SN/T 3972-2014
基本信息
标准号： SN/T 3972-2014
中文名称：猪流感病毒病检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3972-2014.Quarantine protocol for swine influenza disease.
1范围
SN/T 3972规定了猪流感的临床诊断、病原学和血清学检疫技术要求。
SN/T 3972适用于对进出境猪流感的诊断、检疫和监测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088出人境动物检疫采样
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
pH1N1 (2009):甲型H,N; (2009)流感病毒
SI:猪流感
SIV :猪流感病毒
4概述
猪流感病毒一年四季均可在猪群中流行,不同品种、年龄的猪均可感染。病猪是重要传染源,康复猪可能成为长期的带毒和排毒者。本病的主要传播途径包括直接接触传播和空气传播。病猪突然发烧,体温在40.5℃~41.5℃之间,有时达42℃。病理变化主要发生在呼吸器官,鼻、喉、气管及大支气管黏膜充血、肿胀并覆有黏稠的液体,小支气管和细支气管充填渗出物,胸腔蓄积多量混有纤维素的浆液,纵膈淋巴结和支气管淋巴结肿大,肺脏的病变多发生在尖叫、心叶、中间叶及隔叶的背部和基底部，呈紫红色，坚实,塌陷,而周围的肺组织则呈苍白色气肿状态,界限分明，肺的间质增宽，并出现炎症变化,心包腔蓄积混有纤维素状的液体，胃肠黏膜呈现卡他性炎;脾脏微肿。
1范围
SN/T 3972规定了猪流感的临床诊断、病原学和血清学检疫技术要求。
SN/T 3972适用于对进出境猪流感的诊断、检疫和监测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088出人境动物检疫采样
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
pH1N1 (2009):甲型H,N; (2009)流感病毒
SI:猪流感
SIV :猪流感病毒
4概述
猪流感病毒一年四季均可在猪群中流行,不同品种、年龄的猪均可感染。病猪是重要传染源,康复猪可能成为长期的带毒和排毒者。本病的主要传播途径包括直接接触传播和空气传播。病猪突然发烧,体温在40.5℃~41.5℃之间,有时达42℃。病理变化主要发生在呼吸器官,鼻、喉、气管及大支气管黏膜充血、肿胀并覆有黏稠的液体,小支气管和细支气管充填渗出物,胸腔蓄积多量混有纤维素的浆液,纵膈淋巴结和支气管淋巴结肿大,肺脏的病变多发生在尖叫、心叶、中间叶及隔叶的背部和基底部，呈紫红色，坚实,塌陷,而周围的肺组织则呈苍白色气肿状态,界限分明，肺的间质增宽，并出现炎症变化,心包腔蓄积混有纤维素状的液体，胃肠黏膜呈现卡他性炎;脾脏微肿。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3972-—2014
猪流感病毒病检疫技术规范
Quarantine protocol for swine influenza disease2014-07-14发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-03-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3972—2014
本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、广东省农业科学院动物卫生研究所。本标准主要起草人：卢体康、孙洁、张彩虹、秦智锋、曾少灵、林庆燕、宋长绪、刘建利、陈茹、陈书琨、陶虹、唐金明、陈兵、胡运发。1
1范围
猪流感病毒病检疫技术规范
本标准规定了猪流感的临床诊断病原学和血清学检疫技术要求本标准适用于对进出境猪流感的诊断、检疫和监测。2规范性引用文件
SN/T3972—2014
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样
缩略语
下列缩略语适用于本文件
pHN（2009）：甲型H,N(2009）流感病毒SI:猪流感
SIV:猪流感病毒
4概述
猪流感病毒一年四季均可在猪群中流行，不同品种、年龄的猪均可感染。病猪是重要传染源，康复猪可能成为长期的带毒和排毒者。本病的主要传播途径包括直接接触传播和空气传播。病猪突然发烧，体温在40.5℃~41.5℃之间，有时达42℃。病理变化主要发生在呼吸器官，鼻、喉、气管及大支气管黏膜充血、肿胀并覆有黏稠的液体，小支气管和细支气管充填渗出物，胸腔蓄积多量混有纤维素的浆液，纵隔淋巴结和支气管淋巴结肿大·肺脏的病变多发生在尖叫、心叶、中间叶及隔叶的背部和基底部，呈紫红色，坚实，塌陷，而周圆的肺组织则呈苍白色气肿状态，界限分明，肺的间质增宽，并出现炎症变化，心包腔蓄积混有纤维素状的液体，胃肠黏膜呈现卡他性炎；脾脏微肿。病原学检测
5.1病毒分离与鉴定
5.1.1材料
器材与设备
棉拭子、剪刀、镊子、注射器、离心管、高速台式冷冻离心机、漩涡振荡器、研钵、匀浆器、微量可调移液器、冰箱、生物安全柜、照蛋器、打孔器、酒精灯、1.0mL一次性灭菌注射器、孵蛋器、细胞培养瓶、吸管、洗耳球或电动助吸器、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、1
SN/T3972—2014
5.1.1.2试剂
符合GB/T6682所规定的级水，胎牛血清.9~11H龄SPF鸡压，犬肾传代细胞，石蜡、5%碘，75%酒精，青霉素、链毒素、双抗存液、DH7.2，0.C1Io1/LPBS、细胞生长液、细胞维持液、细胞消化液等溶液（配制方法见A1）
5.1.2样品的采集与处理
5.1.2.1一般要求
样品的采集，保存及运输应符合GB/T18088的相关要求2鼻腔拭子
将灭菌的棉拭子插人猪鼻腔，轻轻擦拭3～5次并慢慢旋转，然后取出拭子并放人盛有2mL灭菌的0.01mol/LpH7.2PBS（含背霉素100001U/mL链霉素10000#g/mL）管内，加盖、编号。5.1.2.3肺脏组织
采集新鲜的可疑病变肺脏组织约3.0g~4.0g，放置于无菌平皿中，编号。5.1.2.4血清或血浆
用无菌注射器直接吸取至无菌
样品的保存和运输
1.5mL离心管中编号
待检样品在2℃～8℃保存不应超过24h；样品应置于低温、密封的容器内运输5.1.2.6样品制备
℃保存不超过3个月：一80℃以下可长期保存。鼻腔拭子样品于旋涡振荡器上振荡混勾约后于离心机中瞬时离心待用。而清或血浆样品于台式冷冻离心机上3000r/min冷冻离心5min后取清待用，组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0g于研钵中充分研磨.再加10.mLPBS（含青霉素10000TU
/mL.链霉素10000μg/ml）混
匀，或置于组织匀浆器中，加人10mLPBS(含青莓素10000
链霉索10000μg/ml）勾浆，然后/ml
将组织悬液转人无菌1.5mL离心管中3.000tmin4℃离心心管中编号备用
5.1.3病毒分离
5.1.3.1鸡胚分离病毒
min，取上清液转入另一无菌1.5ml.离将911日龄SPF鸡胚用照蛋器照视检查，在气室边缘上2mm~8mm处避开血管作一5.1.3.1.1
标记，
5.1.3.1.2将鸡胚竖放在蛋座上，钝端向上。用5%碘消声蛋壳气室后，用75%的酒精脱碘消毒，用无菌处理的打孔器在标记处钻小孔（勿损伤壳膜）。5.1.3.1.3用1.0ml.注射器吸取0.2mL处理好的样品，针头刺人孔内，经绒毛尿囊膜注人尿囊腔，如图1所示，每个样品接种5个鸡胚5.1.3.1.4接种后.加热熔化石蜡封孔，于35℃～37℃孵化箱内孵育96h，24h后开始观察鸡胚死亡情况，以后每间隔8h观察一次，记录鸡胚死亡情况。2
-TiKAoNiKAca
图1鸡胚接种示意图
SN/T3972—2014
5.1.3.1.5对于24h以后的死胚以及96h仍存活的鸡呼，于4冷却4h~12h后，无菌收取尿囊液。将尿囊液于4℃3000r/min离心15min，取上清液转人另一无菌1.5mL离心管中，编号备用。5.1.3.2细胞分离病毒
在生物安全柜中操作，按常规方法培养细胞单层，待长至60%～80%左右，吸取培养液，用细胞培养液（不含胎牛血清，含有TPCK处理的0.025%的胰酶的基）洗三次，加人适量的处理样品，置于37℃5%CO：培养箱中培养1h~2h.期间每隔30min轻轻摇动一次。感作完毕，弃去感作物，用含有胰酶的培养液洗三次·加人适量的细胞维持液，37“5C期间观察细胞病变(CPE)的形成情况。如出现A
培养箱内继续培养5d~7d.
：细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）.收集细胞增养上清液5.1.3.3结果判定
收获鸡胚液或细胞培养上清液，测定其而凝活性（具体操
若HA反应阳性说明可能有
正黏病毒科的病毒，应采用HA-HI试验进行血凝素亚型的鉴定，者无血凝活性或血凝效价很低，应盲传3～5代，若仍阴性，则认为病毒分离阴性5.2HA试验
5.2.1材料
试剂与溶液
pH7.2，0.01mol/LPBS（配制方法见A.1)，阿氏（Alscvers）液、鸡红细胞悬液（配制方法见A.2），标准猪流感病毒血凝索分型抗原,分型标准阳性血清和标准阴性血清。5.2.1.2器材
96孔V型微量反应板、振荡器、25uL微量加样器。5.2.2操作方法
在微量反应板的1～12孔每孔均加入25μLPBS。5.2.2.2吸取25uL待检液体样品加人第1孔，混匀。5.2.2.3每个微量反应板的最后一排设置为空白对照.最后一排第1孔加人25μIPBS作为空白对照。5.2.2.4从第1孔吸取25μL.液体加人第2孔，混勾后吸取25μL液体加入第3孔，如此对倍稀释至第11孔，吸弃25。
-TTKAONKAca
SN/T3972—2014
5.2.2.5每孔再加25uLPBS
5.2.2.6每孔加入25L1%鸡红细胞悬液（加之前，红细胞悬液要充分摇勾）。5.2.2.7轻轻振荡混勺，在20℃~25℃静置40min后于45°倾斜板上观察结果（也可于4℃静置60min后观察结果）。
5.2.3结果判定
将板放置于45°斜板「.于1Imin内观察板内所有孔底低红细胞有无呈泪珠状流消。当最后一排空白对照孔的红细胞全部应呈现明显的纽扣状沉淀于孔底时，表明试验结果成立。完全血凝（不出现任何流尚）的最高稀释倍数代表1个血凝单位（HAU）。若待检液体样品具有血凝性，说明待检液体样品中可能含有SIV
5.3HI试验
5.3.1按照5.2所述的操作方法对具有血凝性的病毒进行HA检测。5.3.2根据HA试验结果配制4HAU的病毒抗原，以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为4HAU抗原的稀释倍数。为了更精确确定所配制的抗原是否为4HAU，可采用回测的方法确定。
5.3.3在微量反应板的1~11孔加人25μLPBS，第12孔加人50μLPBS5.3.4在每一批检测中，在一个微量反应板中设置阴性对照和空白对照。阴性对照即在第1孔中加25L标准阴性血清.空白对照即在第1孔中加人25uLPBS，5.3.5吸取25μL各个亚型的标准阳性血清依次加入第1列的第1孔内，充分混匀后吸取25L于第2孔内，如此对倍稀释至第10孔，吸弃25μl。5.3.6于1~11孔加入25μl.含4HAU的待检抗原.在20℃~25℃静置30min（也可于4℃静置60min）。5.3.7每孔加人25叫l1%鸡红细胞悬液（加之前，红细胞悬液要充分摇勾），轻轻摄荡混匀.在20℃～25℃静置40min后于45°倾斜板上观察结果（也可于4℃静置60min后观察结果）。5.3.8结果判定：以完全抑制（出现完整的倒1”形）4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有空白对照出现凝集、阴性对照孔血清滴度不大于1/4（或表示为2），阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于1/8（或表示为23），判定HI试验阴性，说明分离的病毒与抗血清的亚型不一致：HI价等于1/16（或表示为2+）为可疑·需重复试验：HI价大于或等于1/32（或表示为2）为阳性，说明分离的病毒与抗血清的亚型致。5.4NI试验（全量法以N1和N2分型血清为例）5.4.1将N1、N2标准阳性血清和阴性血清分别按原液、10倍、100倍稀释，并分别加人标记好的相应试管中
5.4.2将已经确定HA业型的待检测样本稀释至HA价位16HAU，每管均加人0.05mL，混勾，拧上盖后37℃水浴1h。
5.4.3每管加人胎球蛋白溶液（50mg/mL)0.1mL混勾，柠上盖后37℃水浴16h~18h。5.4.4空温冷却后，每管加人0.1mL过碘酸盐混匀，室温静置20min。5.4.5每管加入1mL砷制剂.振荡至棕色消失，乳白色出现。5.4.6每管加人2.5mL硫代巴比要酸试剂，将试管置煮沸的水浴中15min，不出现粉红色的为神经氨酸酶抑制阳性，即待检病毒的神经氨酸酶亚型与加入管中的标准神经氨酸酶分型血清亚型一致。TKAONKAca
5.5猪流感病毒AGID试验
5.5.1器材
研磨器、台式离心机、打孔器、69号针头、平皿、微量加样器、酒精灯等。5.5.2试剂
琼脂板（制备方法见A.2）。标准抗原，标准阳性血清和标准阴性血清。5.5.3操作方法
5.5.3.1抗原制备
SN/T3972—2014
从具有血凝性的鸡胚中取出绒毛尿囊膜，用pH7.2，0.01mol/L.PBS冲洗后，用研磨器磨碎后连续冻融3~4次，1000r/min离心10min后取上清液，按终浓度0.1%的量加人甲醛溶液。置37℃灭活36h后，用禽流感标准阳性血清进行型特异性鉴定。5.5.3.2打孔
在制备的琼脂板上，按图2、图3打孔，孔径约5mm，孔距2mm~5mm。将孔中的琼脂用针头轻轻挑出或吸出，勿伤边缘，以免渗漏。图2样品少时使用
5.5.3.3封底
图3样品多时使用
用酒精灯轻烤平皿或玻璃板底部，封闭孔的底部，以防侧漏。5.5.3.4加样
用微量移液器吸取标准阳性血清加到中间B孔，标准抗原滴入④孔中，按照5.5.3.1制备好的抗原悬液加人其他外周孔，每孔均以加满不溢为度。每加一个样品换一个吸头。5.5.3.5作用
加样完毕后，静置5min～10min，然后将平皿水平倒置或玻璃板水平正置放入湿盒内，于37℃温箱中作用，分别于作用24h，48h及72h后观察并记录结果。5.5.3.6结果判定
5.5.3.6.1在暗背景下，将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，若标准抗原悬液孔与中心标准阳性血清孔之间出现一条清晰致密的白色沉淀线，则试验成立，否则视为无效，需重做，5.5.3.6.2若被检抗原悬液与中心标准阳性血清孔之间出现沉淀线，并与标准抗原悬液的沉淀线未端相吻合，即可判定被检抗原悬液为阳性。5
-TiKAoNiKAca
SN/T3972—2014
5.5.3.6.3若被检抗原悬液与中心标准阳性血清孔之间不出现沉淀线，但标准抗原悬液的沉淀线端弯向抗原悬液孔·则被检抗原悬液判为弱阳性（凡弱阳性者应重复试验，仍为弱阳性者，判为阳性）5.5.3.6.4若被检抗原液与中心标准阳性血清孔之间不出现沉淀线且标准抗原悬液沉淀线直向被检抗原悬液孔或向其外侧偏弯者，则被检抗原悬液判为阴性。5.5.3.6.5若被检抗原悬液与中心标准阳性血清之间的沉淀线与标准抗原悬液和中心标准阳性血清孔之间的沉淀线交叉直仲，则判为非特异性反应，应重复该试验。若仍出现非特异性反应则判为阴性。5.6荧光抗体检测
5.6.1材料
5.6.1.1设备
二氧化碳培养箱、恒温恒混培养箱、荧光显微镜、冰箱5.6.1.2试剂与溶液
SIV标准检测抗原，异硫氰酸荧光素标记的猪流感抗体，蒸馅水：用HCI或NaOH调蒸馏水的pH值至7.4pH7.20.01rnol/LPBS（配制方法见A.1)，内酮（使用前置一20℃冰箱预冷）5.6.2操作方法
组织标本制作
取新鲜的可疑病变肺脏组织·男剪开后面胶体
干·用镀子取洁净盖玻片通过酒精灯火焰后，轻压组织切面，使玻片附着上1～2层组织细胞，室温原干或吹干。同时设感染猪样品的阳性对照和健康猪样品的阴性对照。
5.6.2.2细胞标本制作
取无菌96孔平底细胞培养板，每孔加100uLMDCK细胞悬液，置37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养24h48h，于倒置显微镜下观察，形成单层细胞后，移弃细胞培养液。取待检样品上清液接种单层细胞，50uL/孔，每个样品按种2孔置37
液，按每孔200μL加新鲜细胞维持液，置37℃的二氧化碳培养箱中孵育30min.移齐组织1清的二鼠化碳培养箱中培养24h~48h当10%~25%的细胞出现感染后，弃去培养板中的细胞维持液，每孔加入CmL的PBS洗一次。同时设接种病
毒孔阳性对照和正常细胞阴性对照5.6.2.3固定
待上述标本在室温下自然风干后，用0.1mL预冷内酮固定10min，置超净工作台中风干。5.6.2.4荧光抗体染色
于已固定的标本上加人0.1mL.异硫氰酸荧光素标记的抗SIV的抗体结合物.置湿盒内，于37℃恒温恒湿培养箱内感作30min，
5.6.2.5漂洗
用pH7.2的PBS洗涤3次，每次浸泡5min10min，然后风干。6荧光显微镜检查
在标本上滴加一滴缓冲甘油，在暗空内用紫外荧光最微镜观察结果。6
riKAoNiKAca
5.6.2.7结果判定
SN/T3972-—2014
病毒对照孔的单个或成团细胞的胞浆内出现黄绿色荧光信号，不接毒细胞对照无绿色荧光信号，或病毒感染猪的肺泡组织内出现黄绿色荧光信号，健康猪的肺泡组织内无黄绿色荧光信号，则试验成立，可进行结果判定。
待检样品的单个或成团细胞的胞浆内或者肺泡组织内出现黄绿色荧光信号的，判为阳性待检样品的单个或成团细胞的胞浆内或者肺泡组织内无黄绿色荧光信号的，判为阴性5.7免疫组化检测
5.7.1材料
5.7.1.1设备免费标准下载网bzxz
烘箱、荧光显微镜、恒温恒湿培养箱、冰箱。5.7.1.2试剂与溶液
福尔马林、多聚左旋赖氨酸、二本、无水乙醇、95%的乙醇和75%的乙醇。蒸馏水：用HCI或NaOH调整蒸馏水的pH值至7.4。0.05%的蛋白酶消化液、PH7.2，0.1mol/LPBS、DAB溶液（配制方法见A.3）。抗SIVN蛋白的鼠源单克降抗体，生物素标记的羊抗鼠IgG，链霉菌抗生物索-过氧化物酶三抗。
5.7.2操作方法
标本制作
将福尔马林固定、石蜡包埋的肺脏组织切成4m厚的薄片，置于多聚左旋赖氨酸处理的载玻片上，同时设病毒感染猪样品的阳性对照和健康猪样品的性对照5.7.2.2N
脱蜡和水化
将组织切片在60℃烘箱中烘烤15Iin进行脱蜡，分别在一甲举，无水乙醇，95%的乙醇、75%的乙醇和蒸馏水中浸泡5min。
5.7.2.3消化
用0.05%的蛋白酶消化2min，PBS洗3次，每次5min。5.7.2.4加单抗
每张切片加1滴或0.05mL鼠源抗SIVN蛋白的单克隆抗体，室温孵育1h或4℃过夜，PBS洗3次，每次2min
5加二抗
每张切片加1滴或0.05ml生物素标记的羊抗鼠二抗，室温孵育10min，PBS洗3次，每次2min5.7.2.6
加酶标三抗
每张切片加1滴或0.05mL链霉菌抗生物素至过氧化物酶标记三抗，室温孵育10.min，PBS洗3次，每次2min。
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加底物
每张切片加2滴或0.1mL新鲜配制的DAB溶液，室温孵育5min，蒸馏水洗2次复染、脱水、透明、封片
苏木精复染2min，盐酸酒精分化，蒸馏水洗3次，每次2min，脱水、透明、封片后进行镜检。5.7.2.9镜检
5.7.2.10结果判定
病毒感染猪的支气管上皮细胞和肺泡组织内出现深褐色沉淀，健康猪的支气管上皮细胞和肺泡组织内无棕红色沉淀，则试验成立，可进行结果判定待检样品的支气管上皮细胞和肺泡组织内出现深褐色沉淀，判为阳性。待检样品的支气管上皮细胞利肺泡组织内无深褐色沉淀，判为阴性5.8
SIV核酸检测方法
5.8.1材料
5.8.1.1设备
高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/mim以上），台式离心机（离心速度3000r/mim）、混匀器冰箱（2.℃～8C和一20℃两种）、PCR仪、电泳仪系统、全白动凝胶成像分析系统、荧光PCR检测仪。5.8.1.2试剂
无DNA酶和RNA酶的水、TRIZOL、分析纯三氯甲烷、分析纯异丙醇、75%乙醇。异丙醇和乙醇使用前预冷至一20.℃。一步法RT-PCR试剂盒、一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒。50XTAE缓冲液、I%琼脂糖凝胶板、10X电泳上样缓冲液（配制方法见A.4）MarkDNA5.8.2采样和样品前处理
参见5.1.2
5.8.3常规RT-PCR检测与分型
具体方法见GB/T27521
5.8.4荧光RT-PCR检测与分型
5.8.4.1引物和探针序列
采用以下引物和探针或其他等效引物和探针来进行SIV、H.亚型、H：亚型和新型甲型H,N.流感的检测和分型：
A型流感：
InfAForward:5'-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC3InfAReverse:5'-AGGGCA TTYTGG ACAAAK CGTCTA-3\InfAProbe:5-FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ-3H亚型猪流感：
SWHIForward,5'-GTGCTATAAACACCAGCCTYCCA-3oG
SW H, Reverse:5\-CGG GAT ATTCCT TAA TCC TGT RGC-3*SN/T3972-—2014
SWH Probe:5-FAM-CAGAATATACA\T-BHQ)\CCRRTCACAATTGGARAA-3\H亚型猪流感：
SWH,Forward:5'-AAA TTGAAG TGA CTAATG CTA C-3SWH,Reverse:5'-TGAGGCAACTAGTGACCTAAG-3SWH,Probe:5'-FAM-CAACAGGTAGAATATGCGACAGTCC-BHQ-3\电型HN（2009）：
pHN-2009Forward:5-CAACACCAACTTTGCTGC-3*pH,N,—2009Reverse:5-GGAACCGATTCTTA(C/T)ACTGTTGTC-3*pH N,-2009Probe:5°-FAM-CAGTCAGTGGTTTCCGTGAAATTAGC-BHQ3以上引物浓度均为10pmol/μL，探针浓度为5pmol/μL。5.8.4.2操作方法
5.8.4.2.1病毒RNA提取
见GB/T27521。
5.8.4.2.2实时荧光RT-PCR检测
5.8.4.2.2.1反应体系配制
在PCR溶液配制区，每份检测样品的实时荧光RT-PCR体系（25uL)见表1。表1实时荧光RT-PCR反应体系配制表组分
2XRT-PCR Buffer
EnzymeMix
土游引物（10amol/mL）
上游引物（10μmol/mL）
TaqMan探针(5μmol/mL)
无核酸降解酶的水
总体积
体积/μL
注：不同公司生产的实时荧光onestepRT-PCR试剂盒反应成分不同，体系不同，可根据相应的说明书进行修改。将配制的每个PCR反应试剂充分混勾，瞬时离心后转移至样本处理区。5.8.4.2.2.2加样
在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加入已提取好的核酸5uL，盖上管盖，将PCR管放人荧光PCR检测仪内，记录样本放置顺序。5.8.4.2.2.3PCR扩增检测
第一步：反转录45℃30min；
第二步：热启动95℃10min（不同的生产商家推荐的时间不同，应根据说明书进行）；第三步：95℃15$.60℃45S，40个循环，60℃时设置采集荧光9
SN/T3972-—2014
荧光素设定：ReporlerDye设定为FAM，QuencherDye都设定为BIIQ（或None），应根据母液中是否含有校准荧光染料确定是否选择ReferenceDye。5.8.4.2.3结果判定
综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考.阅值设定原则以阅值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪音情况进行调整，选择FAM通道进行分析。
阳性对照样品有对数扩增曲线，而且Ct值30；阴性对照和空白对照无扩增曲线，而且Ct值40或未检出，二者均成立才可判定试验成立；Cl值≤35.判为阳性，表明猪病毒活达业型病毒核酸阳性
Ct值>40或无扩增曲线，判为阴性样本，表明猪流感病毒病毒核酸阴性；35Ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行实时荧光RT-PCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为阳性。
6血清学检测
6.1血凝抑制试验
6.1.1检测抗原HA
滴度测定参见5.2.
6.1.2HI操作方法
根据6.1.1试验结果配制4HAU的SIV标准检测抗原，以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为6.1.2.1
终点，终点稀释倍数除以4印为4HAU抗原的稀释倍数。4HAU，可采用回测的方法确定
为了更精确确定所配制的抗原是否为6.1.2.2在微量反应板的1~17孔加人25μLPBS第12孔加入0.05mLPBS。
6.1.2.3在每批检测中，在
个微量反应板中设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照即在第1孔中加入25uL标准阳性血清，性对照即在第1孔中加人23uL标准阴性血清，空白对照即在第1孔中加人25μLPBS
6.1.2.4吸取25uL待检血清加入第1孔内，充分混勾后吸取25uL于第2孔内如此对倍稀释至第10孔，吸弃25L。
6.1.2.5于1~11孔加人含4HAU混勾的病毒悬液0.025mL，在20℃~-25℃静置30min（也可于4C静置60min）。
6.1.2.6每孔加人25μI1%鸡红细胞悬液（加之前，红细胞悬液要充分摇勾）。轻轻振荡混勾，在20℃~25℃静置40min后丁45倾斜板上观察结果（也可于4℃静置60min后观察结果）。6.1.3结果判定
以完全抑制（出现完整的倒\“形）4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有空白对照出现集，阴性对照孔而清滴度不天于1/4（或表示为2），阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等丁1/8（或表示为2°），判定HI试验阴性：III价等于1/16（或表示为2）为可疑，需重复试验：111价人于或等于1/32（或表示为2°）为阳性。10
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猪流感病毒病检疫技术规范
Quarantine protocol for swine influenza disease2014-07-14发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-03-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3972—2014
本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、广东省农业科学院动物卫生研究所。本标准主要起草人：卢体康、孙洁、张彩虹、秦智锋、曾少灵、林庆燕、宋长绪、刘建利、陈茹、陈书琨、陶虹、唐金明、陈兵、胡运发。1
1范围
猪流感病毒病检疫技术规范
本标准规定了猪流感的临床诊断病原学和血清学检疫技术要求本标准适用于对进出境猪流感的诊断、检疫和监测。2规范性引用文件
SN/T3972—2014
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样
缩略语
下列缩略语适用于本文件
pHN（2009）：甲型H,N(2009）流感病毒SI:猪流感
SIV:猪流感病毒
4概述
猪流感病毒一年四季均可在猪群中流行，不同品种、年龄的猪均可感染。病猪是重要传染源，康复猪可能成为长期的带毒和排毒者。本病的主要传播途径包括直接接触传播和空气传播。病猪突然发烧，体温在40.5℃~41.5℃之间，有时达42℃。病理变化主要发生在呼吸器官，鼻、喉、气管及大支气管黏膜充血、肿胀并覆有黏稠的液体，小支气管和细支气管充填渗出物，胸腔蓄积多量混有纤维素的浆液，纵隔淋巴结和支气管淋巴结肿大·肺脏的病变多发生在尖叫、心叶、中间叶及隔叶的背部和基底部，呈紫红色，坚实，塌陷，而周圆的肺组织则呈苍白色气肿状态，界限分明，肺的间质增宽，并出现炎症变化，心包腔蓄积混有纤维素状的液体，胃肠黏膜呈现卡他性炎；脾脏微肿。病原学检测
5.1病毒分离与鉴定
5.1.1材料
器材与设备
棉拭子、剪刀、镊子、注射器、离心管、高速台式冷冻离心机、漩涡振荡器、研钵、匀浆器、微量可调移液器、冰箱、生物安全柜、照蛋器、打孔器、酒精灯、1.0mL一次性灭菌注射器、孵蛋器、细胞培养瓶、吸管、洗耳球或电动助吸器、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、1
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5.1.1.2试剂
符合GB/T6682所规定的级水，胎牛血清.9~11H龄SPF鸡压，犬肾传代细胞，石蜡、5%碘，75%酒精，青霉素、链毒素、双抗存液、DH7.2，0.C1Io1/LPBS、细胞生长液、细胞维持液、细胞消化液等溶液（配制方法见A1）
5.1.2样品的采集与处理
5.1.2.1一般要求
样品的采集，保存及运输应符合GB/T18088的相关要求2鼻腔拭子
将灭菌的棉拭子插人猪鼻腔，轻轻擦拭3～5次并慢慢旋转，然后取出拭子并放人盛有2mL灭菌的0.01mol/LpH7.2PBS（含背霉素100001U/mL链霉素10000#g/mL）管内，加盖、编号。5.1.2.3肺脏组织
采集新鲜的可疑病变肺脏组织约3.0g~4.0g，放置于无菌平皿中，编号。5.1.2.4血清或血浆
用无菌注射器直接吸取至无菌
样品的保存和运输
1.5mL离心管中编号
待检样品在2℃～8℃保存不应超过24h；样品应置于低温、密封的容器内运输5.1.2.6样品制备
℃保存不超过3个月：一80℃以下可长期保存。鼻腔拭子样品于旋涡振荡器上振荡混勾约后于离心机中瞬时离心待用。而清或血浆样品于台式冷冻离心机上3000r/min冷冻离心5min后取清待用，组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0g于研钵中充分研磨.再加10.mLPBS（含青霉素10000TU
/mL.链霉素10000μg/ml）混
匀，或置于组织匀浆器中，加人10mLPBS(含青莓素10000
链霉索10000μg/ml）勾浆，然后/ml
将组织悬液转人无菌1.5mL离心管中3.000tmin4℃离心心管中编号备用
5.1.3病毒分离
5.1.3.1鸡胚分离病毒
min，取上清液转入另一无菌1.5ml.离将911日龄SPF鸡胚用照蛋器照视检查，在气室边缘上2mm~8mm处避开血管作一5.1.3.1.1
标记，
5.1.3.1.2将鸡胚竖放在蛋座上，钝端向上。用5%碘消声蛋壳气室后，用75%的酒精脱碘消毒，用无菌处理的打孔器在标记处钻小孔（勿损伤壳膜）。5.1.3.1.3用1.0ml.注射器吸取0.2mL处理好的样品，针头刺人孔内，经绒毛尿囊膜注人尿囊腔，如图1所示，每个样品接种5个鸡胚5.1.3.1.4接种后.加热熔化石蜡封孔，于35℃～37℃孵化箱内孵育96h，24h后开始观察鸡胚死亡情况，以后每间隔8h观察一次，记录鸡胚死亡情况。2
-TiKAoNiKAca
图1鸡胚接种示意图
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5.1.3.1.5对于24h以后的死胚以及96h仍存活的鸡呼，于4冷却4h~12h后，无菌收取尿囊液。将尿囊液于4℃3000r/min离心15min，取上清液转人另一无菌1.5mL离心管中，编号备用。5.1.3.2细胞分离病毒
在生物安全柜中操作，按常规方法培养细胞单层，待长至60%～80%左右，吸取培养液，用细胞培养液（不含胎牛血清，含有TPCK处理的0.025%的胰酶的基）洗三次，加人适量的处理样品，置于37℃5%CO：培养箱中培养1h~2h.期间每隔30min轻轻摇动一次。感作完毕，弃去感作物，用含有胰酶的培养液洗三次·加人适量的细胞维持液，37“5C期间观察细胞病变(CPE)的形成情况。如出现A
培养箱内继续培养5d~7d.
：细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）.收集细胞增养上清液5.1.3.3结果判定
收获鸡胚液或细胞培养上清液，测定其而凝活性（具体操
若HA反应阳性说明可能有
正黏病毒科的病毒，应采用HA-HI试验进行血凝素亚型的鉴定，者无血凝活性或血凝效价很低，应盲传3～5代，若仍阴性，则认为病毒分离阴性5.2HA试验
5.2.1材料
试剂与溶液
pH7.2，0.01mol/LPBS（配制方法见A.1)，阿氏（Alscvers）液、鸡红细胞悬液（配制方法见A.2），标准猪流感病毒血凝索分型抗原,分型标准阳性血清和标准阴性血清。5.2.1.2器材
96孔V型微量反应板、振荡器、25uL微量加样器。5.2.2操作方法
在微量反应板的1～12孔每孔均加入25μLPBS。5.2.2.2吸取25uL待检液体样品加人第1孔，混匀。5.2.2.3每个微量反应板的最后一排设置为空白对照.最后一排第1孔加人25μIPBS作为空白对照。5.2.2.4从第1孔吸取25μL.液体加人第2孔，混勾后吸取25μL液体加入第3孔，如此对倍稀释至第11孔，吸弃25。
-TTKAONKAca
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5.2.2.5每孔再加25uLPBS
5.2.2.6每孔加入25L1%鸡红细胞悬液（加之前，红细胞悬液要充分摇勾）。5.2.2.7轻轻振荡混勺，在20℃~25℃静置40min后于45°倾斜板上观察结果（也可于4℃静置60min后观察结果）。
5.2.3结果判定
将板放置于45°斜板「.于1Imin内观察板内所有孔底低红细胞有无呈泪珠状流消。当最后一排空白对照孔的红细胞全部应呈现明显的纽扣状沉淀于孔底时，表明试验结果成立。完全血凝（不出现任何流尚）的最高稀释倍数代表1个血凝单位（HAU）。若待检液体样品具有血凝性，说明待检液体样品中可能含有SIV
5.3HI试验
5.3.1按照5.2所述的操作方法对具有血凝性的病毒进行HA检测。5.3.2根据HA试验结果配制4HAU的病毒抗原，以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为4HAU抗原的稀释倍数。为了更精确确定所配制的抗原是否为4HAU，可采用回测的方法确定。
5.3.3在微量反应板的1~11孔加人25μLPBS，第12孔加人50μLPBS5.3.4在每一批检测中，在一个微量反应板中设置阴性对照和空白对照。阴性对照即在第1孔中加25L标准阴性血清.空白对照即在第1孔中加人25uLPBS，5.3.5吸取25μL各个亚型的标准阳性血清依次加入第1列的第1孔内，充分混匀后吸取25L于第2孔内，如此对倍稀释至第10孔，吸弃25μl。5.3.6于1~11孔加入25μl.含4HAU的待检抗原.在20℃~25℃静置30min（也可于4℃静置60min）。5.3.7每孔加人25叫l1%鸡红细胞悬液（加之前，红细胞悬液要充分摇勾），轻轻摄荡混匀.在20℃～25℃静置40min后于45°倾斜板上观察结果（也可于4℃静置60min后观察结果）。5.3.8结果判定：以完全抑制（出现完整的倒1”形）4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有空白对照出现凝集、阴性对照孔血清滴度不大于1/4（或表示为2），阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于1/8（或表示为23），判定HI试验阴性，说明分离的病毒与抗血清的亚型不一致：HI价等于1/16（或表示为2+）为可疑·需重复试验：HI价大于或等于1/32（或表示为2）为阳性，说明分离的病毒与抗血清的亚型致。5.4NI试验（全量法以N1和N2分型血清为例）5.4.1将N1、N2标准阳性血清和阴性血清分别按原液、10倍、100倍稀释，并分别加人标记好的相应试管中
5.4.2将已经确定HA业型的待检测样本稀释至HA价位16HAU，每管均加人0.05mL，混勾，拧上盖后37℃水浴1h。
5.4.3每管加人胎球蛋白溶液（50mg/mL)0.1mL混勾，柠上盖后37℃水浴16h~18h。5.4.4空温冷却后，每管加人0.1mL过碘酸盐混匀，室温静置20min。5.4.5每管加入1mL砷制剂.振荡至棕色消失，乳白色出现。5.4.6每管加人2.5mL硫代巴比要酸试剂，将试管置煮沸的水浴中15min，不出现粉红色的为神经氨酸酶抑制阳性，即待检病毒的神经氨酸酶亚型与加入管中的标准神经氨酸酶分型血清亚型一致。TKAONKAca
5.5猪流感病毒AGID试验
5.5.1器材
研磨器、台式离心机、打孔器、69号针头、平皿、微量加样器、酒精灯等。5.5.2试剂
琼脂板（制备方法见A.2）。标准抗原，标准阳性血清和标准阴性血清。5.5.3操作方法
5.5.3.1抗原制备
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从具有血凝性的鸡胚中取出绒毛尿囊膜，用pH7.2，0.01mol/L.PBS冲洗后，用研磨器磨碎后连续冻融3~4次，1000r/min离心10min后取上清液，按终浓度0.1%的量加人甲醛溶液。置37℃灭活36h后，用禽流感标准阳性血清进行型特异性鉴定。5.5.3.2打孔
在制备的琼脂板上，按图2、图3打孔，孔径约5mm，孔距2mm~5mm。将孔中的琼脂用针头轻轻挑出或吸出，勿伤边缘，以免渗漏。图2样品少时使用
5.5.3.3封底
图3样品多时使用
用酒精灯轻烤平皿或玻璃板底部，封闭孔的底部，以防侧漏。5.5.3.4加样
用微量移液器吸取标准阳性血清加到中间B孔，标准抗原滴入④孔中，按照5.5.3.1制备好的抗原悬液加人其他外周孔，每孔均以加满不溢为度。每加一个样品换一个吸头。5.5.3.5作用
加样完毕后，静置5min～10min，然后将平皿水平倒置或玻璃板水平正置放入湿盒内，于37℃温箱中作用，分别于作用24h，48h及72h后观察并记录结果。5.5.3.6结果判定
5.5.3.6.1在暗背景下，将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，若标准抗原悬液孔与中心标准阳性血清孔之间出现一条清晰致密的白色沉淀线，则试验成立，否则视为无效，需重做，5.5.3.6.2若被检抗原悬液与中心标准阳性血清孔之间出现沉淀线，并与标准抗原悬液的沉淀线未端相吻合，即可判定被检抗原悬液为阳性。5
-TiKAoNiKAca
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5.5.3.6.3若被检抗原悬液与中心标准阳性血清孔之间不出现沉淀线，但标准抗原悬液的沉淀线端弯向抗原悬液孔·则被检抗原悬液判为弱阳性（凡弱阳性者应重复试验，仍为弱阳性者，判为阳性）5.5.3.6.4若被检抗原液与中心标准阳性血清孔之间不出现沉淀线且标准抗原悬液沉淀线直向被检抗原悬液孔或向其外侧偏弯者，则被检抗原悬液判为阴性。5.5.3.6.5若被检抗原悬液与中心标准阳性血清之间的沉淀线与标准抗原悬液和中心标准阳性血清孔之间的沉淀线交叉直仲，则判为非特异性反应，应重复该试验。若仍出现非特异性反应则判为阴性。5.6荧光抗体检测
5.6.1材料
5.6.1.1设备
二氧化碳培养箱、恒温恒混培养箱、荧光显微镜、冰箱5.6.1.2试剂与溶液
SIV标准检测抗原，异硫氰酸荧光素标记的猪流感抗体，蒸馅水：用HCI或NaOH调蒸馏水的pH值至7.4pH7.20.01rnol/LPBS（配制方法见A.1)，内酮（使用前置一20℃冰箱预冷）5.6.2操作方法
组织标本制作
取新鲜的可疑病变肺脏组织·男剪开后面胶体
干·用镀子取洁净盖玻片通过酒精灯火焰后，轻压组织切面，使玻片附着上1～2层组织细胞，室温原干或吹干。同时设感染猪样品的阳性对照和健康猪样品的阴性对照。
5.6.2.2细胞标本制作
取无菌96孔平底细胞培养板，每孔加100uLMDCK细胞悬液，置37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养24h48h，于倒置显微镜下观察，形成单层细胞后，移弃细胞培养液。取待检样品上清液接种单层细胞，50uL/孔，每个样品按种2孔置37
液，按每孔200μL加新鲜细胞维持液，置37℃的二氧化碳培养箱中孵育30min.移齐组织1清的二鼠化碳培养箱中培养24h~48h当10%~25%的细胞出现感染后，弃去培养板中的细胞维持液，每孔加入CmL的PBS洗一次。同时设接种病
毒孔阳性对照和正常细胞阴性对照5.6.2.3固定
待上述标本在室温下自然风干后，用0.1mL预冷内酮固定10min，置超净工作台中风干。5.6.2.4荧光抗体染色
于已固定的标本上加人0.1mL.异硫氰酸荧光素标记的抗SIV的抗体结合物.置湿盒内，于37℃恒温恒湿培养箱内感作30min，
5.6.2.5漂洗
用pH7.2的PBS洗涤3次，每次浸泡5min10min，然后风干。6荧光显微镜检查
在标本上滴加一滴缓冲甘油，在暗空内用紫外荧光最微镜观察结果。6
riKAoNiKAca
5.6.2.7结果判定
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病毒对照孔的单个或成团细胞的胞浆内出现黄绿色荧光信号，不接毒细胞对照无绿色荧光信号，或病毒感染猪的肺泡组织内出现黄绿色荧光信号，健康猪的肺泡组织内无黄绿色荧光信号，则试验成立，可进行结果判定。
待检样品的单个或成团细胞的胞浆内或者肺泡组织内出现黄绿色荧光信号的，判为阳性待检样品的单个或成团细胞的胞浆内或者肺泡组织内无黄绿色荧光信号的，判为阴性5.7免疫组化检测
5.7.1材料
5.7.1.1设备免费标准下载网bzxz
烘箱、荧光显微镜、恒温恒湿培养箱、冰箱。5.7.1.2试剂与溶液
福尔马林、多聚左旋赖氨酸、二本、无水乙醇、95%的乙醇和75%的乙醇。蒸馏水：用HCI或NaOH调整蒸馏水的pH值至7.4。0.05%的蛋白酶消化液、PH7.2，0.1mol/LPBS、DAB溶液（配制方法见A.3）。抗SIVN蛋白的鼠源单克降抗体，生物素标记的羊抗鼠IgG，链霉菌抗生物索-过氧化物酶三抗。
5.7.2操作方法
标本制作
将福尔马林固定、石蜡包埋的肺脏组织切成4m厚的薄片，置于多聚左旋赖氨酸处理的载玻片上，同时设病毒感染猪样品的阳性对照和健康猪样品的性对照5.7.2.2N
脱蜡和水化
将组织切片在60℃烘箱中烘烤15Iin进行脱蜡，分别在一甲举，无水乙醇，95%的乙醇、75%的乙醇和蒸馏水中浸泡5min。
5.7.2.3消化
用0.05%的蛋白酶消化2min，PBS洗3次，每次5min。5.7.2.4加单抗
每张切片加1滴或0.05mL鼠源抗SIVN蛋白的单克隆抗体，室温孵育1h或4℃过夜，PBS洗3次，每次2min
5加二抗
每张切片加1滴或0.05ml生物素标记的羊抗鼠二抗，室温孵育10min，PBS洗3次，每次2min5.7.2.6
加酶标三抗
每张切片加1滴或0.05mL链霉菌抗生物素至过氧化物酶标记三抗，室温孵育10.min，PBS洗3次，每次2min。
SN/T3972—2014
加底物
每张切片加2滴或0.1mL新鲜配制的DAB溶液，室温孵育5min，蒸馏水洗2次复染、脱水、透明、封片
苏木精复染2min，盐酸酒精分化，蒸馏水洗3次，每次2min，脱水、透明、封片后进行镜检。5.7.2.9镜检
5.7.2.10结果判定
病毒感染猪的支气管上皮细胞和肺泡组织内出现深褐色沉淀，健康猪的支气管上皮细胞和肺泡组织内无棕红色沉淀，则试验成立，可进行结果判定待检样品的支气管上皮细胞和肺泡组织内出现深褐色沉淀，判为阳性。待检样品的支气管上皮细胞利肺泡组织内无深褐色沉淀，判为阴性5.8
SIV核酸检测方法
5.8.1材料
5.8.1.1设备
高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/mim以上），台式离心机（离心速度3000r/mim）、混匀器冰箱（2.℃～8C和一20℃两种）、PCR仪、电泳仪系统、全白动凝胶成像分析系统、荧光PCR检测仪。5.8.1.2试剂
无DNA酶和RNA酶的水、TRIZOL、分析纯三氯甲烷、分析纯异丙醇、75%乙醇。异丙醇和乙醇使用前预冷至一20.℃。一步法RT-PCR试剂盒、一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒。50XTAE缓冲液、I%琼脂糖凝胶板、10X电泳上样缓冲液（配制方法见A.4）MarkDNA5.8.2采样和样品前处理
参见5.1.2
5.8.3常规RT-PCR检测与分型
具体方法见GB/T27521
5.8.4荧光RT-PCR检测与分型
5.8.4.1引物和探针序列
采用以下引物和探针或其他等效引物和探针来进行SIV、H.亚型、H：亚型和新型甲型H,N.流感的检测和分型：
A型流感：
InfAForward:5'-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC3InfAReverse:5'-AGGGCA TTYTGG ACAAAK CGTCTA-3\InfAProbe:5-FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ-3H亚型猪流感：
SWHIForward,5'-GTGCTATAAACACCAGCCTYCCA-3oG
SW H, Reverse:5\-CGG GAT ATTCCT TAA TCC TGT RGC-3*SN/T3972-—2014
SWH Probe:5-FAM-CAGAATATACA\T-BHQ)\CCRRTCACAATTGGARAA-3\H亚型猪流感：
SWH,Forward:5'-AAA TTGAAG TGA CTAATG CTA C-3SWH,Reverse:5'-TGAGGCAACTAGTGACCTAAG-3SWH,Probe:5'-FAM-CAACAGGTAGAATATGCGACAGTCC-BHQ-3\电型HN（2009）：
pHN-2009Forward:5-CAACACCAACTTTGCTGC-3*pH,N,—2009Reverse:5-GGAACCGATTCTTA(C/T)ACTGTTGTC-3*pH N,-2009Probe:5°-FAM-CAGTCAGTGGTTTCCGTGAAATTAGC-BHQ3以上引物浓度均为10pmol/μL，探针浓度为5pmol/μL。5.8.4.2操作方法
5.8.4.2.1病毒RNA提取
见GB/T27521。
5.8.4.2.2实时荧光RT-PCR检测
5.8.4.2.2.1反应体系配制
在PCR溶液配制区，每份检测样品的实时荧光RT-PCR体系（25uL)见表1。表1实时荧光RT-PCR反应体系配制表组分
2XRT-PCR Buffer
EnzymeMix
土游引物（10amol/mL）
上游引物（10μmol/mL）
TaqMan探针(5μmol/mL)
无核酸降解酶的水
总体积
体积/μL
注：不同公司生产的实时荧光onestepRT-PCR试剂盒反应成分不同，体系不同，可根据相应的说明书进行修改。将配制的每个PCR反应试剂充分混勾，瞬时离心后转移至样本处理区。5.8.4.2.2.2加样
在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加入已提取好的核酸5uL，盖上管盖，将PCR管放人荧光PCR检测仪内，记录样本放置顺序。5.8.4.2.2.3PCR扩增检测
第一步：反转录45℃30min；
第二步：热启动95℃10min（不同的生产商家推荐的时间不同，应根据说明书进行）；第三步：95℃15$.60℃45S，40个循环，60℃时设置采集荧光9
SN/T3972-—2014
荧光素设定：ReporlerDye设定为FAM，QuencherDye都设定为BIIQ（或None），应根据母液中是否含有校准荧光染料确定是否选择ReferenceDye。5.8.4.2.3结果判定
综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考.阅值设定原则以阅值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪音情况进行调整，选择FAM通道进行分析。
阳性对照样品有对数扩增曲线，而且Ct值30；阴性对照和空白对照无扩增曲线，而且Ct值40或未检出，二者均成立才可判定试验成立；Cl值≤35.判为阳性，表明猪病毒活达业型病毒核酸阳性
Ct值>40或无扩增曲线，判为阴性样本，表明猪流感病毒病毒核酸阴性；35Ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行实时荧光RT-PCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为阳性。
6血清学检测
6.1血凝抑制试验
6.1.1检测抗原HA
滴度测定参见5.2.
6.1.2HI操作方法
根据6.1.1试验结果配制4HAU的SIV标准检测抗原，以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为6.1.2.1
终点，终点稀释倍数除以4印为4HAU抗原的稀释倍数。4HAU，可采用回测的方法确定
为了更精确确定所配制的抗原是否为6.1.2.2在微量反应板的1~17孔加人25μLPBS第12孔加入0.05mLPBS。
6.1.2.3在每批检测中，在
个微量反应板中设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照即在第1孔中加入25uL标准阳性血清，性对照即在第1孔中加人23uL标准阴性血清，空白对照即在第1孔中加人25μLPBS
6.1.2.4吸取25uL待检血清加入第1孔内，充分混勾后吸取25uL于第2孔内如此对倍稀释至第10孔，吸弃25L。
6.1.2.5于1~11孔加人含4HAU混勾的病毒悬液0.025mL，在20℃~-25℃静置30min（也可于4C静置60min）。
6.1.2.6每孔加人25μI1%鸡红细胞悬液（加之前，红细胞悬液要充分摇勾）。轻轻振荡混勾，在20℃~25℃静置40min后丁45倾斜板上观察结果（也可于4℃静置60min后观察结果）。6.1.3结果判定
以完全抑制（出现完整的倒\“形）4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有空白对照出现集，阴性对照孔而清滴度不天于1/4（或表示为2），阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等丁1/8（或表示为2°），判定HI试验阴性：III价等于1/16（或表示为2）为可疑，需重复试验：111价人于或等于1/32（或表示为2°）为阳性。10
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