SN/T 3583-2013
基本信息
标准号： SN/T 3583-2013
中文名称：白尾病检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3583-2013.Quarantine protocol for white tail disease.
1范围
SN/T 3583规定了白尾病的临床诊断、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法、嵌套式反转录-聚合酶链式反应(nRT-PCR)方法和原位杂交检测方法。
SN/T 3583适用于白尾病的流行病学调查、监测、诊断和检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 18088出 人境动物检疫采样
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
WTD:白尾病( white tail disease)
WMD:肌肉白浊病( white muscle disease)
MrNV :罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus)
XSV :超小型病毒(extra small virus)
RT-PCR:逆转录-聚合酶链反应(reverse-transcription-polymerase chain reaction)
nRT-PCR:嵌套式RT- PCR( Nested RT-PCR
OD:光密度(optical density)
EDTA:乙Z二胺四乙酸(ethylene diamine tetra acetic acid)
DEPC:焦碳酸二乙酯( diethylpyrocarbonate)
ISH:原位杂交(In- situ hybridisation)
TEA:三乙醇胺(triethanolamine)
SSC:标准柠檬酸盐( standard saline citrate)
4设备
4.1PCR仪。
4.2 电泳仪。
4.3 凝胶成像仪。
4.4切片机。
1范围
SN/T 3583规定了白尾病的临床诊断、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法、嵌套式反转录-聚合酶链式反应(nRT-PCR)方法和原位杂交检测方法。
SN/T 3583适用于白尾病的流行病学调查、监测、诊断和检疫。
2规范性引用文件
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GB/T 18088出 人境动物检疫采样
3缩略语
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WTD:白尾病( white tail disease)
WMD:肌肉白浊病( white muscle disease)
MrNV :罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus)
XSV :超小型病毒(extra small virus)
RT-PCR:逆转录-聚合酶链反应(reverse-transcription-polymerase chain reaction)
nRT-PCR:嵌套式RT- PCR( Nested RT-PCR
OD:光密度(optical density)
EDTA:乙Z二胺四乙酸(ethylene diamine tetra acetic acid)
DEPC:焦碳酸二乙酯( diethylpyrocarbonate)
ISH:原位杂交(In- situ hybridisation)
TEA:三乙醇胺(triethanolamine)
SSC:标准柠檬酸盐( standard saline citrate)
4设备
4.1PCR仪。
4.2 电泳仪。
4.3 凝胶成像仪。
4.4切片机。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3583—2013
白尾病检疫技术规范
Quarantineprotocol for white tail disease2013-08-30发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-03-01实施bzxz.net
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草SN/T3583-2013
本标准采用国际动物卫生组织（OTE）《水生动物疾病诊断手册》（2009版）中2.2.6章WhiteTailDiseasea
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：岳志芹、赵玉然、王群、张晏、郑小龙、孙明君、郑腾、孙涛、梁成珠、徐彪。1范围
白尾病检疫技术规范
SN/T3583—2013
本标准规定了白尾病的临床诊断、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法、嵌套式反转录-聚合酶链式反应（nRT-PCR)方法和原位杂交检测方法。本标准适用于白尾病的流行病学调查、监测、诊断和检疫2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
WTD：白尾病（whitetaildisease）WMD：肌肉白浊病（whitemusclediscase）MrNV：罗氏沼虾野田村病毒（Macrobrachiumrosenbergii nodavirus）xSV：超小型病毒（extrasmall
RT-PCR：逆转录-聚合酶链反应
reverst
transcription-polymerase chainreaction)nRT-PCR：嵌套式RT-PCR(NestedRT-PCR）OD：光密度（opticaldensity）elra-aceticacid)
EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediamDEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）ISH原位杂交（In-situhybridisation）TEA：三乙醇胺（triethanolamine）SSC：标准柠檬酸盐（standardsalinecitrate)NBT：氯化硝基四氨唑蓝（NitrotetrazoliumBluechloride）BCIP：5-澳-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（5-Bromo-4-Chloro-3-IndolylPhosphate）4设备
4. 1 PCR 仪
4.2电泳仪，
4.3凝胶成像仪。
4.4切片机。
4.5烘箱。
4.6恒温恒湿培养箱。
SN/T3583—2013
7冷冻离心机。
3电子大平。
高压灭菌锅
5试剂
Trizol
dVTP：含dCTP、dGTP、dATPdTTP各1Ommol/L。5.2
5.3Taq酶：5U/ul.，-20℃保存，避免温度剧烈变化。5.4M-MLV反转录酶：6L/μL，-20℃保存，避免温度剧烈变化5.5引物。
5.5.1RT-PCR检测MrNV用引物：
F1:5^GCG TTATAG ATG-GCA-CAA-GG-3:RI:5*-AGC-TGT-GAA-ACT-TCC-ACT-GG-3\。扩增MrNV衣壳蛋白425bp的片段。5.5.2RT-PCR检测XSV用引物：
F2:5*CGC GGA TCC GATGAA TAA GCG CAT TAA-TAA-3'R2:5' CCG GAA TTC CGT TAC TGT-TCG GAG-TCC-CAA-3'。扩增XSV衣壳蛋546bp的片段。
5.5.3nRT-PCR检测MrNV用内引物：F3:5'-GAT-GACCCC-AAC-GTT-ATC-CT-3';R3:5°-GTG-TAG-TCA-CTT-GCA-AGA-GG-3\扩增MrNV衣壳蛋白205bp的片段
5.5.4nRT-PCR检测XSV用内引物：F4:5°-ACA-TTG-GCG-GTT-GGG-TCA-TA-3';R4:5*-GTG-CCT-GTT-GCT-GAA-ATA-CC-3'。扩增XSV衣壳蛋白236bp的片段。5.5.5ISH引物序列：
KS:5*-TCGAGGTCGACGGTATC-3'
SK:5'-CGCTCTAGAACTAGTGGATC3
5.6 Triton X-100。
5.7Davidson's固定液。
5.8 DEPC。
5.9无RNA酶的蛋白酶K，
正常山羊血清。
羊抗地高辛碱性磷酸酶。
BCIP。
6采样
样品的选择
根据GB/T18088规定的数量取样，应首选腹部和尾部发白的个体。-TKAoNiKAca
6.2样品的保存
SN/T3583—2013
样品使用无菌生理盐水洗涤，放入无菌试管中，一70℃保存。用于RTPCR检测的样品也可放置于70%乙醇中运送至检测实验室
6.3最佳取样器官和组织
除了眼柄和肝脏，所有的组织都可用米进行检测。从腹肢提取的RNA也可用来检测MrNV和XSV，而不必破坏虾体。
7检测方法
7.1现场诊断方法
7.1.1体表特征：染病虾体最初变得不透明，外观呈白浊现象，尤其是在腹部。最初在腹部第二、第三腹节出现肌肉白浊现象，并逐渐向前后同时伸展，最严重时尾部肌肉亦发白。在最初病症出现5d后死亡率达到最高。参见附录A
7.1.2行为特征：染病虾体游泳和进食能力减弱，锐皮异常，形态似云母片。7.2临床诊断方法
WTD会引起对虾的腹部变白，这种临床表象对WTD不是特异的，但是WTD会伴随着高死亡率。7.3RT-PCR方法
7.3.1核酸的提取
采用Trizol法提取RNA（附录B)，也可采用等效的商业化RNA提取试剂盒。7.3.2RT-PCR反应
反应体系为50μL，可参照一步法RT-PCR反应试剂盒说明书进行，包括10pmolMrNV特异性引物（F1和R1）或XSV特异性引物（F2和R2），10ng-100ngRNA模板（通过测定OD2so进行定量），10mmol/LdNTP各1μL.酶2μL，剩余为DEPC水。反应条件为52℃30min;95℃2min；94℃40s55℃40s68℃1min.30次循环：68℃10min。RTPCR产物使用1%琼脂糖凝胶1XTBE电泳缓冲液中电泳（含EB，见附录C)，使用合适的DNA分子量标准，在凝胶成像仪或者紫外灯下观察结果。
7.3.3对照的设立
7.3.3.1阳性对照：感染MrNV/XSV的组织样品。7.3.3.2空白对照：RT-PCR时不加样品但是包括其他主要混液的反应体系。7.3.4结果判定
MrNV阳性对照会出现一条425bp的扩增片段，XSV阳性对照会出现一条546bp的扩增片段，空白对照没有该核酸带。在阳性对照与空白对照均成立的情况下，待测样品在相应的位置上有带，则结果为MrNV或XSV阳性；无带或带的大小与阳性对照不一致，则为阴性。若阳性对照、空白对照不成立，需要重新进行试验。
r'KAoKAca
SN/T3583—2013
7.4nRT-PCR
7.4.1nRT-PCR反应
第二次扩增，反应体系和条件同7.3。反应体系包括：第次扩增PCR反应产物2μL，（若第一次PCR有产物，则1：10稀释后，取2μL），nRTPCR反应混合液（附录C)20μL（或者采用商业化的试剂盒，加入MrNV特异性引物（F3和R3）或XSV特异性引物（F4和R4)各20pmol，Tag酶1μL）。反应条件.95℃10min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，30次循环，72℃5min。RTPCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳（含溴化乙锭），使用合适的DNA分子量标准，在凝胶成像仪或者紫外灯下观察结果。
7.4.2对照的设立
同7.3.3。
7.4.3结果判定
第二次扩增，MrNV、XSV阳性对照分别出现205bp、236bp的扩增片段，空白对照没有该扩增带，在阳性对照、空白对照均成立的情况下，待测样品在目的大小位置上有带，则结果为MrNV或XSV阳性，无带或带的大小与阳性对照不一致，则为阴性。若阳性对照、空白对照不成立，需要重新进行试验。7.5测序
将PCR扩增产物进行测序，并与参考序列（参见附录D)进行相似性比对，对检测结果进行判定。7.6原位杂交方法（ISH）
7.6.1探针的标记
探针通过PCRDIG标记试剂盒标记，引物KS.SK各10mol/L。PCR反应条件为：94℃min，30次循环：72℃10min
2min94℃45s.55℃45s.72c2
用PCR产物纯化试剂盒对PCR产
物进行纯化，再利用地高辛标记试剂盒进行标记，得到地高辛标记的DNA探针。7.6.2操作步骤
7.6.2.1将染病仔虾浸泡于无醋酸的Davidson’s固定液（附录C)中24h~48h。7.6.2.2
根据标准程序，石蜡包埋组织，切成7m切片。将组织切片平铺于带正电荷的载玻片上。7.6.2.360℃烘片2h，用50%乙醇、70%乙醇，90%乙醇、100%的乙醇梯度脱水。7.6.2.4将玻片浸人DEPC水配制的Tris/HCl(0.2mol/L，pH7.4)缓冲液中，孵育5min，重复次，再浸人DEPC水配制的含100mmol/L甘氨酸的Tris/HCl(0.2mol/L，pH7.4）缓冲液中孵育10 min.
7.6.2.5配制TE缓冲液（附录C)加入终浓度为10ug/mL的无RNA酶的蛋白酶K，将玻片浸泡其中，37℃孵育5min。
7.6.2.6将玻片漫人含有4%甲醛的DEPC处理过的PBS缓冲液中，浸泡5min7.6.2.7将玻片浸人0.1mol/LTEA(pH8.0,0.25%醋酸酐）缓冲液中乙酰化，孵育10min。7.6.2.8脱水后，将玻片浸于杂交缓冲液（含40ng/mL变性探针）（附录C)，在恒温恒湿培养箱内42℃孵育16h。
7.6.2.937℃1×SSC洗片10min，在0.5×SSC洗片10min，最后缓冲液（附录C）洗片2次，每次5min。
-TTKAONTKAca
7.6.2.10室温下将玻片浸人缓冲液ⅡI（附录C)孵育20min。SN/T3583-—2013
7.6.2.11将玻片浸于含1%正常山羊血清和0.1%羊抗地高辛碱性磷酸酶的缓冲液I中，在恒温恒湿培养箱内42℃孵育1h
7.6.2.12使用缓冲液Ⅲ洗片3次，每次10min；再使用缓冲液Ⅲ（附录C)洗片2次，每次5min。7.6.2.13将玻片浸于加入NBT和BCIP的bufferⅢ中，置于恒温恒湿培养箱中避光显色至少2h，或过夜。将玻片浸于缓冲液「中孵育2次，每次15min以终止反应。7.6.2.141%俾斯麦棕染色，盖上盖玻片，置于光学显微镜下观察。7.6.3设立对照
阳性对照：用感染WTD的寄主进行原位杂交。7.6.3.1
7.6.3.2阴性对照：要设两个阴性对照，原位杂交过程中不加人探针；用非感染的寄主进行原位杂交。7.6.4结果判定
阳性对照组织切片在显微镜下观察有紫黑色的杂交信号，阴性对照无紫黑色的杂交信号。在阳性对照、阴性对照成立的条件下，检测样品通过探针杂交染色后有紫黑色信号的切片被认为阳性结果。8综合判定标准
8.1疑似病例的判断标准
幼虾、成虾阶段出现停止进食，活力下降，腹肢与尾部肌肉出现白浊，五天内死亡率最高可达95%，上述症状可认为是白尾病疑似病例。8.2WTD的确诊标准
对疑似病例，首先用RT-PCR检测，MrNV或者XSV任意一种病毒结果为阳性后，再使用nRTPCR、测序或ISH中任意一种力法进行确诊，若结果为阳性，即可确诊为WTD阳性。5
-KAoNiKAca
SN/T3583—-2013
A.1概述
附录A
（资料性附录）
疾病信息
白尾病（WTD)，义称为肌肉白浊症（WMD），是由MrNV病毒和XSV病毒感染引起的，主要病症表现为对虾幼虾、仔虾全身发白。该病致死性高，幼虾和成虾在染病5d后，死亡率可达95%，成虾对该病具有一定的抗性。目前对于该病还没有疫苗、化疗和免疫等措施对WTD直接进行预防，但可以通过对虾生活环境的消毒和对虾卵的RT-PCR检测来阻断WTD在对虾中的垂直传播和横向传播。WTD会引起对虾的腹部变白，死亡率很高，但这种临床表象对WTD不是特异的。A.2病原
病原是两种病毒：罗氏沼虾野田村病毒（MrNV)和超小型病毒（XSV）。虽然XSV的致病性还不是非常清楚.但MrVV在WTD爆发时作用非常重要。病毒的毒株还不消楚。MrNV属于野田村病毒科。XSV是动物的第一个卫星病毒，也是报道的第一个卫星-野田村病毒联合病毒A.3宿主
该病毒主要感染大型的淡水对虾，罗氏沼虾（Macrobrachiumrosenbetgi），该虾原产于亚热带和热带水域。由于该虾生长快，个体大，抗病力强且出口市场价值潜力大，因而具有重要的商业价值，在东南亚、以色列、日本、我国台湾省、拉丁美洲、加勘比海和非洲的一些国家是养殖最多的对虾品种之。由于集约化养殖以及种苗与亲虾培养分离的缘故，淡水对虾孵化所和农场发生的WTD已经对整个虾水产业产生重大冲击。
1分布与流行状况
WTD的地理分布是穿过北部南美（法国西印度群岛、多米加尼共和国和加勒比海地区）以及亚洲（中国、中国台湾省和印度）。在各个地方的临床症状和死亡广类型是类似的，由此推测一些常见对虾群的迁移可能是WTD广泛分布的原因。但是，需要进一步研究求了解这种地理分布，罗氏沼虾肌肉白浊病在我国始见于1994年，于20世纪90年代后期开始零星发生。2000年起浙江、江苏、上海、广东、广西等地出现较大规模的流行。
A,5症状和体征
临床症状包括无生气、厌食以及仔虾和成年虾腹肌不透明。尾部白带是典型的临床症状，因此，该病也称为白尾病。在垂死的仔虾/幼虾中大多数受感染的组织都是腹部和头胸部的横纹肌以及肝胰腺的管状结缔组织。头胸部变大，胸部打开后，在肝胰腺两侧上部会含有两个充满水样液体类似囊状的结构。
iKAoNiKAca
S病理变化
SN/T3583—2013
白浊的肌肉组织出现严重的病变，平滑肌纤维中出现淡蓝色的嗜碱性包涵体。骨骼肌初期萎缩，肌纤维出现玻璃样变性，横纹模糊，肌原纤维坏死，横纹消失·分辩不出肌纤维中的肌原纤维和横纹结构，严重的区域成一片无肌肉组织结构的坏死区。坏死区常可见脱落的包涵体散布在其间。腹部游泳足肌肉组织细胞内也出现大量大小不等的包涵体。肝胰腺细胞常出现变性，后期坏死、胞膜崩解破裂，胞浆进入肝胰腺管管腔内等病变。心肌肿大，心肌横纹模糊不清，偶见包涵体，分布在靠近核的肌浆内。鳃组织病变较轻，鳃的上皮细胞分泌较多的黏液样物质，覆盖在鳃的表面，鳃组织细胞肿大。肠道黏膜下层表面有较多的黏液样物质，肠壁组织未见显著病变，也未发现包涵体在肠壁组织细胞中出现。7
SN/T3583—2013
附录B
（规范性附录）
RNA的提取方法
B.1收集50mg虾苗，或100mg成虾组织样品（腮、腹部/尾部肌肉或复肢），置于300μLTN缓冲液(20mmol/I.Tris/HCl,0.4mol/LNaCl.pH7.4)中匀浆。B.2室温下12000g离心15min收集上清液B.3取150μl上清液，加人1mlTrizol，混匀并室温孵育5min。B.4加入200μL三氯甲烷，混句·室温下12000g离心15min。B.5小心收集上层水相，放人新的离心管中，加人500μL异丙醇沉沉RNA。B.6室温孵育10min，4℃下12.000g离心10min。B.7弃上清液，沉淀用75%乙醇室温下悬浮洗涤，4℃下12000g离心10min。B.8弃上清液，加入50μLTE缓冲液(10mmol/I.Tris/HCI,1mmol/LEDTA，pH7.5)溶解RNA。B.9使用紫外分光光度计测量OD26G，计算RNA浓度S
C.1nRT-PCR反应混合液
Tris/HCI
Triton X-1oo
内引物F/R
DNA聚合酶
EB（EthidiumBromide，核酸染色剂）附录C
（规范性附录）
试剂的配制
10mmol/L.pH8.8
50mmol/L
1.5mmol/1
200μmol/
各20pmol
25单位
用水配制成10mg/mL的浓缩液。用时每10mL电泳液或琼脂中加1mLTBE电泳缓冲液（5倍浓缩液）
用5mol/L的HCl调pH到8.0，加双蒸水溶解至1000.0ml电泳样品缓冲液
溴酚蓝
定容至100mL。
Davidson's固定液
福尔马林
95%乙醇
冰醋酸
定容至100mL
SN/T3583—2013
SN/T3583—2013
柠檬酸三钠·2H,0
调节pH至7.0，加双蒸水定容至1000mL。高压灭菌后4℃贮存，0.5×SSC按等比例稀释配制。7NBT试剂
四氮蓝（NBT)
二甲基甲酰胺（DMF)
双蒸水
一20℃贮存。
3BCIP试剂
二甲基甲酰胺（DMF)
-20℃贮存。
10XTNE
三羟甲基氨基甲烷(Tris Base)
氯化钠（NaCI)
乙二胺四乙酸（EDTA）
双蒸水
用5mol/LHCl调pH至7.4。定容至1000mL高压灭菌，4℃保存。C.101×TNE
10XTNE
双蒸水
以0.45mmol/L的滤器过滤。
蛋白酶K（ProteinaseK）原液（10mg/mL）蛋白酶K(ProteinaseK)
双蒸水
分装于无菌离心管中（0.25mL/管），一20℃下保存。C.12蛋白酶K(ProteinaseK)工作液（100μg/mL)蛋白酶K原液
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白尾病检疫技术规范
Quarantineprotocol for white tail disease2013-08-30发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-03-01实施bzxz.net
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草SN/T3583-2013
本标准采用国际动物卫生组织（OTE）《水生动物疾病诊断手册》（2009版）中2.2.6章WhiteTailDiseasea
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：岳志芹、赵玉然、王群、张晏、郑小龙、孙明君、郑腾、孙涛、梁成珠、徐彪。1范围
白尾病检疫技术规范
SN/T3583—2013
本标准规定了白尾病的临床诊断、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法、嵌套式反转录-聚合酶链式反应（nRT-PCR)方法和原位杂交检测方法。本标准适用于白尾病的流行病学调查、监测、诊断和检疫2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
WTD：白尾病（whitetaildisease）WMD：肌肉白浊病（whitemusclediscase）MrNV：罗氏沼虾野田村病毒（Macrobrachiumrosenbergii nodavirus）xSV：超小型病毒（extrasmall
RT-PCR：逆转录-聚合酶链反应
reverst
transcription-polymerase chainreaction)nRT-PCR：嵌套式RT-PCR(NestedRT-PCR）OD：光密度（opticaldensity）elra-aceticacid)
EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediamDEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）ISH原位杂交（In-situhybridisation）TEA：三乙醇胺（triethanolamine）SSC：标准柠檬酸盐（standardsalinecitrate)NBT：氯化硝基四氨唑蓝（NitrotetrazoliumBluechloride）BCIP：5-澳-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（5-Bromo-4-Chloro-3-IndolylPhosphate）4设备
4. 1 PCR 仪
4.2电泳仪，
4.3凝胶成像仪。
4.4切片机。
4.5烘箱。
4.6恒温恒湿培养箱。
SN/T3583—2013
7冷冻离心机。
3电子大平。
高压灭菌锅
5试剂
Trizol
dVTP：含dCTP、dGTP、dATPdTTP各1Ommol/L。5.2
5.3Taq酶：5U/ul.，-20℃保存，避免温度剧烈变化。5.4M-MLV反转录酶：6L/μL，-20℃保存，避免温度剧烈变化5.5引物。
5.5.1RT-PCR检测MrNV用引物：
F1:5^GCG TTATAG ATG-GCA-CAA-GG-3:RI:5*-AGC-TGT-GAA-ACT-TCC-ACT-GG-3\。扩增MrNV衣壳蛋白425bp的片段。5.5.2RT-PCR检测XSV用引物：
F2:5*CGC GGA TCC GATGAA TAA GCG CAT TAA-TAA-3'R2:5' CCG GAA TTC CGT TAC TGT-TCG GAG-TCC-CAA-3'。扩增XSV衣壳蛋546bp的片段。
5.5.3nRT-PCR检测MrNV用内引物：F3:5'-GAT-GACCCC-AAC-GTT-ATC-CT-3';R3:5°-GTG-TAG-TCA-CTT-GCA-AGA-GG-3\扩增MrNV衣壳蛋白205bp的片段
5.5.4nRT-PCR检测XSV用内引物：F4:5°-ACA-TTG-GCG-GTT-GGG-TCA-TA-3';R4:5*-GTG-CCT-GTT-GCT-GAA-ATA-CC-3'。扩增XSV衣壳蛋白236bp的片段。5.5.5ISH引物序列：
KS:5*-TCGAGGTCGACGGTATC-3'
SK:5'-CGCTCTAGAACTAGTGGATC3
5.6 Triton X-100。
5.7Davidson's固定液。
5.8 DEPC。
5.9无RNA酶的蛋白酶K，
正常山羊血清。
羊抗地高辛碱性磷酸酶。
BCIP。
6采样
样品的选择
根据GB/T18088规定的数量取样，应首选腹部和尾部发白的个体。-TKAoNiKAca
6.2样品的保存
SN/T3583—2013
样品使用无菌生理盐水洗涤，放入无菌试管中，一70℃保存。用于RTPCR检测的样品也可放置于70%乙醇中运送至检测实验室
6.3最佳取样器官和组织
除了眼柄和肝脏，所有的组织都可用米进行检测。从腹肢提取的RNA也可用来检测MrNV和XSV，而不必破坏虾体。
7检测方法
7.1现场诊断方法
7.1.1体表特征：染病虾体最初变得不透明，外观呈白浊现象，尤其是在腹部。最初在腹部第二、第三腹节出现肌肉白浊现象，并逐渐向前后同时伸展，最严重时尾部肌肉亦发白。在最初病症出现5d后死亡率达到最高。参见附录A
7.1.2行为特征：染病虾体游泳和进食能力减弱，锐皮异常，形态似云母片。7.2临床诊断方法
WTD会引起对虾的腹部变白，这种临床表象对WTD不是特异的，但是WTD会伴随着高死亡率。7.3RT-PCR方法
7.3.1核酸的提取
采用Trizol法提取RNA（附录B)，也可采用等效的商业化RNA提取试剂盒。7.3.2RT-PCR反应
反应体系为50μL，可参照一步法RT-PCR反应试剂盒说明书进行，包括10pmolMrNV特异性引物（F1和R1）或XSV特异性引物（F2和R2），10ng-100ngRNA模板（通过测定OD2so进行定量），10mmol/LdNTP各1μL.酶2μL，剩余为DEPC水。反应条件为52℃30min;95℃2min；94℃40s55℃40s68℃1min.30次循环：68℃10min。RTPCR产物使用1%琼脂糖凝胶1XTBE电泳缓冲液中电泳（含EB，见附录C)，使用合适的DNA分子量标准，在凝胶成像仪或者紫外灯下观察结果。
7.3.3对照的设立
7.3.3.1阳性对照：感染MrNV/XSV的组织样品。7.3.3.2空白对照：RT-PCR时不加样品但是包括其他主要混液的反应体系。7.3.4结果判定
MrNV阳性对照会出现一条425bp的扩增片段，XSV阳性对照会出现一条546bp的扩增片段，空白对照没有该核酸带。在阳性对照与空白对照均成立的情况下，待测样品在相应的位置上有带，则结果为MrNV或XSV阳性；无带或带的大小与阳性对照不一致，则为阴性。若阳性对照、空白对照不成立，需要重新进行试验。
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SN/T3583—2013
7.4nRT-PCR
7.4.1nRT-PCR反应
第二次扩增，反应体系和条件同7.3。反应体系包括：第次扩增PCR反应产物2μL，（若第一次PCR有产物，则1：10稀释后，取2μL），nRTPCR反应混合液（附录C)20μL（或者采用商业化的试剂盒，加入MrNV特异性引物（F3和R3）或XSV特异性引物（F4和R4)各20pmol，Tag酶1μL）。反应条件.95℃10min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，30次循环，72℃5min。RTPCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳（含溴化乙锭），使用合适的DNA分子量标准，在凝胶成像仪或者紫外灯下观察结果。
7.4.2对照的设立
同7.3.3。
7.4.3结果判定
第二次扩增，MrNV、XSV阳性对照分别出现205bp、236bp的扩增片段，空白对照没有该扩增带，在阳性对照、空白对照均成立的情况下，待测样品在目的大小位置上有带，则结果为MrNV或XSV阳性，无带或带的大小与阳性对照不一致，则为阴性。若阳性对照、空白对照不成立，需要重新进行试验。7.5测序
将PCR扩增产物进行测序，并与参考序列（参见附录D)进行相似性比对，对检测结果进行判定。7.6原位杂交方法（ISH）
7.6.1探针的标记
探针通过PCRDIG标记试剂盒标记，引物KS.SK各10mol/L。PCR反应条件为：94℃min，30次循环：72℃10min
2min94℃45s.55℃45s.72c2
用PCR产物纯化试剂盒对PCR产
物进行纯化，再利用地高辛标记试剂盒进行标记，得到地高辛标记的DNA探针。7.6.2操作步骤
7.6.2.1将染病仔虾浸泡于无醋酸的Davidson’s固定液（附录C)中24h~48h。7.6.2.2
根据标准程序，石蜡包埋组织，切成7m切片。将组织切片平铺于带正电荷的载玻片上。7.6.2.360℃烘片2h，用50%乙醇、70%乙醇，90%乙醇、100%的乙醇梯度脱水。7.6.2.4将玻片浸人DEPC水配制的Tris/HCl(0.2mol/L，pH7.4)缓冲液中，孵育5min，重复次，再浸人DEPC水配制的含100mmol/L甘氨酸的Tris/HCl(0.2mol/L，pH7.4）缓冲液中孵育10 min.
7.6.2.5配制TE缓冲液（附录C)加入终浓度为10ug/mL的无RNA酶的蛋白酶K，将玻片浸泡其中，37℃孵育5min。
7.6.2.6将玻片漫人含有4%甲醛的DEPC处理过的PBS缓冲液中，浸泡5min7.6.2.7将玻片浸人0.1mol/LTEA(pH8.0,0.25%醋酸酐）缓冲液中乙酰化，孵育10min。7.6.2.8脱水后，将玻片浸于杂交缓冲液（含40ng/mL变性探针）（附录C)，在恒温恒湿培养箱内42℃孵育16h。
7.6.2.937℃1×SSC洗片10min，在0.5×SSC洗片10min，最后缓冲液（附录C）洗片2次，每次5min。
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7.6.2.10室温下将玻片浸人缓冲液ⅡI（附录C)孵育20min。SN/T3583-—2013
7.6.2.11将玻片浸于含1%正常山羊血清和0.1%羊抗地高辛碱性磷酸酶的缓冲液I中，在恒温恒湿培养箱内42℃孵育1h
7.6.2.12使用缓冲液Ⅲ洗片3次，每次10min；再使用缓冲液Ⅲ（附录C)洗片2次，每次5min。7.6.2.13将玻片浸于加入NBT和BCIP的bufferⅢ中，置于恒温恒湿培养箱中避光显色至少2h，或过夜。将玻片浸于缓冲液「中孵育2次，每次15min以终止反应。7.6.2.141%俾斯麦棕染色，盖上盖玻片，置于光学显微镜下观察。7.6.3设立对照
阳性对照：用感染WTD的寄主进行原位杂交。7.6.3.1
7.6.3.2阴性对照：要设两个阴性对照，原位杂交过程中不加人探针；用非感染的寄主进行原位杂交。7.6.4结果判定
阳性对照组织切片在显微镜下观察有紫黑色的杂交信号，阴性对照无紫黑色的杂交信号。在阳性对照、阴性对照成立的条件下，检测样品通过探针杂交染色后有紫黑色信号的切片被认为阳性结果。8综合判定标准
8.1疑似病例的判断标准
幼虾、成虾阶段出现停止进食，活力下降，腹肢与尾部肌肉出现白浊，五天内死亡率最高可达95%，上述症状可认为是白尾病疑似病例。8.2WTD的确诊标准
对疑似病例，首先用RT-PCR检测，MrNV或者XSV任意一种病毒结果为阳性后，再使用nRTPCR、测序或ISH中任意一种力法进行确诊，若结果为阳性，即可确诊为WTD阳性。5
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SN/T3583—-2013
A.1概述
附录A
（资料性附录）
疾病信息
白尾病（WTD)，义称为肌肉白浊症（WMD），是由MrNV病毒和XSV病毒感染引起的，主要病症表现为对虾幼虾、仔虾全身发白。该病致死性高，幼虾和成虾在染病5d后，死亡率可达95%，成虾对该病具有一定的抗性。目前对于该病还没有疫苗、化疗和免疫等措施对WTD直接进行预防，但可以通过对虾生活环境的消毒和对虾卵的RT-PCR检测来阻断WTD在对虾中的垂直传播和横向传播。WTD会引起对虾的腹部变白，死亡率很高，但这种临床表象对WTD不是特异的。A.2病原
病原是两种病毒：罗氏沼虾野田村病毒（MrNV)和超小型病毒（XSV）。虽然XSV的致病性还不是非常清楚.但MrVV在WTD爆发时作用非常重要。病毒的毒株还不消楚。MrNV属于野田村病毒科。XSV是动物的第一个卫星病毒，也是报道的第一个卫星-野田村病毒联合病毒A.3宿主
该病毒主要感染大型的淡水对虾，罗氏沼虾（Macrobrachiumrosenbetgi），该虾原产于亚热带和热带水域。由于该虾生长快，个体大，抗病力强且出口市场价值潜力大，因而具有重要的商业价值，在东南亚、以色列、日本、我国台湾省、拉丁美洲、加勘比海和非洲的一些国家是养殖最多的对虾品种之。由于集约化养殖以及种苗与亲虾培养分离的缘故，淡水对虾孵化所和农场发生的WTD已经对整个虾水产业产生重大冲击。
1分布与流行状况
WTD的地理分布是穿过北部南美（法国西印度群岛、多米加尼共和国和加勒比海地区）以及亚洲（中国、中国台湾省和印度）。在各个地方的临床症状和死亡广类型是类似的，由此推测一些常见对虾群的迁移可能是WTD广泛分布的原因。但是，需要进一步研究求了解这种地理分布，罗氏沼虾肌肉白浊病在我国始见于1994年，于20世纪90年代后期开始零星发生。2000年起浙江、江苏、上海、广东、广西等地出现较大规模的流行。
A,5症状和体征
临床症状包括无生气、厌食以及仔虾和成年虾腹肌不透明。尾部白带是典型的临床症状，因此，该病也称为白尾病。在垂死的仔虾/幼虾中大多数受感染的组织都是腹部和头胸部的横纹肌以及肝胰腺的管状结缔组织。头胸部变大，胸部打开后，在肝胰腺两侧上部会含有两个充满水样液体类似囊状的结构。
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S病理变化
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白浊的肌肉组织出现严重的病变，平滑肌纤维中出现淡蓝色的嗜碱性包涵体。骨骼肌初期萎缩，肌纤维出现玻璃样变性，横纹模糊，肌原纤维坏死，横纹消失·分辩不出肌纤维中的肌原纤维和横纹结构，严重的区域成一片无肌肉组织结构的坏死区。坏死区常可见脱落的包涵体散布在其间。腹部游泳足肌肉组织细胞内也出现大量大小不等的包涵体。肝胰腺细胞常出现变性，后期坏死、胞膜崩解破裂，胞浆进入肝胰腺管管腔内等病变。心肌肿大，心肌横纹模糊不清，偶见包涵体，分布在靠近核的肌浆内。鳃组织病变较轻，鳃的上皮细胞分泌较多的黏液样物质，覆盖在鳃的表面，鳃组织细胞肿大。肠道黏膜下层表面有较多的黏液样物质，肠壁组织未见显著病变，也未发现包涵体在肠壁组织细胞中出现。7
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附录B
（规范性附录）
RNA的提取方法
B.1收集50mg虾苗，或100mg成虾组织样品（腮、腹部/尾部肌肉或复肢），置于300μLTN缓冲液(20mmol/I.Tris/HCl,0.4mol/LNaCl.pH7.4)中匀浆。B.2室温下12000g离心15min收集上清液B.3取150μl上清液，加人1mlTrizol，混匀并室温孵育5min。B.4加入200μL三氯甲烷，混句·室温下12000g离心15min。B.5小心收集上层水相，放人新的离心管中，加人500μL异丙醇沉沉RNA。B.6室温孵育10min，4℃下12.000g离心10min。B.7弃上清液，沉淀用75%乙醇室温下悬浮洗涤，4℃下12000g离心10min。B.8弃上清液，加入50μLTE缓冲液(10mmol/I.Tris/HCI,1mmol/LEDTA，pH7.5)溶解RNA。B.9使用紫外分光光度计测量OD26G，计算RNA浓度S
C.1nRT-PCR反应混合液
Tris/HCI
Triton X-1oo
内引物F/R
DNA聚合酶
EB（EthidiumBromide，核酸染色剂）附录C
（规范性附录）
试剂的配制
10mmol/L.pH8.8
50mmol/L
1.5mmol/1
200μmol/
各20pmol
25单位
用水配制成10mg/mL的浓缩液。用时每10mL电泳液或琼脂中加1mLTBE电泳缓冲液（5倍浓缩液）
用5mol/L的HCl调pH到8.0，加双蒸水溶解至1000.0ml电泳样品缓冲液
溴酚蓝
定容至100mL。
Davidson's固定液
福尔马林
95%乙醇
冰醋酸
定容至100mL
SN/T3583—2013
SN/T3583—2013
柠檬酸三钠·2H,0
调节pH至7.0，加双蒸水定容至1000mL。高压灭菌后4℃贮存，0.5×SSC按等比例稀释配制。7NBT试剂
四氮蓝（NBT)
二甲基甲酰胺（DMF)
双蒸水
一20℃贮存。
3BCIP试剂
二甲基甲酰胺（DMF)
-20℃贮存。
10XTNE
三羟甲基氨基甲烷(Tris Base)
氯化钠（NaCI)
乙二胺四乙酸（EDTA）
双蒸水
用5mol/LHCl调pH至7.4。定容至1000mL高压灭菌，4℃保存。C.101×TNE
10XTNE
双蒸水
以0.45mmol/L的滤器过滤。
蛋白酶K（ProteinaseK）原液（10mg/mL）蛋白酶K(ProteinaseK)
双蒸水
分装于无菌离心管中（0.25mL/管），一20℃下保存。C.12蛋白酶K(ProteinaseK)工作液（100μg/mL)蛋白酶K原液
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