SN/T 3674-2013.Detection and identification of Impatiens necrotic spot virus.
1范围
SN/T 3674规定了凤仙花坏死斑病毒检疫鉴定方法。
SN/T 3674适用于进出境活体植物材料，包括无性繁殖材料、组培苗和苗木中凤仙花坏死斑病毒的检疫与鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
3原理
中文名:凤仙花坏死斑病毒
学名:Impatiens necrotic spot virus
缩写:INSV
分类地位:布尼亚病毒科(Bunyaviridae),番茄斑萎病毒属(Tospovirus)。
INSV的血清学特性和分子生物学特征(参见附录A)是检疫鉴定该病毒的主要依据。
4仪器设备、用具和试剂
4.1 仪器
电子天平(0.000 1 g)、高压灭菌锅、制冰机、涡旋振荡器、高速冷冻离心机、超低温冰箱、微波炉、酶标仪、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽.凝胶成像系统、实时荧光PCR仪。
4.2用具
可调式微量移液器(2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL)及相应的无RNase吸头、无RNase离心管、PCR管、酶联板和研钵等。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3674—2013
凤仙花坏死斑病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Impatiens necrotic spot virus2013-08-30发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-03-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局SN/T3674—2013
本标准主要起草人：李晏、丁元明、张巧萍、寸东义、邓裕亮、曹云华、杜宇、刘忠善、和捷。1范围
凤仙花坏死斑病毒检疫鉴定方法本标准规定了凤仙花坏死斑病毒检疫鉴定方法、SN/T3674—2013
本标准适用于进出境活体植物材料，包括无性繁殖材料、组培苗和苗木中风仙花坏死斑病毒的检疫与鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理
中文名：凤仙花坏死斑病毒
学名：Impatiens necrotic spotvirus缩写：INSV
分类地位：布尼亚病毒科（Bunyaviridae），番茄斑萎病毒属（Tospovirus）。INSV的血清学特性和分子生物学特征（参见附录A）是检疫鉴定该病毒的主要依据仪器设备、用具和试剂
4.1仪器
电子天平（0.0001g）、高压灭菌锅、制冰机、涡旋振荡器、高速冷冻离心机、超低温冰箱、微波炉、酶标仪、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、实时荧光PCR仪。4.2用具
可调式微量移液器（2μL、10μL、100μL.200L、1000μL）及相应的无RNase吸头、无RNase离心管、PCR管、酶联板和研钵等。
4.3试剂
去离子水或蒸馏水应符合GB/T6682中的三级水的要求，超纯水应符合GB/T6682中一级水的要求。
所用试剂为INSVDASELISA检测试剂盒、Trizol、DEPC、液氮、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇、M-MLV反转录酶、TaqDNA聚合酶、DNA分子量标准、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。除有特殊说明外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。没有INSVDAS-ELISA检测试剂盒的，血清学试剂的配制方法见附录B,分子生物学试剂配制见附录C。1
SN/T3674—2013
5检疫鉴定方法
5.1双抗夹心酶联免疫吸附检测（DAS-ELISA）将制备的样品汁液用INSVDAS-ELISA试剂盒检测，每个样品设两个重复。同时设阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照为同样处理的健康组织汁液，空白对照为样品抽提缓冲液。具体操作步骤见附录B。
5.2分子生物学检测
注：实际检测中，可视实验室条件选用以下两种方法中任意开
5.2.1巢式RT-PCR检测
提取样品的总RNA，以RNA为模板反转录合成DNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增，再将第-次PCR产物稀释后作为模板进行第二次PCR，最后对二次PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。同时设阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照为同样处理的健康组织汁液，空白对照为超纯水。具体操作步骤见附录C。
5.2.2实时荧光RT-PCR检测
提取样品的总RNA，以RNA为模板反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR
检测。同时设阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照为同样处理的健康组织汁液，空白对照为超纯水。
具体操作步骤见附录D。
6结果记录与判定
6.1结果记录
DAS-ELISA检测记录各检测反应孔的光密度值，巢式RT-PCR检测有电泳结果照片，实时荧光RT-PCR应有扩增曲线等原始数据。6.2结果判定
6.2.1样品经DAS-ELISA检测为阴性时，判定样品为凤仙花坏死斑病毒阴性。6.2.2样品经DAS-EI.ISA检测为阳性、巢式RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阴性时，判定样品不携带凤仙花坏死斑病毒。6.2.3样品经DAS-ELISA检测为阳性、巢式RTPCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阳性时，判定样品携带凤仙花坏死斑病毒。
7样品保存
经检验确定携带风仙花坏死斑病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核。种子保存在干燥条件下，其他的组织样品（如叶片等）保存在一20℃冰箱中，有条件的保存在一80℃冰箱中更好。做好登记和标记工作。
rKAoNiKAca
A.1名称
中文名：凤仙花坏死斑病毒
学名：Impatiensnecroticspot
缩写：INSV
附录A
（资料性附录）
凤仙花坏死斑病毒相关资料
分类地位：布尼亚病毒科（Bunyaviridae）·番茄斑菱病毒属（Tospouirus）。A.2寄主范围
SN/T3674—2013
该病毒的寄主范围比较广，自然条件下INSV可侵染50个科300多种植物，其中观赏植物39个属（包括乌头属Acontitum、六出花属Azstroemeria、银连花属Anemone、金鱼草属Antirrhinum、秋海棠属Begonia、寒丁子属Bouvardia、翠菊属Callisiephus、凤仙花属Impatiens、Columnea、大丽花属八角金盘Fatsia japonica、火石Duhlia、菊花Dendranthemargrandiflorum、紫芳草Eracumaffine花属Gerbera、唐营蒲属Gladiolus补而草属Limonium 半边莲属Lobelia、海桐花属Pittasporum、报春花属Primula、毛属Ranunculus、蝴蝶兰属PhalaS
石斛属Dendrobium鸟巢蕨AspleniumEustoma grandiflorum
nidus、仙客米Cyclamenpersicum、洋桔便瓜叶菊Senecio cruentus、大岩桐Sinningia speciosa、马蹄莲Zantedeschia aethiopica、朱顶红Hippeastrumhortorum等），蔬菜6个种riumendivia、黄瓜Cucumzssativus、茵苣Lactucasatiuu、（包括辣椒Capsicumannuum、菊苣Ciehor罗勒Ocimumbasilicum和野芭Valerianeltaolitoria等A.3为害症状
INSV引起的症状随寄主和侵染时期不同而变化，主要要表现为矮化、环斑、叶片或茎部的褐色至紫色的斑点、茎部变褐（溃疡）、碎色花，甚至植株死A.4分布地区
欧洲：比利时、法国、德国、意大利、荷兰、波兰、葡萄牙、西班牙、英国、前南斯拉夫和捷克。美洲：美国、加拿大、哥伦比亚、墨西哥、哥斯达黎加和阿根廷亚洲：伊朗、以色列、我国云南省和台湾地区A.5Www.bzxZ.net
5传播方式
A.5.1介体传播
INSV主要由西花葡马Frankliniellaoccidentalis传播。3
rKAoNiKAca
SN/T36742013
种苗传毒
该病毒可通过组培苗、块茎和苗木等无性繁殖材料远距离传播。A.6
基因组
INSV的基因组由含3条单链RNA组成，分别长8776nt，4972nt和2992nt，共编码5个蛋白。-rKNiKca
B.1主要试剂配制
附录B
（规范性附录）
双抗夹心酶联免疫吸附检测（DAS-ELISA）B.1.110×PBST缓冲液（pH7.4）氯化钠(NaCI)
磷酸二氢钾（KH2PO）
磷酸氢二钠（NazHPO.）
氯化钾（KCI）
吐温-20（Twcen-20）
溶于900mL蒸馏水中，调节pH至7.4，定容至1000mL。B.1.2
样品抽提缓冲液（pH7.4）
10XPBST缓冲液
亚硫酸钠（NazSO）
聚乙烯基吡略烷酮（PVP）
登氨钠（NaN：）
吐温-20
溶于800mL蒸馏水中，调节pH至7.4，定容至1000mL。B.1.3
包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（Na,CO）
碳酸氢钠（NaHCO）
溶于900mL蒸馏水中，调节pH至9.6.并定容至1000mL。酶标抗体缓冲液（pH7.4）
10×PBST缓冲液
牛血清白蛋白（BSA）
PVP(MW24 000~40 000)
溶于800mL蒸馏水后定容至1000mL。100mL
B.1.5底物对硝基苯磷酸二钠（PNPP）缓冲液（pH9.8）二乙醇胺
SN/T3674—2013
溶解于600mL无菌蒸馏水中，用浓盐酸（HCl）调节pH至9.8，然后定容至1000mL，B.2
检测方法
注：使用INSVDA.SELISA试剂盒的，检测方法按说明书进行。不使用试剂盒进行检测的按以下步骤进行。-TKAoNiKAca
SN/T3674-—2013
B.2.1实验设计
根据检测需要设计酶联板点样孔的排布，包括阳性对照孔、阴性对照孔、空白对照孔和待测样品孔，各设2个相邻的重复。
B.2.2包被抗体
将包被抗体用包被缓冲液稀释至工作浓度，加入酶联板孔中，每孔中加人100uL，加盖，37℃孵育2h4h或4℃孵育至少12h以上。将酶联板孔中溶液甩干，每孔加人200μL的1×PBST洗涤，放置3.min.然后在滤纸上扣干，共洗涤5次B.2.3制备样品
将待测植物组织进行研磨，并按组织重量和抽提缓冲液体积工10的比例稀释，制备的汁液移入1.5mlL离心管中，12000g离心5min10min后吸取上清液作为待样品。健康组织同样处理，作为阴性对照，样品抽提缓冲液作为空白对照B.2.4加入样品
将100uL待测样品溶液加人到待检测孔中，对照礼中也各加入100μL相应的阴性对照、阳性对照和空白对照，加盖，37℃孵育2h4h或4孵育至少12h以上200uL的1XPBST洗涤，洗涤5次
B.2.5加酶标抗体
将酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液稀释至工作浓度，每孔加孵育2h~4h或4℃孵育至少12h以上。洗涤5次。
B.2.6加底物
将酶联板孔中溶液甩干，
将酶联板孔中溶液甩干，每孔用100L酶标抗体溶液，加盖，37℃每孔用200HL的1XPBST洗涤，
将底物PNPP溶于底物缓冲液中使最终浓度为1mg/mL（现配现用），每孔加人100μuL配好的底物溶液，室温下避光放置0.5h~2h.直至阳性对照出现明显的颜色反应，而阴性对照和空白对照无颜色变化。
B.2.7记录结果
用酶标仪检测在405nm波长下各孔的光密度值并记录。B.3
结果计算和判定
B.3.1平行允许率计算
空白对照和阴性对照的光密度值小于0.15，当阴性对照孔的光密度值小于0.05时，按0.05计算阳性对照有明显的颜色反应，且阳性对照的光密度值阴性对照的光密度值应大于2。达到这一要求时应进行平行允许率计算；达不到要求时应重新检测。孔的重复性以样品光密度值的平行允许率控制，按照以下公式进行计算：p
［D(405)-D(405),IX2
D(405)+D(405):7
KAoKAca
式中：
D(405)
D(405)2
结果判定
平行允许率；
样品重复1的光密度值；
样品重复2的光密度值，
当样品两个重复的光密度值平行允许率（P）大于20%时，应重新进行检测B.3.2.1
SN/T3674—2013
当样品两个重复的光密度值平行允许率（P）小于20%时，按如下原则做出判定：B.3.2.2
样品D（405)/阴性对照D（405)值大于2.判定为阳性；样品D（405)/阴性对照D（405）值为2，判为可疑样品，需重做一次或者用其他方法进行验证：样品D（405)/阴性对照D（405)值小于2，判为阴性。7
SN/T3674—2013
主要试剂配制
电泳缓冲液50×TAE
三羟甲基氨基甲烷(Tris）
冰乙酸
附录C
（规范性附录）
巢式RT-PCR检测
0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA，pH8.0）100mL
溶解于800mL蒸馏水中，定容至1000mL。使用时加蒸馏水稀释至1×TAE。C.1.2
溴化乙锭溶液（1mg/mL）
溴化乙锭20mg溶解于灭菌超纯水并定容至20mlL.。36×加样缓冲液
漠酚蓝
溶于超纯水中，定容至100mL。
检测方法
总RNA提取
取0.1g待测样品组织，用液氮研磨成粉末状，迅速加人1mLTrizol试剂盖住样品，待溶解后继续研磨至混勾，移入1.5mL离心管中，室温静置3min；加人200μL三氟甲烷，剧烈振荡15s，室温静置3min；4℃12000g离心10min，小心吸取上层无色水相到新离心管中；加人等体积异丙醇，颠倒混勾；4℃，12000g离心20min，弃上清液；加人1mL75%冷乙醇洗涤沉淀，4℃，12000g离心5min，弃乙醇，充分干燥沉淀加人50uI.DEPC处理的超纯水或无RNaSe的超纯水，溶解沉淀，存于一80C备用。也可使用RNA提取试剂盒，参照使用说明进行提取。C.2.2
引物序列
第一次PCR反应引物
正向引物INSV-1F：5°-GTTTAGCCTTACCAAT-3；反向引物INSV-2R：5-TACCAACAACCGTGAA-3。扩增片断长度约539bp。
第二次PCR反应引物
正向引物INSV-3F：5'-CTAAGAGAACACCCAAGACA-3：8
反向引物INSV-4F：5-TACCAACAACCGTGAAAAGA-3。扩增片断长度约338bp。
C.2.3反转录合成cDNA
SN/T3674—2013
在PCR管中分别加入20μmol/LINSV-2R引物1μL和总RNA5μL，在70℃温育5min，然后立即置于冰上；放置5min后，再加人DEPC处理的超纯水或无RNase的超纯水7uL、5X反应缓冲液4μL、10mmol/LdNTP1μL，40U/μLRNA酶抑制剂0.5μL和200U/μLM-MLV反转录酶0.5αL，总体积为20uL。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。反应参数：42℃，45min，95℃，10min。合成的cDNA置于一20℃保存备用。也可采用RT-PCR一步法试剂盒，操作步骤按使用说明进行。C.2.4PCR扩增
第一次PCR反应以cDNA为模板进行扩增，第二次PCR反应以稀释50X的第一次PCR反应产物为模板进行扩增。每个样品设2个平行处理。以灭菌超纯水为空白对照。PCR反应体系：10X反应缓冲液2.5uL、25mmol/LMgCl.2.5μL（反应缓冲液中已含有的可不加人）、5mmol/LdVTP1μL，20mmol/L正向引物0.5μL、20mmol/L反向引物0.5μL，5U/μLTag酶0.2uL和模板1uL，用灭菌超纯水补足反应体积至25μL。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。PCR反应条件：94℃预变性3min。按照94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸40s的程序运行35个循环。72℃10min。扩增产物可直接用于下一步PCR扩增、电泳检测或放置于4℃待用。C.2.5琼脂糖凝胶电泳检测
用1XTAE配制1.0%琼脂糖凝胶，加热溶化后冷却至55℃左右。将1mg/mL漠化乙锭加人到配制好的凝胶中，其终浓度为0.5μg/mL，混匀。也可使用其他核酸染色剂，按使用说明操作。将凝胶倒人制胶槽中，插上样品梳。待凝胶冷却凝固后拔出梳子，取出凝胶放人水平电泳槽，在电泳槽内加人足量1×TAE，使缓冲液至少没过凝胶表面约1mm。取1.5μL6×加样缓冲液与8μL第二次PCR产物混合后加人样品孔，并在同一块胶上加入分子量标准物。将电泳槽接通电源，使DNA从负极向正极移动：恒压电泳，达到每厘米3V～5V电压（按两极之间的距离计算）。当加样缓冲液中溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段时，关闭电源。电泳结束后，将整个凝胶置于凝胶成像系统上拍照，记录结果。C.3结果判定
如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期338bp的条带，样品未出现预期大小的条带，则可判定为INSV阴性
如果阴性对照和空白对照木出现条带，阳性对照出现预期338bp的条带，样品出现与阳性样品相同大小的条带，则可判定为INSV阳性。9
SN/T3674—2013
D.1引物和探针设计
引物序列：INSV-QP-F
INSV-QP-R
探针序列：INSV-probe
RNA提取及反转录
附录D
（规范性附录）
实时荧光RT-PCR检测
5-AATGGATCTGCCCTGACTGAAG-3
5-GCAAGATGCTATCAGAGGAAGACT-3'5-FAM-TCACCCTCTGATTGCCTCATATGGTCTTG-TAMRA-3操作方法执行附录C也可采用RT-PCR一步法试剂盒，操作步骤按使用说明进行。实时荧光PCR反应体系
设计样品在上机时的排列，每个样品，阳性对照，阴性对照和空白对照均设2个平行孔，以灭菌超纯水作为空白对照。
使用市售的实时荧光PCR试剂盒进行反应参照试剂盒说明加人试剂，使引物和探针的终浓度分反应体系中加入CDNA2uL。
别为0.4μmol/L和0.2μmol/L，且20℃变性，30%、60℃退火延伸30s的程序运行40个循环。反应参数：预变性95℃3min按照95保存文件，点击运行开始PCR反应。反应结束后，打开分析软件，仪器自动分析试验结果，给出△Rn（荧光信号增加值）与循环数之间关系的图像。
结果判定
空白对照和阴性对照的Ct值没有显示或者显示为40，则实验有效：否则，实验无效，应重新进行实验。
待测样品的Ct值没有显示或者显示为40时，则判定未检测到风仙花坏死斑病毒。待测样品的Ct值小于或等于35时，则判定检测到凤仙花坏死斑病毒。待测样品的Ct值小于40而大于35时，应重新进行测试。如果重新测试的Ct值为40时，则判定末检测到凤仙花坏死斑病毒。如果重新测试的Ct值小于40而大于35时，则判定检测到风仙花坏死斑病毒。
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