SN/T 3581-2013.Detection and identification of Monilinia fructicola ( Winter) Honey with real-time fluorescence PCR.
1范围
SN/T 3581规定了美澳型核果褐腐病菌[Monilinia fructicola ( Winter) Honey]的 应用TaqMan MGB探针进行实时荧光PCR的检测方法。
SN/T 3581适用于美澳型核果褐腐病菌的寄主包括核果类水果以及木瓜属、山楂属.枇杷属等传带美澳型核果褐腐病菌的寄主上的该病菌的分子检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注8期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文.件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
SN/T 1193基因 检验实验室技术要求
SN/T1871美澳型核果褐腐病菌检疫鉴定方法
3原理
3.1病菌分类地位及形态特征
按照SN/T 1871。
3.2 鉴定原理
根据美澳型核果褐腐病菌与其近似种包括核果褐腐病菌和欧洲仁果褐腐病菌的内间隔转录区基因的不同,设计特异性的引物和探针,应用相关仪器,包括实时荧光PCR仪等对美澳型核果褐腐病菌进行实时荧光PCR鉴定。
4主要仪器用具和试剂
4.1试剂
CTAB提取液、Tris饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇.无水乙醇、RNA酶、液氮、实时荧光PCR反应缓冲液。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3581—2013
美澳型核果褐腐病菌实时荧光PCR检测方法
Detection and identification of Monilinia fructicola (Winter) Honeywithreal-timefluorescencePCR2013-03-01发布
中华人民共和国www.bzxz.net
国家质量监督检验检疫总局
2013-09-16实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T3581-2013
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院本标准主要起草人：程颖慧、王颖、章桂明、汪莹。1范围
美澳型核果褐腐病菌实时荧光PCR检测方法
SN/T3581—2013
本标准规定了美澳型核果褐腐病菌[Moniliniafructicola（Winter）Honey的应用TaqManMGB探针进行实时荧光PCR的检测方法。本标准适用于美澳型核果褐腐病菌的寄主包括核果类水果，以及木瓜属、山楂属、枇杷属等传带美澳型核果褐腐病菌的寄主上的该病菌的分子检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1193基因检验实验室技术要求SN/T1871美澳型核果褐腐病菌检疫鉴定方法3原理
3.1病菌分类地位及形态特征
按照SN/T1871。
3.2鉴定原理
根据美澳型核果褐腐病菌与其近似种包括核果褐腐病菌和欧洲仁果褐腐病菌的内间隔转录区基因的不同，设计特异性的引物和探针，应用相关仪器，包括实时荧光PCR仪等对美澳型核果褐腐病菌进行实时荧光PCR鉴定。
4主要仪器用具和试剂
4.1主要仪器及用具
烘箱、高压灭菌锅、天平（感量1/100，1/10.000）、研钵、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、旋涡振荡器台式离心机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、真空抽干仪、冰箱、超净工作台、实时荧光PCR仪、微量移液器（0.5μL，2μL，10μL,20μL,100μl.,200μl.,1000μL)、离心管（0.2mL，1.5mL,2.0mL)、Tip头0.1μl～10μL，5μL~200μl,100μL~1000μL)、试管。4.2试剂
CTAB提取液、Tris饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、RNA酶、液氮、实时荧光PCR反应缓冲液。
SN/T3581—2013
注：除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。5检疫鉴定
5.1病原菌的分离培养
病原菌的分离培养按照SN/T1871进行，5.2样品核酸的提取
收集分离培养得到的菌丝或者直接取疑似罹病果实发病部位组织，于研钵中液氮冷冻后研磨，采用CTAB法提取病原菌总DNA。具体方法如下a）将液氮研磨处理的菌丝或组织转至2ml离心管，加人65℃预热的CTAB提取液700μL，置于水浴锅中65℃水浴30min.期间不断混勺：加人5l10mg/mLRNA酶，充分混匀，在37℃放置30min；b）
加人等体积的Tris饱和酚，充分摇勾，在16000g下高心15min;c
取上清液，加人1：1三氯甲烷/异戊醇（24：1）在16000g下离心15min；
再取上清液，加人1：1三氯甲烷/异戊醇（24：1），在12000g下离心15min加入等体积预冷的异丙醇，轻轻摇晃，置于20冰箱静置30min，在16000g下离心f
15min;
充上清液，加入70%乙醇500L，16000g下离心3min.去上清液，重复2次；g）
得到DNA沉淀，用冷冻干燥仪进行干燥，加人50～100LTE或无菌去离子水，充分溶解一20℃冰箱中保存
后.测量DNA的纯度和浓度后置于注：也可使用试剂盒进行DNA提取，具体方法按照试剂盒说明书操作3实时荧光PCR检测
5.3.1引物及探针序列
a）引物及探针序列为：
正向引物SZMfc-F：5-CCTTCGGGOC一反向引物SZMfc-R：5CCAAGAGATCGTATGCT3
AGT3*：
探针SZMfc-Pb：5'-FAM-CCAGAGGATAATTAAAC-MGB-3。b）引物及探针序列为：
正向引物Mon139F：5*-CACCCTTGTGTATYATTACTTTGTTGCTT-3反向引物Mon139R：5-CAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAA-3；探针P_fc:5'-FAMTATGCTCGCCAGAGGATAATT-MGBNFQ-3'。5.3.2扩增条件
5.3.2.15.3.1中SZMfc的引物和探针的扩增体系反应体系总体积为10L，各成分分别为：实时荧光反应缓冲液5L，引物和探针终浓度分别为0.1μmol/L，去离子水3uL，DNA1μL(10ng~100ng）。将反应体系混匀后置于实时荧光PCR仪中进行反应
5.3.2.25.3.1中Monl39的引物和Plc探针的扩增体系，反应体系总体积为25uL，各成分分别为：实时荧光反应缓冲液12.5μL，引物和探针终浓度分别为0.2umol/L，DNA5μL(10ng100ng）.补足去离子水。将反应体系混勾后置于实时荧光PCR仪中2
rKoNiKca
进行反应。
SN/T3581—2013
以灭菌去离了水作空白对照，以美澳型核果褐腐病菌的DNA模板为阳性对照，以非美澳型核果褐腐病菌的其他DNA模板为阴性对照，每个样品重复2次。5.3.2.3反应条件
设置扩增反应条件为：50℃预热2min；95℃变性10min；然后进人40个循环，95℃15s，60℃lmin.
实验室质量控制按照GB/T6682和SN/T1193进行。结果判定与表述
MGB探针实时荧光PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，则：检测Ct值小于或等于36，判定美澳型核果褐腐病菌检测结果呈阳性；检测Ct值大于或等于40，判定美澳型核果褐腐病菌检测结果呈阴性；检测Ct值在36~40之间，应重做实时荧光PCR，再次扩增后，如Ct值小于或等于36或者Ct值大于或等于40，判定同上：如果检测Ct值仍在36~40之间，则需要参照SN/T1871进行形态学鉴定。
样品、菌种与原始数据保存
样品、菌种保存
存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式，妥善保存6个月。如发现美澳型核果褐腐病菌，分离到的菌种进行斜面保存，样品应保存1年，以备复验，如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕。保存期满后，需经灭菌处理。
2原始数据保存
样品检测结束后，其原始记录单和检验报告或证书应归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。KoNca
SN/T3581—2013
参考文献
「11程颖慧，章桂明，王颖，等.应用TagManMGB探针检测美澳型核果褐腐病菌.广东农业科学，2009,232(7)：196-198.
[2]van Leeuwen GCM, BaayenRP,HolbIJ&.JegerMJ.Distinction of theAsiatic brown rot fungusMonilia polystroma sp.nov.from Monilia fructigena.Mycological Research 2002,106,444-451.L/NS
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