SN/T 3661-2013
基本信息
标准号： SN/T 3661-2013
中文名称：口岸食源性疾病轮状病毒(A组)荧光PCR检测
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 口岸 食源性 疾病 轮状病毒 荧光 PCR 检测
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3661-2013.Detection for rotavirus ( group A ) of foodbrone disease by real-time fluorescence PCR at ports.
1范围
SN/T 3661规定了国境口岸食源性轮状病毒(A组)的荧光PCR快速检测方法,包括标本采集、运输与保存、处理、核酸提取与检测、结果分析以及相应的生物安全措施。
SN/T 3661适用于国境口岸出人境腹泻患者粪便样本、呕吐物和可疑食品的轮状病毒(A组)筛查检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 4789.1-2003食 品卫生微生物学检验总则
GB 19489实验室生 物安全通用要求
SN/T1720-2006出人境口岸轮状病毒感染监测规程
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1轮状病毒rotavirus
属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是引起哺乳动物类和鸟类腹泻的主要病原体。轮状病毒是双链RNA病毒,基因组分11个节段,轮状病毒有7个血清组(A-G),其中A、.B、C组与人类疾病有关,A组轮状病毒主要引起儿童腹泻,B组轮状病毒主要引起成人腹泻。
3.2荧光PCR fluorescence polymerase chain reaction
又称为实时PCR(real-time PCR),是在普通PCR的基础上利用荧光染料在激发光作用下所释放的荧光光能的变化来直接反映PCR扩增产物量变化的技术。本标准所采用的是Taq Man水解探针法,其原理是在常规RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)的基础上,加入一条特异性的荧光探针,该探针为一段寡核苷酸,两端分别标记--个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,PCR扩增时,利用Taq酶的5'-3’外切酶活性将探针酶切水解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可以接收到荧光信号,实现了荧光信号的积累与PCR产物形成同步。
1范围
SN/T 3661规定了国境口岸食源性轮状病毒(A组)的荧光PCR快速检测方法,包括标本采集、运输与保存、处理、核酸提取与检测、结果分析以及相应的生物安全措施。
SN/T 3661适用于国境口岸出人境腹泻患者粪便样本、呕吐物和可疑食品的轮状病毒(A组)筛查检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 4789.1-2003食 品卫生微生物学检验总则
GB 19489实验室生 物安全通用要求
SN/T1720-2006出人境口岸轮状病毒感染监测规程
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1轮状病毒rotavirus
属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是引起哺乳动物类和鸟类腹泻的主要病原体。轮状病毒是双链RNA病毒,基因组分11个节段,轮状病毒有7个血清组(A-G),其中A、.B、C组与人类疾病有关,A组轮状病毒主要引起儿童腹泻,B组轮状病毒主要引起成人腹泻。
3.2荧光PCR fluorescence polymerase chain reaction
又称为实时PCR(real-time PCR),是在普通PCR的基础上利用荧光染料在激发光作用下所释放的荧光光能的变化来直接反映PCR扩增产物量变化的技术。本标准所采用的是Taq Man水解探针法,其原理是在常规RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)的基础上,加入一条特异性的荧光探针,该探针为一段寡核苷酸,两端分别标记--个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,PCR扩增时,利用Taq酶的5'-3’外切酶活性将探针酶切水解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可以接收到荧光信号,实现了荧光信号的积累与PCR产物形成同步。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T36612013
口岸食源性疾病轮状病毒（A组）荧光PCR检测
Detection for rotavirus (group A)of foodbrone disease byreal-timefluorescencePCRatports2013-08-30发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-03-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国河北出入境检验检疫局本标准主要起草人：史玲莉、韩伟、闫冀焕、沈军、王惠兰、董辉、崔鹰SN/T3661-2013
1范围
口岸食源性疾病轮状病毒（A组）荧光PCR检测
SN/T3661—2013
本标准规定了国境口岸食源性轮状病毒（A组）的荧光PCR快速检测方法·包括标本采集、运输与保存、处理、核酸提取与检测、结果分析以及相应的生物安全措施。本标准适用于国境口岸出人境腹患者并便样本，呕吐物和可疑食品的轮状病毒（A组）筛查检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用手本文件。凡是不注口期的引用文件，其最新版本（他括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.12003食品卫生微生物学检验总则GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1720-2006出人境口岸轮状病毒感染监测规程3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
轮状病毒rotavirus
属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是引起哺乳动物类和鸟类腹泻的主要病原体。轮状病毒是双链RNA病毒，基因组分11个节段，轮状病毒有7个血清组（A-G），其中A、B、C组与人类疾病有关，A组轮状病毒主要引起儿童腹泻，B组轮状病毒主要引起成人腹泻3.2
荧光PCRfluorescence polymerase chain reaction叉称为实时PCR(real-timePCR).是在普通PCR的基础上利用荧光染料在激发光作用下所释放的荧光光能的变化来直接反映PCR扩增产物量变化的技术。本标准所采用的是TugMan水解探针法，其原理是在常规RT-PCR（反转录聚合酶链式反应）的基础上，加入一条特异性的荧光探针，该探针为一段京核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，利用TaQ酶的5'-3外切酶活性将探针酶切水解，使报告荧光基团和灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成同步。
Ct值cyelethreshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4仪器和设备
4.1荧光定量PCR仪。
SN/T3661—2013
生物安全柜，
普通冰箱（2℃8℃和-20℃两种）。4.4超低温冰箱（-70℃）。
低速低温离心机（离心转速≥6200g）。高速冷冻离心机（离心转速≥13800g，4℃低温）。微量可调移液器（10uL、100uL、1000L）及配套带滤芯吸头离心管（1.5mL）。
涡旋振荡器。
5试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所用试剂均采用无RNA酶污染的容器（用DEPC水处理后高压灭菌)分装。
样本稀释液
商品化磷酸盐缓冲液（PBS：PhosphateBufferedSaline)（含Ca+、Mg+）pH7.2~7.4。也可参见附录A.3配制。
5.2核酸提取试剂
选用病毒RNA提取试剂盒QIAampViralRNAKit试剂盒，德国Qiagan公司产品，内含AVL、AWI、AW2、AVE等成分。
5.3核酸检测试剂
迅必达轮状病毒（A组)核酸检测试剂盒，成都新基因格生物科技有限公司产品\。6
标本的采集
粪便标本
采用无菌螺口便盒采集腹泻患者粪便标本，每份标本5mL~10mL，用耐低温油性记号笔在便盒上做好标记，置丁一20℃保存。轮状病毒感染者出现症状后1d~3d内粪便排毒量最人，因此应尽可能在此期间收集标本。
6.2呕吐物标本
需要进行呕吐物中是否含有轮状病毒时，按照SN/T1720—2006中6.2.3.3进行采样，置4℃保存并立即送检。
6.3可疑食品样本
需要调查食品是否被轮状病毒污染时，按照GB/T4789.1一2003中第3章进行采样，置4℃保存并立即送检，
1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
KAONiKAca
7检测方法
7.1样本处理和保存
粪便样本的处理
SN/T3661—2013
取适量粪便标本加到1.5mL离心管中，加人PBS样本稀释液，制备成10%的便悬液.振荡3次，每次10s.然后静置10min，4℃，6200g离心5min，吸取上清液进行下步试验或一20℃短期保存。7.1.2呕吐物及可疑食品
呕吐物和可疑食品用PBS样本稀释液，制备成20%的悬液，4℃.6200g离心5min，吸取上清进行下一步试验或一20℃短期保存。7.1.3标本保存
标本如需长期保存，建议存放于一70℃冰箱。7.2
核酸提取
按照病毒RNA提取试剂盒说明书提取。7.3
3荧光PCR扩增
引物和探针序列
以轮状病毒VP7区为检测靶序列，引物和探针序列如下：上游引物：5-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCC-3—下游引物：5AA(C/T)TG(C/T)GGTATATTCAATACCATACA-3探针：5-(Fam)-AA(A/G)GAGCTA(A/T)CCG(C/T)TAGCCAGACGG-(eclipse)-37.3.2阳性对照和空白对照设置
每次检测分别设阳性对照和空白对照。阳性对照选用含有检测序列的轮状病毒（A组）的RNA作为荧光PCR反应的模板，空白对照用无菌超纯水作为荧光PCR反应的模板7.3.3荧光PCR反应体系
轮状病毒（A组）反应体系采用如下参数：氯化镁（MgCla）2.5mmol/L、dNTP各0.4mmol/L上下游引物各0.4μmol/L、探针0.2μmol/L、逆转录酶（M-MLV，200U/μL）100U、DNA聚合酶（热启动Taq酶，5U/μL)2.5U、模板RNA2.0μl加无菌超纯水至20μL。逆转录酶M-MLV应去除RnaseH活性。每个样品做两个平行样对照。7.3.4荧光PCR反应程序
若仪器为ABI7500型实时荧光PCR仪2，荧光PCR反应程序采用如下参数：逆转录阶段：42C2）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
-rKoNiKca
SN/T3661—2013www.bzxz.net
10min预变性阶段：94℃，1cs：循环阶段（共40个循环），变性94℃，5s，退火及延仲56℃，60s在退火及延伸过程中检测荧光信号。信号采集设为Fan荧光素。由于不同的荧光定量PCR仪的性能存在差只，可通过条件优化适当调整PCR循环的退火温度及时间。
8结果分析
8.1基线范围设定
如果仪器要求设置基线（baseline）范围，起始循环设置一般大于3，结束循环设置一般比最早出现的扩增曲线提前1～2个循环，
8.2阅值的设定
如果仪器要求设置阅值设定阈值的一般原则是令國值线刚好超过阴性对照的扩增曲线的最高点：也可根据仪器噪音情况进行调整。8.3荧光PCR反应系统的质量控制条件，否则试验结果无效：
反应结果应同时符合以下2个
空白对照：无Ct值（无扩增曲线）：阳性对照：Ct值小于30
8.4荧光PCR检测结果判定及报告荧光PCR检测结果判定及报告
阴性：无Ct值或Ci值
5，且没有出现S形扩增曲线，报告为轮状病毒（A组）荧光PCR检测阴性。
阳性：Ct值<35，且出现S形扩增曲线，报告为轮状病毒（A组）荧光PCR检测阳性。可疑：Ct值在35~40之间且出现S形扩增曲线，可重复实验，如果重复实验仍有明显S形扩增曲线且阴性对照没有污染，可报告为轮状病毒（A组）荧光PCR检测阳性，否则为报告为阴性。生物安全措施
实验室生物安全要求按照GB19489和附录B执行。4
-TKAONTKAca
A.1PBS(A)×10的配方
附录A
（规范性附录）
样品稀释液配方
SN/T3661—2013
氯化钠80g，氯化钾2g，无水磷酸二氢钠11.5g，磷酸二氢钾2g，加去离子超纯水（DDW）至1000mL
A.2PBS(B+C)×50的配方
氯化钙25g，氧化镁25g，加去离子超纯水（DDW）至1000mLA.3PBS(A+B+C)的配方
50×PBS（B+C)1.8mL10×PBS（A）45mL，加去离子超纯水（DDW）至400mL后用作样品稀释液。样品稀释液可以高压灭菌后分装于4℃保存S
KAoNKAca
SN/T3661—2013
附录B
（规范性附录）
生物安全要求
中华人民共和国卫生部发布的人间传染的病原微生物名录》规定，轮状病毒危害程度分类为第三类，所有有关轮状病毒的实验空操作应按照以下规定执行。a）术经培养的轮状病毒感染性材料的操作须在生物安全二级（BSL-2)实验室内进行。b）轮状病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全级（BSL-1)实验室内进行。c)
轮状病毒感染性材料运输包装分类为B类，UN编号为UN3373。
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口岸食源性疾病轮状病毒（A组）荧光PCR检测
Detection for rotavirus (group A)of foodbrone disease byreal-timefluorescencePCRatports2013-08-30发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-03-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国河北出入境检验检疫局本标准主要起草人：史玲莉、韩伟、闫冀焕、沈军、王惠兰、董辉、崔鹰SN/T3661-2013
1范围
口岸食源性疾病轮状病毒（A组）荧光PCR检测
SN/T3661—2013
本标准规定了国境口岸食源性轮状病毒（A组）的荧光PCR快速检测方法·包括标本采集、运输与保存、处理、核酸提取与检测、结果分析以及相应的生物安全措施。本标准适用于国境口岸出人境腹患者并便样本，呕吐物和可疑食品的轮状病毒（A组）筛查检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用手本文件。凡是不注口期的引用文件，其最新版本（他括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.12003食品卫生微生物学检验总则GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1720-2006出人境口岸轮状病毒感染监测规程3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
轮状病毒rotavirus
属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是引起哺乳动物类和鸟类腹泻的主要病原体。轮状病毒是双链RNA病毒，基因组分11个节段，轮状病毒有7个血清组（A-G），其中A、B、C组与人类疾病有关，A组轮状病毒主要引起儿童腹泻，B组轮状病毒主要引起成人腹泻3.2
荧光PCRfluorescence polymerase chain reaction叉称为实时PCR(real-timePCR).是在普通PCR的基础上利用荧光染料在激发光作用下所释放的荧光光能的变化来直接反映PCR扩增产物量变化的技术。本标准所采用的是TugMan水解探针法，其原理是在常规RT-PCR（反转录聚合酶链式反应）的基础上，加入一条特异性的荧光探针，该探针为一段京核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，利用TaQ酶的5'-3外切酶活性将探针酶切水解，使报告荧光基团和灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成同步。
Ct值cyelethreshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4仪器和设备
4.1荧光定量PCR仪。
SN/T3661—2013
生物安全柜，
普通冰箱（2℃8℃和-20℃两种）。4.4超低温冰箱（-70℃）。
低速低温离心机（离心转速≥6200g）。高速冷冻离心机（离心转速≥13800g，4℃低温）。微量可调移液器（10uL、100uL、1000L）及配套带滤芯吸头离心管（1.5mL）。
涡旋振荡器。
5试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所用试剂均采用无RNA酶污染的容器（用DEPC水处理后高压灭菌)分装。
样本稀释液
商品化磷酸盐缓冲液（PBS：PhosphateBufferedSaline)（含Ca+、Mg+）pH7.2~7.4。也可参见附录A.3配制。
5.2核酸提取试剂
选用病毒RNA提取试剂盒QIAampViralRNAKit试剂盒，德国Qiagan公司产品，内含AVL、AWI、AW2、AVE等成分。
5.3核酸检测试剂
迅必达轮状病毒（A组)核酸检测试剂盒，成都新基因格生物科技有限公司产品\。6
标本的采集
粪便标本
采用无菌螺口便盒采集腹泻患者粪便标本，每份标本5mL~10mL，用耐低温油性记号笔在便盒上做好标记，置丁一20℃保存。轮状病毒感染者出现症状后1d~3d内粪便排毒量最人，因此应尽可能在此期间收集标本。
6.2呕吐物标本
需要进行呕吐物中是否含有轮状病毒时，按照SN/T1720—2006中6.2.3.3进行采样，置4℃保存并立即送检。
6.3可疑食品样本
需要调查食品是否被轮状病毒污染时，按照GB/T4789.1一2003中第3章进行采样，置4℃保存并立即送检，
1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
KAONiKAca
7检测方法
7.1样本处理和保存
粪便样本的处理
SN/T3661—2013
取适量粪便标本加到1.5mL离心管中，加人PBS样本稀释液，制备成10%的便悬液.振荡3次，每次10s.然后静置10min，4℃，6200g离心5min，吸取上清液进行下步试验或一20℃短期保存。7.1.2呕吐物及可疑食品
呕吐物和可疑食品用PBS样本稀释液，制备成20%的悬液，4℃.6200g离心5min，吸取上清进行下一步试验或一20℃短期保存。7.1.3标本保存
标本如需长期保存，建议存放于一70℃冰箱。7.2
核酸提取
按照病毒RNA提取试剂盒说明书提取。7.3
3荧光PCR扩增
引物和探针序列
以轮状病毒VP7区为检测靶序列，引物和探针序列如下：上游引物：5-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCC-3—下游引物：5AA(C/T)TG(C/T)GGTATATTCAATACCATACA-3探针：5-(Fam)-AA(A/G)GAGCTA(A/T)CCG(C/T)TAGCCAGACGG-(eclipse)-37.3.2阳性对照和空白对照设置
每次检测分别设阳性对照和空白对照。阳性对照选用含有检测序列的轮状病毒（A组）的RNA作为荧光PCR反应的模板，空白对照用无菌超纯水作为荧光PCR反应的模板7.3.3荧光PCR反应体系
轮状病毒（A组）反应体系采用如下参数：氯化镁（MgCla）2.5mmol/L、dNTP各0.4mmol/L上下游引物各0.4μmol/L、探针0.2μmol/L、逆转录酶（M-MLV，200U/μL）100U、DNA聚合酶（热启动Taq酶，5U/μL)2.5U、模板RNA2.0μl加无菌超纯水至20μL。逆转录酶M-MLV应去除RnaseH活性。每个样品做两个平行样对照。7.3.4荧光PCR反应程序
若仪器为ABI7500型实时荧光PCR仪2，荧光PCR反应程序采用如下参数：逆转录阶段：42C2）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
-rKoNiKca
SN/T3661—2013www.bzxz.net
10min预变性阶段：94℃，1cs：循环阶段（共40个循环），变性94℃，5s，退火及延仲56℃，60s在退火及延伸过程中检测荧光信号。信号采集设为Fan荧光素。由于不同的荧光定量PCR仪的性能存在差只，可通过条件优化适当调整PCR循环的退火温度及时间。
8结果分析
8.1基线范围设定
如果仪器要求设置基线（baseline）范围，起始循环设置一般大于3，结束循环设置一般比最早出现的扩增曲线提前1～2个循环，
8.2阅值的设定
如果仪器要求设置阅值设定阈值的一般原则是令國值线刚好超过阴性对照的扩增曲线的最高点：也可根据仪器噪音情况进行调整。8.3荧光PCR反应系统的质量控制条件，否则试验结果无效：
反应结果应同时符合以下2个
空白对照：无Ct值（无扩增曲线）：阳性对照：Ct值小于30
8.4荧光PCR检测结果判定及报告荧光PCR检测结果判定及报告
阴性：无Ct值或Ci值
5，且没有出现S形扩增曲线，报告为轮状病毒（A组）荧光PCR检测阴性。
阳性：Ct值<35，且出现S形扩增曲线，报告为轮状病毒（A组）荧光PCR检测阳性。可疑：Ct值在35~40之间且出现S形扩增曲线，可重复实验，如果重复实验仍有明显S形扩增曲线且阴性对照没有污染，可报告为轮状病毒（A组）荧光PCR检测阳性，否则为报告为阴性。生物安全措施
实验室生物安全要求按照GB19489和附录B执行。4
-TKAONTKAca
A.1PBS(A)×10的配方
附录A
（规范性附录）
样品稀释液配方
SN/T3661—2013
氯化钠80g，氯化钾2g，无水磷酸二氢钠11.5g，磷酸二氢钾2g，加去离子超纯水（DDW）至1000mL
A.2PBS(B+C)×50的配方
氯化钙25g，氧化镁25g，加去离子超纯水（DDW）至1000mLA.3PBS(A+B+C)的配方
50×PBS（B+C)1.8mL10×PBS（A）45mL，加去离子超纯水（DDW）至400mL后用作样品稀释液。样品稀释液可以高压灭菌后分装于4℃保存S
KAoNKAca
SN/T3661—2013
附录B
（规范性附录）
生物安全要求
中华人民共和国卫生部发布的人间传染的病原微生物名录》规定，轮状病毒危害程度分类为第三类，所有有关轮状病毒的实验空操作应按照以下规定执行。a）术经培养的轮状病毒感染性材料的操作须在生物安全二级（BSL-2)实验室内进行。b）轮状病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全级（BSL-1)实验室内进行。c)
轮状病毒感染性材料运输包装分类为B类，UN编号为UN3373。
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。