ARQ/ARQ、VRQ/ARQ、AHQ/VRH等其他基因型羊则为敏感型，易患Scrapie。根据GenBank报道的脱蛋白编码基因（PRNP)序列，设计并合成了可用于单核节酸多态性（SNP）快速分析的3对引物和7条分别标记了FAM和VIC荧光染料的MGB探针，建立了本标准，即一种利用荧光定量PCR扩增反应对羊痒病抗性基因进行筛选的方法，采用终点读板基因分型模式，得到基因分型散点图，根据散点图即可判定所检样品的基因型。各基因型与羊痒病发生的危险性如表4所示。
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