SN/T 3711-2013.Detection and identification of alder yellows phytoplasma.
1范围
SN/T 3711规定了桤树黄化植原体的检测鉴定方法。
SN/T 3711适用于桤树苗木等繁殖材料或产品中桤树黄化植原体的检疫和鉴定。
2桤树黄化植原体基本信息
英文名:Alder yellows phytoplasma
分类地位:软壁菌门(Tenericutes)，柔膜菌纲( Molicutes)，非固醇菌原体目(Acholeplasmatales),非固醇菌原体科( Acholeplasmataceae),植原体属(Candidatus Phytoplasma), 榆树黄化植原体群A亚组(16SrV-A)。
远距离传播主要途径为带菌苗木。
桤树黄花植原体近似种主要包括榆树黄花植原体群A亚组(16SrV-A)的其他三种植原体,即榆树
黄花植原体、榆树丛枝植原体.悬钩子矮化植原体。
其他背景资料参见附录A。
3方法原理
桤树黄化植原体的寄主范围、症状特点、I6S rDNA序列及其RFLP指纹图谱分析等方法是检测鉴定该植原体的主要依据。
4仪器、用具及试剂
4.1 仪器
PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅制冰机、台式冷东离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、电泳仪和凝胶成像系统。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3711—2013
树黄化植原体检疫鉴定方法
Detection and identification of alder yellows phytoplasma2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照（GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准山国家认证认可监督管理委员会提出并归I。SN/T3711—2013
木标准起草单位：中华人民其和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中国检验检疫科学研究院、中国农业大学。本标准主要起草人：冯建军，牟海青、郑耘、赵文军、龙海.王红英、岁来鑫、李健强、帝桂明1范围
档树黄化植原体检疫鉴定方法
本标准规定了档树黄化植原体的检测鉴定方法本标准适用于档树苗木等繁殖材料或产品中档树黄化植原体的检疫和鉴定。2档树黄化植原体基本信息
英文名：AlderyellowsphytoplasmaSN/T3711—2013
分类地位：软壁菌门（Tenericutes），柔膜菌纲（Mollieutes），非固醇菌原体目（Acholeplasmalales）非固醇菌原体科（Acholeplasmataceae），植原体属（CandidatusPhytoplasma），榆树黄化植原体群A亚组（16SrV-A）
远距离传播主要途径为带菌苗木档树黄花植原体近似种主要包括愉树黄花植原体群A业组（16SrV-A）的其他三种植原体，即榆树黄花植原体、榆树丛枝植原体、悬钩子矮化植原体。其他背景资料参见附录A。
3方法原理
树黄化植原体的寄主范围、症状特点、16SrDNA序列及其RFLP指纹图谱分析等方法是检测鉴定该植原体的主要依据。
4仪器、用具及试剂
4.1仪器
PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、台式冷东离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、电泳仪和凝胶成像系统4.2用具
可调移液器（最大量程为20μL、200μL、1000μL）及相关吸头、研钵、离心管（2mL）、PCR管、量筒、烧杯、酒精灯和镊子等。
4.3试剂
具体试剂见附录B和附录C。
5检测鉴定方法
5.1症状观察
现场对橙树苗木进行症状观察，症状描述参见附录A中A.3，挑取可疑症状植株样品带回实验室SN/T 3711-2013
检测。
5.2样品INA提取
具体步骤死附录 B中 B.3,
5.3通用引物PCR扩增
利用两对通用引物通过巢式 FCR 扩增植原体 16S rTNA,方法见附录 C。5.4PCK产物的克隆与测序分析
将 PCR产物进行克降测序,将所得 DNA 序列输人 GcnBank进行 I31.AST 比对检累,来用生物信息学软件对所得到的DVA序列与 GcnI3ank 中H他相关植原体序列进行比较和分析:并构建系统发育树。
5.5PCR产物的序列虚拟RFLP分析利用iPhyclassifier在线软件（hitp：//plantpnthology.ha.ars.usda.gov/cgi-bin/resource/iphyelassificr.cg)或 DNA-FP Cluster 欲件，分别用限制性内切酶 AluI, BearnHI,Bfu,BsUI, DraI,EcuRI,faelH, HhaI, Hinil.IpaI,HpaH,Kpnl,MhoI,MseI,R.aI,Sspl, Taql x样品 1sS rDNA(Rl6F2n/R16R2)扩增产物序列进行虚拟RFI.P酶切，其图谱与档树黄化植原体标准酶切图谱（见附录D.2)比对分析。
6结果判定
当待检测样品的症状与描述相一致（或样品无显症），其植原体16SrDNA巢式PCR扩增产物具有约1248bp的片段-且序列RFLP图谱分析结果与档树黄化植原体模拟标准图谱--致，可判定该植物样品携带档树黄化植原体。
7样品保存与复核
7.1样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后要善保存，对检出枪树黄化植原体的样品应保存干-20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处埋，7.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时问，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳图。-KAONiKAca
A.1英文名
Alderyellowsphytoplasma
A.2中文名
恺树黄化植原体
为害症状
附录A
（资料性附录）
档树黄化植原体相关资料
SN/T3711—2013
该植原体病害最典型症状为树木叶片稀疏、发黄、变小（见图A.1），严重时死亡。树木的各生长阶段均可感病，但有时无明显症状。图A.1
A.4寄主范围
档树黄化植原体为害症状
主要寄主是木属，包括粘胶档木（ALnusglutinosa）、红橙木（ALnusrubra）等树种。在自然条件下，长春花（Catharanthusroseus）也是档树黄化植原体的寄主。A.5传播途径
档树黄化植原体近距离传播主要由取食植株韧皮部的介体昆虫传播，如树广头叶蝉（Oncopsisalni)等；档木属苗木的移栽调运可以使植原体病原远距离传播。A.6分布
法国、德国、瑞士、奥地利、意大利、塞尔维亚以及波罗的海地区。3
-iiKAoNiKAca
SN/T3711—2013
B.1试剂
附录B
（规范性附录）
植原体DNA提取
十二烷基肌氨酸钠（N-Lauroylsarcosinesodiumsalt，NLS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecyl sulfateEDTA）聚乙烯基吡略烷酮（PVP）、磷酸氢二钾（K,HPO.）、磷酸二氢钾（KH,PO）、牛血清蛋白(BSA）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸（HCI)、氯化钠（NaCI）、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇和乙醇等B.2溶液
研磨液
K,HPO..21.7g:
KHPO.:4.1g
熊糖：100g；
BSA:1.5g:
PVP-10:20g;
加水至1000mL，过滤除菌备用
2DNA抽提液
CTAB:20 g/L;
Tris-HCl:100mmol/L(pH值为8.0FDTA:20mmol/L(pH值为8.0)：
NaCl:1.4 mol/L.
TE缓冲液
Tris:1ommol/L;
EDTA：1mmol/L(pH值为8.0)。
CTAB/NaCI溶液
CTAB:10%;
NaCl:0.7 mol/L.
蛋白酶K
蛋白酶K20mg；
无菌水：1mL；
37℃水浴1h后分装成单次使用的小份，于一20℃备用。4
-TKAONiKAca
样品DNA提取
SN/T3711—2013
取0.1g~0.5g样品组织（韧皮部组织或者叶脉和叶柄）于研钵中，加入适量液氮研磨，1ml.研磨液，4℃条件下10000r/min离心15min；弃上清液，加人500uLDNA提取液、20μL蛋白酶K、80μul10%NLS，55℃水1h~2h，然后4℃6000r/min离心10min；取上清液，400μL异丙醇，-20℃保持30min后，4℃8000r/min离心15min弃上清液，加人600μLTE缓冲液、30μL10%SDS、12qL蛋白酶K，37℃温育30min~60min；加100μL5mol/LNaCl混勾，84μLCTAB/NaCI在65℃水浴10min；加等体积三氯甲烷/异戊醇，8000r/min离心5min，取上清液，再加等体积苯酚/三氯甲烷/异戊醇抽提，8000r/min离心5min：取上清液，川2倍体积无水乙醇于-2c℃沉淀核酸，4℃6000r/min离心10min；奔上清液，加500μL70%乙醇洗涤，4℃6000r/min离心10min，弃上清20℃短期贮存或一80℃长期赔存备用。液，真空干燥DNA，加适量TE悬浮，植原体基因组DNA提取方法也可采用商品试剂盒提取。S
-TrKAoNKAca
SN/T 37112013
C.1 引物序列
引物序列见表C.1
迎引物
引物名称
JR16nF&
RiimRibzxZ.net
R1sF2n
心.2PCR反应体系及参数
C.2.1PCR 反应体系
PCR 反应体系见表 C.2 .
试剂名称
1GXPCR缓冲液
2.5 mmol/1. dNTP
pmol/L L游引物
10 μumal/1.下游引物
5 t:/μl.Tan DNA聚合群
0/ul.模板NA
加效燕水至
附录C
（规范性附录）
通用引物PCR扩增
引物序列
引物序列5*-3°
CAT GCA AGT CGA ACG GA
CTT AAG CCC AAT CAT CGA C
GAA ACG ACT GCT AAG ACT GG
TGA CGG GLG GIG TGT ACA AAC CCC G表 C.2 PCR 反应体系
加样量/l
注：DNA模板的胶典应根据DNA的提取浓度，纯度而调节，C.2.2阴性对照、阳性对照和空白对照的设置C,2.2.1
所性对照：以健康叫片LNA为模板。阳性对照:以携带有树黄化植原体 16S rDNA 序列的质粒或 DVA 为模板。FCR反应的空白对照以无菌蒸馏水代替DNA模板。扩谱产物长度
1432 hp
1248bp
-TTKAOMIKAca
3PCR的反应条件
SN/T3711—2013
用引物R16mF2/R16mR1进行PCR扩增。反成条件为：94℃/5min;94℃/1min,60C/2min，72C/3min，35个循环72C/10min。将PCR扩增产物用火菌双蒸水1：100(体积比）稀释为模板，用通用引物R16F2n/R16R2进行巢氏PCR扩增，反应体系见B.2.1。反应条件为：91℃/5min；94℃/1min，55℃/2min，72℃/3min，35个循环，72℃/10min，
不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整C.3琼脂糖凝胶电泳
制备1%的琼脂糖凝胶.以DNAMarkerDL2C00作为分了量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝胶像仪观察并记录结果。
SN/T3711-2013
附录D
（规范性附录）
16SrDNA序列及RFLP分析
档树黄化植原体16SrDNA序列
通过巢氏PCR扩增并测序，橙树黄化植原体16SrDNA（R16F2n/R16R2)序列如下GAAACGGTTG CTAAGACTGG
TCTTCGGAGGGTATGCTTAA
GCTTACCAAG
GACACGGCCC
CTGACCGAGC
ATTATGATGT
AAACTCCTAC
GACGCCGCGT
ATACGAAACA
AGAGGGGCTTGCGCCACATT
GTAGCTGGAC
TGAGAGGTTG
GGGAGGCAGO
GAACGATGAA
AGAAGAAAAA
ATAGTGGAAA
AACTATCT
TATGTGCCAG
AAAGGGTGCG
CAGCCGCGGT
TAGGCAGTTA
GTTATAGAAA
CTGTCTTGAC
TAAAATGTGT
GACGCTGAGG
GTAAACGATG
CCGCCTGAGT
GCGGTGGATC
CTCTGCAAAG
CGTCAGTTCG
AGTTGCCAGC
1021 GTGGGGATAA
1081 GCTATTACAA
1141 TACGGATTGA
1201 GCATGTCGCG
AAATATATGG
CACGAAAGCG
AGTACTAAGT
AGTAGGGAAT
GTATTTCGGT
ACGTITA
GGGCGAGCGT
GATAAGTCTA
TAGAGTGAGA
AGGAAUACCA
AATTTAATT
SGAAGCGTAGG
ACAGGATTAG
TGGGGAGCAG
GTCGGGGTAA
AGTACGTACG
CAAGTATGAA
ATGTTGTTTA
CTATAGAAAT
TGTCGTGAGA
ACGTAATGGT
CGTCAAATCA
AGAGTAGCT
AGTCTGCAA
GTGAATACGT
ATTCGAAGAT
ATAGTGGAGG
TGTTAGGTTA
ACGCGAGT
TCGACTTCAT
TCTCGGGGTT
OTCAOTG
TTTTGTTTT
AGTTAGTTGG
ACAGCCACA
TTCGGCAAT
ATGTAAAGTT
ATGAATAAGC
TATCCGGAAT
TCAGTGCTTA
GGAATTCCA
GGCTTGCTG
TACCCTGGT
AAGTTAACAC
ATTGACGGGA
ACACGAAAA!
TTATCAGGGA
AGTCCTAAAA
IGATCTGG
TTAGCC
AAGCTGGAA
GTACACACC
树黄化植原体16SrDNA序列RFLP标准酶切图谱CCTTACCAGG
TACAGGTGGT
GAACGCAAC
AATTAAACA
CTACAAACG
CTCAAAAAG
CGCTAGTAA
GCCCGTCA
档树黄花植原体16SrDNA序列（R16F2n/R16R2)RFLP标准酶切图谱见图D.1TAAAAGACCT
TGAGGTAAAG
TTGGGACTGA
GGAGGAAACT
CTTTTATTGA
CCCGGCTAAC
TATTGGGCGT
ACGCTGTCTT
TGTGTAGCGG
GGTCTTTACT
AGTCCACGCT
ATTAAGTACT
CTCCGCACAA
TCTTGACATA
GCATGGTTGT
CCCTGTCGCT
TTGGAGGAAG
TGATACAATG
GTAGTCTCAG
TCGCGAATCA
SN/T37112013
注：通过iPhyclassifier在线分析软件，对树黄花植原体16SrDNA序列（R16F2n/R16R2）进行虚拟限制性内切酶Alul,BamHl,Bfal,BsUl,Dral.EcoRI.HaelI,Hhal,Hinfi,Hpal.Hpall,Kpnl,Mbol,Msel.RsalSspl,Taqi的酶切分析。
图D.1酶切图谱
SN/T 3711-2013
参考文献
二1朱天生，潘一展，崔延涛，等,愉树黄化病植原体的分子检测与鉴定[J.植物病理学报，200838(4):401-406.
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