SN/T 3685-2013
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标准简介
SN/T 3685-2013.Detection and identification of Leptos phaeria maculans ( Desm)Ces. & De Not.
1范围
SN/T 3685规定了油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定方法。
SN/T 3685适用于十字花科植物及植物产品中油菜茎基溃疡病菌的检疫和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3油菜茎基溃疡病菌基本信息
学名:Leptosphaeria maculans (Desm)Ces.& De Not.
分类地位:真菌界(Fungi),子囊菌门( Ascomycota),座囊菌纲( Dothideomycetes),格孢腔菌目
(Pleosporales),格孢腔菌科( Pleosporaceae),小球腔菌属( Leptosphaeria),无性态为黑胫茎点霉[Phoma lingam(Tode ex Schw.)Desm]。
传播途径:感病的植株、病残体以及受侵染的种子等植物性材料是远距离传播主要途径。
油菜茎基溃疡病菌的其他信息参见附录A、附录B。
4方法原理
根据油菜茎基溃疡病菌在寄主上的为害症状,培养基上生长的菌落、菌丝、分生孢子和分生孢子器形态,以及PCR特异扩增片段大小等特征进行结果判定。
5仪 器设备和主要试剂
5.1仪器设 备
生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、实时荧光PCR仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器。
1范围
SN/T 3685规定了油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定方法。
SN/T 3685适用于十字花科植物及植物产品中油菜茎基溃疡病菌的检疫和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3油菜茎基溃疡病菌基本信息
学名:Leptosphaeria maculans (Desm)Ces.& De Not.
分类地位:真菌界(Fungi),子囊菌门( Ascomycota),座囊菌纲( Dothideomycetes),格孢腔菌目
(Pleosporales),格孢腔菌科( Pleosporaceae),小球腔菌属( Leptosphaeria),无性态为黑胫茎点霉[Phoma lingam(Tode ex Schw.)Desm]。
传播途径:感病的植株、病残体以及受侵染的种子等植物性材料是远距离传播主要途径。
油菜茎基溃疡病菌的其他信息参见附录A、附录B。
4方法原理
根据油菜茎基溃疡病菌在寄主上的为害症状,培养基上生长的菌落、菌丝、分生孢子和分生孢子器形态,以及PCR特异扩增片段大小等特征进行结果判定。
5仪 器设备和主要试剂
5.1仪器设 备
生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、实时荧光PCR仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3685—2013
油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Leptosphaeria maculans(Desm)Ces.&DeNot.2013-08-30发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-03-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草SN/T3685—2013
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖北出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院，中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、华中农业大学等本标准主要起草人：赵晖、王振华、易建平、吴翠萍、李彬、周国梁、曾宪东、吴品珊、李国庆1范围
油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法本标准规定了油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定方法本标准适用于十字花科植物及植物产品中油菜茎基溃疡病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件
SN/T3685—2013
下列文件对于本义件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3油菜茎基溃疡病菌基本信息
学名：Leptosphaeriamaculans(Desm)Ces.&DeNot.分类地位：真菌界（Fungi)），子囊菌门（Ascomycota），座囊菌纲（Dothideomycetes），格孢腔菌目（Pleosporales），格孢腔菌科（Pleosporaceae），小球腔菌属（Leptosphaeria），无性态为黑胫茎点霉Phomalingam(TodeexSchw.Desm
传播途径：感病的植株、病残体以及受侵染的种子等植物性材料是远距离传播主要途径油菜茎基溃疡病菌的其他信息参见附录A、附录B4方法原理
根据油菜茎基溃疡病菌在寄主上的为害症状，培养基上生长的菌落、菌丝、分生抱子和分生孢子器形态，以及PCR特异扩增片段大小等特征进行结果判定。5仪器设备和主要试剂
5.1仪器设备
生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、实时荧光PCR仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器。5.2主要试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682中规定的要求。5.2.11%次氯酸钠。
5.2.2DNA提取试剂：DNA提取试剂盒，异丙醇，无水乙醇。尿素提取液（7mol/LUrea、50mmol/LTris-HClpH8.0、62.5mmol/1.NaCl、1%SDS），蛋白酶K（20mg/mL），苯酚：三氧甲烷：异戊醇（25：24:1)溶液，3mol/LNaAc(pH5.2)。5.2.3PCR试剂：10XPCR缓冲液（含25mmol/LMgSO.），Tag酶，dNTP1
SN/T3685—2013
5.2.4凝胶电泳试剂：琼脂糖，TAE，LoadingBuffer，EB5.2.5麦芽琼脂培养基：麦芽提取物6.0g，琼脂3.0g，蒸馏水200mL，调整pH至5.2，121℃，15min灭菌。
5.2.6马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）.马铃薯浸粉5.0g葡萄糖20.0g，氯霉素0.1g，琼脂13.0g，蒸馏水定容至1000mL，调整pH值至5.6，121C高压灭菌20min病菌的鉴定
6.1症状检查
6.1.1取样
取样品量1%~5%（若样品公可适量增大比例）的种子，植株的落根部和叶部进行检查。6.1.2种子症状检查
在解镜下挑选皱缩、干癌、变色、残缺的种子或有霉变的籽粒或病残体，每份种子样品挑选不少于500粒，用做病原菌的分离。另取1kg种子用孔径2.5mm和1.5mm的网筛过筛，取筛上物、筛下物和种子各1g~2g用于DNA提取
6.1.3植株症状检查
主要检查茎根部和叶部。选取叶片上出现圆形或不规则形、硝口陷、中部灰白色病斑、部分斑内散生许多小黑点症状的病变部位。植基则选取不规则形谈褐包斑，或灰白色病斑、稍凹陷、上生黑色小点，或茎基及根系溃疡、枯萎症状的病变部位（见附录B6.2PCR初筛
6.2.1样品DNA提取
取筛上物、筛下物和种子，或植株可疑病变组织各1g～2液氮研磨后各取样0.1g~0.2g.采用商业化试剂盒提取DNA（见附录）6.2.2PCR检测
PCR检测方法见附录D和附录E，重复3次，用油菜基溃疡病菌标准菌株DNA作阳性对照，用灭菌蒸馏水作空白对照、
若PCR初筛结果为阴性，不用做以下实验；若PCR初筛结果为阳性，继续以下实验，6.3分离培养
种子病原菌的分离培养
将挑选的带菌种子置于灭菌蒸馏水中室温浸泡处理1d，转人一20℃下冷冻处理1d，1%次氯酸钠消毒5min~7min.无菌水洗涤3次后，按25粒/m置于麦芽琼脂培养基或PDA培养基上，在20℃~25℃，12h黑暗/12h光照（12h光暗交替）条件下培养，第5天开始观察。6.3.2植株病原菌的分离培养
用解剖刀取植株病健交界处的组织：剪成约0.4cm×0.4cm小段，用1%的次氮酸钠溶液消毒5min，无菌水洗涤3次，火菌滤纸吸干水分后置于麦芽琼脂培养基或PDA培养基上，同6.3.1培养观察。2
KAONIKAca
6.4鉴定特征
SN/T3685—2013
该病菌在培养基上菌落边缘不整齐、有结节状颗粒点，气生菌丝白色、多而致密，分枝较多，有分隔。挑取见到的菌丝结制片，置于体视显微镜下观察。分生孢子器直径150um~225um，球形至扁球形褐色至深黑褐色，散生、埋生或半埋生于菌丝中，有空口1个~2个，部分分生孢子器从孔口处溢出浅粉红色胶质状粘液（见附录B）。分生孢子（Phomalingam）无色透明，椭圆形至纺锤形，两端常见各1个油球，孢子大小（3.3um~6.0um）×（l.4um~2.3μm）如产生分生孢子器，转人麦芽琼脂培养基或PDA培养基，31℃黑暗条件下培养20d，观察产生的色素，该病菌在PDA上不产生黑色色素。PCR检测
采用商业化试剂盒或尿素法（见附录C)提取疑似分离物DNA，按安6.2.2中的方法进行PCR检测。6.6致病性测定
在P3实验室，选取健康的westar或宁波7号等感病品种的油菜籽种植，在长出2片子叶后做致病性测试。将形态特征与油菜茎基溃疡病菌形态特征相符且PCR检测阳性的分离物，用无菌水配制每毫升10”个分生孢子液，针刺接种叶片，黑暗保湿1d，置于15℃～20℃下生长、观察（剪掉生出的心叶）。接种5d～8d后接种点附近出现圆形浅褐色枯死斑，稍凹陷，对发病子叶再做病原菌分离7结果判定
若6.2.2PCR初筛为阴性，可报告未检出油菜茎基溃疡病菌：若6.2.2PCR初筛和6.5病菌的分离物PCR检测为阳性，且形态特征符合6.4中的描述，可报告检出油菜茎基溃疡病菌。首次检出油菜茎基溃疡病菌，需做致病性测定实验
8样品保存
8.1样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后要善保存。对检出油菜茎基溃疡病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。8.2菌株保存与处理
从检测样品中分离并鉴定为油菜茎基溃疡病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于麦芽琼脂培养基或PDA培养基斜面上，20℃～25℃培养4d.然后4℃冰箱保存，或将菌丝块转人20%灭菌甘油并混匀，一80℃长期保存。对不需要长期保存的菌株应及时高压火菌处理8.3结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。3
TKAONIKAca
SN/T3685—2013
附录A
（资料性附录）
油菜茎基溃疡病菌的世界分布
目前在世界范围内.该病原菌广泛分布的国家有：欧洲：澳大利亚、保加利亚、捷克、川麦、爱沙尼亚、芬兰、法国、德国、匈牙利、爱尔兰、意大利、拉脱维亚、列支敦士登、立陶宛、马耳他、荷兰、挪威、波兰、罗马尼亚、俄罗斯、斯洛伐克、西班牙、瑞典、瑞士、乌克兰、英国。
亚洲：亚美尼亚、格鲁吉亚、印度、伊朗、以色列、日本、哈萨克斯坦、韩国、朝鲜、吉尔吉斯坦、马来西亚、巴基斯坦、菲律宾、泰国、土耳其。非洲：埃及、埃塞俄比亚、肯尼亚、莫桑比克、尼日利亚、南非、赞比亚、津巴布韦。中美洲和地中海地区哥斯达黎加、萨尔瓦多、巴拿马、波多黎各。北美洲：加拿大、墨西哥、美国。南美洲：阿根廷、巴西
大洋洲：澳大利亚、新喀里多尼亚、新西兰、巴布亚新几内亚。iKAoNiKca
a）叶片危害状
附录B
（规范性附录）
感病植株和种子的症状、病菌形态特征图b）茎基部危害状
山）菌落有结节状颗粒点
注：引自刘胜毅和BruceFitt
e）孢子器从孔口处溢出浅粉
红色胶质状粘液
感病植株和种子的症状，病菌形态特征图SN/T3685-—2013
c）种子危害状
f)分生孢子
KAONiKAca
SN/T 3685-2013
试剂盒提取DNA的方法
附录C
（规范性附录）
油菜茎基溃疡病菌DNA的提取方法将油菜籽、菜粕用液氮碾碎
取40mg到1.5mLEP管.加600L核酸裂解液65℃水浴20min，温和的混匀。
取出回温到37℃，加RNA酶3L
温和的混匀，放37℃15m
冷却至室温，加蛋白沉淀液200μL，混匀14000r/min离心3min，取上清液600μL加人异丙醇600，温和的混勾，静置5mim14000r/min离心1min，弃掉上清液，加70%乙醇600μL，温和的颠倒混匀。14000r/min离心1minm弃上清液（用枪吸T）.放置丁吸水纸上晾干（15min）。加人100LDNA重悬液，如果DNA很少，就加30uL，65C温育1h或4℃过夜
14000/min离心1min取1进行PCR扩增。尿素法提取菌丝DNA的方法
取500uL尿素提取液（7
50mmol/LTris-1IClpH8.0.62.5mmol/LNaCl.1%Urea、
SDS)与10μL.20mg/ml.蛋白酶K至EP管中，挑取
C.2.255C温育30min，每隔
振荡混匀1次
200mg菌丝至1
EP管，混匀。
1200rmin离心5min，将上清液移人另一EP24：1）溶液，颠倒混匀，13000r/min离心10min。异戊醇（25
管中，加入等体积的苯：氯仿
1/10体积的3mol/LNaAc（pH5.2），20℃放C.2.3取上清到另一EP管中加人等体积的异丙醇和置20min，13000r/min离心10
%乙醇洗涤，室湿倒置于吸水纸上晾十，溶于20uLTE溶液中，加入C.2.4弃上清液，倒置晾，用70
RNascA（1μg/μL)1μL，13000r/mim离心10min，弃上清，37℃水浴30min，-20℃保存备用。6
IKoNiKca
D.1PCR扩增
D.1.1定性PCR选择一
油菜茎基溃疡病菌L.macul
附录D
（规范性附录）
定性PCR方法Www.bzxZ.net
持特异性弓物
SN/T3685—2013
5-GCGTAAGAAGCGTGCCT
增产物为580bp。
IACTOCTTCTCTAGC-3.预期护
TAGAGTC-35-TCCTGCTCC
油菜茎基溃疡病菌定性PCR
检测反应体系见表D.1。
PCR反应程序为94℃5min.9430g5830s，7240s35个循环；72℃7min。D.1.2
定性PCR选择二
油菜茎基溃疡病菌L.maculans特异性引物二m6.5CACCAATTGGATCCCCTA-3'/5-AGGCGAGTCCCAAGTGGAACA-3
预期扩增产物为276bp
油菜茎基溃疡病菌定性PCR
检测反应体系见表D.1。
PCR反应程序为94℃3mir
n:9430s.56C30s72C30s
试剂名称
PCRbuffer(含25mmol/LMgSO）
正义引物
反义引物
TaqDNA聚合酶
DNA模板
2PCR扩增产物检测
35个循环：72℃5min。
检测油菜茎基溃疡病菌定性PCR反应体系浓
50mg/ul
加样量/μL
补至25μl
扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳，EB染色后用凝胶成像系统分析。D.3结果判定
PCR扩增产物检测，阳性对照出现一条580bp定性PCR选择）或276bp(定性PCR选择二）的DNA片段，阴性对照和空白对照没有该核酸条带，待检样品如出现580bp（定性PCR选择-）或276bp（定性PCR选择二）的DNA片段为检测结果阳性.如末出现580bp（定性PCR选择一）或276bp（定性PCR选择二)的DNA片段为检测结果阴性。SN/T3685—2013
荧光PCR检测
附录E
（规范性附录）
实时荧光PCR方法
荧光PCR选择一：上游ForwardPrimer：5-CCCCCTACTAGAAGAGTTATAGCACTT-3下游ReverscPrimer:5-CCTAAGATCCTCCTATTATAGAGAGCC-3”;MGBTaqMan探针5-FAM-CTTATTAAAGAGCGCTAAGTA-MGB-3荧光PCR选择二：LMf上游：5-GTTTCCTTGGTGGGCTTGC-3”，LMr下游：5-TGTTACTGACGCTGACTGCAATT-3”MGB-TaqMan探针5'-(FAM)ATTGGATCCCCTAAAACC（NFQ-MGB)-3荧光PCR选择三：Lmb3：5-CACCAATTGGATCCCCTA-3，R2.5'-GGCGCAAAATGTGCTGCGCT-3.Probe-M探针5-(FAM)CACTTGGGACTCGC(MGB）3*。油菜茎基溃疡病菌实时荧光PCR检测反应体系见表E.1。表E.1油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR反应体系试剂名称
PCRbuffer(含25mmol/LMgSO,)
正义引物
反义引物
TagDNA聚合酶
DNA模板
各2.5mmol/L
10μmol/L
1aμmol/L
5U/μL
10μmal/1.
≥50 ng/μL
PCR反应程序：95℃10min；9515s.60℃1min，循环40次，E.2
结果判定
阳性对照（Ct值27.阴性对照和实白对照没有扩增或（t值>40：加样量/uL
补至25μL
样品Ct值≤35为阳性：若在35与40之间，需重复试验，重复结果Ct值仍在35与40之问，判为阳性，否则判为阴性；
样品无扩增或Ct值>40，为阴性。8
参考文献
SN/T3685—2013
［1］工振华，李风新，赵晖，等.加拿大进境油菜籽加工过程中油菜茎基渍疡病菌的检测与鉴定2010年进出境植物检疫学术研讨会论文集.155-156，[2］易建平，周国梁，印丽萍，等.进境澳大利亚油菜籽中茎基溃疡病菌的检测.2010年进出境植物检疫学术研讨会论文集.232-234，[3］王振华，赵晖，宋祺，等.油菜茎基溃疡病菌基因组DNA提取方法的比较.湖北农业科学，2011,50(3):511-513.
［4］王振华，杨武，赵晖，等.加拿大进境油菜籽茎基溃疡病菌的检测与鉴定.华中农业大学学报2011,30(1):66-69.
［5］周国染，尚琳琳，林泓，等.油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检测.植物病埋学报，2011，41(1)：10-17.
[6]JANETL.TAYLOR.1993.ASimple,Sensitive,andRapidMethod for Detecting Seed Contaminated with Highly Virulent Leplosphaeria maculans.APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY.p.3681-3685.
[7]S.Y.Liu,z.Liu,B.D.L.Fitt,N.Evans,.J.Foster,Y.J.Huang,A.O.Latunde-Dadaand J.A.Lucas.2006.Resistance toLeptosphaeriamaculans(phoma stemcanker)in Brassica napus(oilseedrape) induced by L.biglobosa and chemical defence activators in field and controlled environiments.PlantPathology（2006)55,401-412)[8]O.Moreno-Rico,G.Seguin-Swartz.J.A.Nettleton.J.J.Luna Ruiz,A.G.Frias-Trevino,and S.Romero-Cova.2oo2.Mexican isolates of Leptosphaeria tmaculans belong to the aggressive strain of thcfungus.Can.J.PlantPathol.
[9]Y.Dion.R,K.Gugel_9G.F.W.Rakow,G.S6guin-Swartz_9B.S.Landry.1995.RFLPmappingof resistance to the blackleg disease_causal agent,Leptosphacria maculans (Desm.) Ces.et de Not.Jincanola(BrassicanapusL.).TheorApplGenet（(1995)9l:1190-1194.[1oJG.A.Petrie and P.A.Lewis.1985.Sexual compatibilityof isolates of the rapeseed blacklegfungus Leptosphaeriamaculansfrom Canada,Australia,andEngland.CANADIANJOURNAL OFPL.ANTPATHOLOGY7.253-255.
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油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Leptosphaeria maculans(Desm)Ces.&DeNot.2013-08-30发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-03-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草SN/T3685—2013
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖北出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院，中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、华中农业大学等本标准主要起草人：赵晖、王振华、易建平、吴翠萍、李彬、周国梁、曾宪东、吴品珊、李国庆1范围
油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法本标准规定了油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定方法本标准适用于十字花科植物及植物产品中油菜茎基溃疡病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件
SN/T3685—2013
下列文件对于本义件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3油菜茎基溃疡病菌基本信息
学名：Leptosphaeriamaculans(Desm)Ces.&DeNot.分类地位：真菌界（Fungi)），子囊菌门（Ascomycota），座囊菌纲（Dothideomycetes），格孢腔菌目（Pleosporales），格孢腔菌科（Pleosporaceae），小球腔菌属（Leptosphaeria），无性态为黑胫茎点霉Phomalingam(TodeexSchw.Desm
传播途径：感病的植株、病残体以及受侵染的种子等植物性材料是远距离传播主要途径油菜茎基溃疡病菌的其他信息参见附录A、附录B4方法原理
根据油菜茎基溃疡病菌在寄主上的为害症状，培养基上生长的菌落、菌丝、分生抱子和分生孢子器形态，以及PCR特异扩增片段大小等特征进行结果判定。5仪器设备和主要试剂
5.1仪器设备
生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、实时荧光PCR仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器。5.2主要试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682中规定的要求。5.2.11%次氯酸钠。
5.2.2DNA提取试剂：DNA提取试剂盒，异丙醇，无水乙醇。尿素提取液（7mol/LUrea、50mmol/LTris-HClpH8.0、62.5mmol/1.NaCl、1%SDS），蛋白酶K（20mg/mL），苯酚：三氧甲烷：异戊醇（25：24:1)溶液，3mol/LNaAc(pH5.2)。5.2.3PCR试剂：10XPCR缓冲液（含25mmol/LMgSO.），Tag酶，dNTP1
SN/T3685—2013
5.2.4凝胶电泳试剂：琼脂糖，TAE，LoadingBuffer，EB5.2.5麦芽琼脂培养基：麦芽提取物6.0g，琼脂3.0g，蒸馏水200mL，调整pH至5.2，121℃，15min灭菌。
5.2.6马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）.马铃薯浸粉5.0g葡萄糖20.0g，氯霉素0.1g，琼脂13.0g，蒸馏水定容至1000mL，调整pH值至5.6，121C高压灭菌20min病菌的鉴定
6.1症状检查
6.1.1取样
取样品量1%~5%（若样品公可适量增大比例）的种子，植株的落根部和叶部进行检查。6.1.2种子症状检查
在解镜下挑选皱缩、干癌、变色、残缺的种子或有霉变的籽粒或病残体，每份种子样品挑选不少于500粒，用做病原菌的分离。另取1kg种子用孔径2.5mm和1.5mm的网筛过筛，取筛上物、筛下物和种子各1g~2g用于DNA提取
6.1.3植株症状检查
主要检查茎根部和叶部。选取叶片上出现圆形或不规则形、硝口陷、中部灰白色病斑、部分斑内散生许多小黑点症状的病变部位。植基则选取不规则形谈褐包斑，或灰白色病斑、稍凹陷、上生黑色小点，或茎基及根系溃疡、枯萎症状的病变部位（见附录B6.2PCR初筛
6.2.1样品DNA提取
取筛上物、筛下物和种子，或植株可疑病变组织各1g～2液氮研磨后各取样0.1g~0.2g.采用商业化试剂盒提取DNA（见附录）6.2.2PCR检测
PCR检测方法见附录D和附录E，重复3次，用油菜基溃疡病菌标准菌株DNA作阳性对照，用灭菌蒸馏水作空白对照、
若PCR初筛结果为阴性，不用做以下实验；若PCR初筛结果为阳性，继续以下实验，6.3分离培养
种子病原菌的分离培养
将挑选的带菌种子置于灭菌蒸馏水中室温浸泡处理1d，转人一20℃下冷冻处理1d，1%次氯酸钠消毒5min~7min.无菌水洗涤3次后，按25粒/m置于麦芽琼脂培养基或PDA培养基上，在20℃~25℃，12h黑暗/12h光照（12h光暗交替）条件下培养，第5天开始观察。6.3.2植株病原菌的分离培养
用解剖刀取植株病健交界处的组织：剪成约0.4cm×0.4cm小段，用1%的次氮酸钠溶液消毒5min，无菌水洗涤3次，火菌滤纸吸干水分后置于麦芽琼脂培养基或PDA培养基上，同6.3.1培养观察。2
KAONIKAca
6.4鉴定特征
SN/T3685—2013
该病菌在培养基上菌落边缘不整齐、有结节状颗粒点，气生菌丝白色、多而致密，分枝较多，有分隔。挑取见到的菌丝结制片，置于体视显微镜下观察。分生孢子器直径150um~225um，球形至扁球形褐色至深黑褐色，散生、埋生或半埋生于菌丝中，有空口1个~2个，部分分生孢子器从孔口处溢出浅粉红色胶质状粘液（见附录B）。分生孢子（Phomalingam）无色透明，椭圆形至纺锤形，两端常见各1个油球，孢子大小（3.3um~6.0um）×（l.4um~2.3μm）如产生分生孢子器，转人麦芽琼脂培养基或PDA培养基，31℃黑暗条件下培养20d，观察产生的色素，该病菌在PDA上不产生黑色色素。PCR检测
采用商业化试剂盒或尿素法（见附录C)提取疑似分离物DNA，按安6.2.2中的方法进行PCR检测。6.6致病性测定
在P3实验室，选取健康的westar或宁波7号等感病品种的油菜籽种植，在长出2片子叶后做致病性测试。将形态特征与油菜茎基溃疡病菌形态特征相符且PCR检测阳性的分离物，用无菌水配制每毫升10”个分生孢子液，针刺接种叶片，黑暗保湿1d，置于15℃～20℃下生长、观察（剪掉生出的心叶）。接种5d～8d后接种点附近出现圆形浅褐色枯死斑，稍凹陷，对发病子叶再做病原菌分离7结果判定
若6.2.2PCR初筛为阴性，可报告未检出油菜茎基溃疡病菌：若6.2.2PCR初筛和6.5病菌的分离物PCR检测为阳性，且形态特征符合6.4中的描述，可报告检出油菜茎基溃疡病菌。首次检出油菜茎基溃疡病菌，需做致病性测定实验
8样品保存
8.1样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后要善保存。对检出油菜茎基溃疡病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。8.2菌株保存与处理
从检测样品中分离并鉴定为油菜茎基溃疡病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于麦芽琼脂培养基或PDA培养基斜面上，20℃～25℃培养4d.然后4℃冰箱保存，或将菌丝块转人20%灭菌甘油并混匀，一80℃长期保存。对不需要长期保存的菌株应及时高压火菌处理8.3结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。3
TKAONIKAca
SN/T3685—2013
附录A
（资料性附录）
油菜茎基溃疡病菌的世界分布
目前在世界范围内.该病原菌广泛分布的国家有：欧洲：澳大利亚、保加利亚、捷克、川麦、爱沙尼亚、芬兰、法国、德国、匈牙利、爱尔兰、意大利、拉脱维亚、列支敦士登、立陶宛、马耳他、荷兰、挪威、波兰、罗马尼亚、俄罗斯、斯洛伐克、西班牙、瑞典、瑞士、乌克兰、英国。
亚洲：亚美尼亚、格鲁吉亚、印度、伊朗、以色列、日本、哈萨克斯坦、韩国、朝鲜、吉尔吉斯坦、马来西亚、巴基斯坦、菲律宾、泰国、土耳其。非洲：埃及、埃塞俄比亚、肯尼亚、莫桑比克、尼日利亚、南非、赞比亚、津巴布韦。中美洲和地中海地区哥斯达黎加、萨尔瓦多、巴拿马、波多黎各。北美洲：加拿大、墨西哥、美国。南美洲：阿根廷、巴西
大洋洲：澳大利亚、新喀里多尼亚、新西兰、巴布亚新几内亚。iKAoNiKca
a）叶片危害状
附录B
（规范性附录）
感病植株和种子的症状、病菌形态特征图b）茎基部危害状
山）菌落有结节状颗粒点
注：引自刘胜毅和BruceFitt
e）孢子器从孔口处溢出浅粉
红色胶质状粘液
感病植株和种子的症状，病菌形态特征图SN/T3685-—2013
c）种子危害状
f)分生孢子
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试剂盒提取DNA的方法
附录C
（规范性附录）
油菜茎基溃疡病菌DNA的提取方法将油菜籽、菜粕用液氮碾碎
取40mg到1.5mLEP管.加600L核酸裂解液65℃水浴20min，温和的混匀。
取出回温到37℃，加RNA酶3L
温和的混匀，放37℃15m
冷却至室温，加蛋白沉淀液200μL，混匀14000r/min离心3min，取上清液600μL加人异丙醇600，温和的混勾，静置5mim14000r/min离心1min，弃掉上清液，加70%乙醇600μL，温和的颠倒混匀。14000r/min离心1minm弃上清液（用枪吸T）.放置丁吸水纸上晾干（15min）。加人100LDNA重悬液，如果DNA很少，就加30uL，65C温育1h或4℃过夜
14000/min离心1min取1进行PCR扩增。尿素法提取菌丝DNA的方法
取500uL尿素提取液（7
50mmol/LTris-1IClpH8.0.62.5mmol/LNaCl.1%Urea、
SDS)与10μL.20mg/ml.蛋白酶K至EP管中，挑取
C.2.255C温育30min，每隔
振荡混匀1次
200mg菌丝至1
EP管，混匀。
1200rmin离心5min，将上清液移人另一EP24：1）溶液，颠倒混匀，13000r/min离心10min。异戊醇（25
管中，加入等体积的苯：氯仿
1/10体积的3mol/LNaAc（pH5.2），20℃放C.2.3取上清到另一EP管中加人等体积的异丙醇和置20min，13000r/min离心10
%乙醇洗涤，室湿倒置于吸水纸上晾十，溶于20uLTE溶液中，加入C.2.4弃上清液，倒置晾，用70
RNascA（1μg/μL)1μL，13000r/mim离心10min，弃上清，37℃水浴30min，-20℃保存备用。6
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D.1PCR扩增
D.1.1定性PCR选择一
油菜茎基溃疡病菌L.macul
附录D
（规范性附录）
定性PCR方法Www.bzxZ.net
持特异性弓物
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5-GCGTAAGAAGCGTGCCT
增产物为580bp。
IACTOCTTCTCTAGC-3.预期护
TAGAGTC-35-TCCTGCTCC
油菜茎基溃疡病菌定性PCR
检测反应体系见表D.1。
PCR反应程序为94℃5min.9430g5830s，7240s35个循环；72℃7min。D.1.2
定性PCR选择二
油菜茎基溃疡病菌L.maculans特异性引物二m6.5CACCAATTGGATCCCCTA-3'/5-AGGCGAGTCCCAAGTGGAACA-3
预期扩增产物为276bp
油菜茎基溃疡病菌定性PCR
检测反应体系见表D.1。
PCR反应程序为94℃3mir
n:9430s.56C30s72C30s
试剂名称
PCRbuffer(含25mmol/LMgSO）
正义引物
反义引物
TaqDNA聚合酶
DNA模板
2PCR扩增产物检测
35个循环：72℃5min。
检测油菜茎基溃疡病菌定性PCR反应体系浓
50mg/ul
加样量/μL
补至25μl
扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳，EB染色后用凝胶成像系统分析。D.3结果判定
PCR扩增产物检测，阳性对照出现一条580bp定性PCR选择）或276bp(定性PCR选择二）的DNA片段，阴性对照和空白对照没有该核酸条带，待检样品如出现580bp（定性PCR选择-）或276bp（定性PCR选择二）的DNA片段为检测结果阳性.如末出现580bp（定性PCR选择一）或276bp（定性PCR选择二)的DNA片段为检测结果阴性。SN/T3685—2013
荧光PCR检测
附录E
（规范性附录）
实时荧光PCR方法
荧光PCR选择一：上游ForwardPrimer：5-CCCCCTACTAGAAGAGTTATAGCACTT-3下游ReverscPrimer:5-CCTAAGATCCTCCTATTATAGAGAGCC-3”;MGBTaqMan探针5-FAM-CTTATTAAAGAGCGCTAAGTA-MGB-3荧光PCR选择二：LMf上游：5-GTTTCCTTGGTGGGCTTGC-3”，LMr下游：5-TGTTACTGACGCTGACTGCAATT-3”MGB-TaqMan探针5'-(FAM)ATTGGATCCCCTAAAACC（NFQ-MGB)-3荧光PCR选择三：Lmb3：5-CACCAATTGGATCCCCTA-3，R2.5'-GGCGCAAAATGTGCTGCGCT-3.Probe-M探针5-(FAM)CACTTGGGACTCGC(MGB）3*。油菜茎基溃疡病菌实时荧光PCR检测反应体系见表E.1。表E.1油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR反应体系试剂名称
PCRbuffer(含25mmol/LMgSO,)
正义引物
反义引物
TagDNA聚合酶
DNA模板
各2.5mmol/L
10μmol/L
1aμmol/L
5U/μL
10μmal/1.
≥50 ng/μL
PCR反应程序：95℃10min；9515s.60℃1min，循环40次，E.2
结果判定
阳性对照（Ct值27.阴性对照和实白对照没有扩增或（t值>40：加样量/uL
补至25μL
样品Ct值≤35为阳性：若在35与40之间，需重复试验，重复结果Ct值仍在35与40之问，判为阳性，否则判为阴性；
样品无扩增或Ct值>40，为阴性。8
参考文献
SN/T3685—2013
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