SN/T 3464-2012.Quarantine protocol for duck viral hepatitis serotype I.
1范围
SN/T 3464规定了鸭病毒性肝炎I型检疫技术规范，包括病毒分离与鉴定、PCR及荧光PCR方法、血清中和试验等诊断技术。
SN/T 3464适用于进出境鸭病毒性肝炎I型的检疫、疫情监测和流行病学调查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DVH:鸭病毒性肝炎
DHV I :鸭病毒性肝炎I型病毒
DEL:鸭胚肝细胞
DEK:鸭胚肾细胞
4临床诊断
4.1发病症状
鸭病毒性肝炎I型(duck viral hepatitis Serotype I ,DVH I )是由鸭病毒性肝炎病毒I型(DHVI)引起的雏鸭的一种急性高度致死性传染病，主要侵害4周龄以内的雏鸭,特别是不足1周龄的雏鸭最易感染,死亡率可达90%以上。感染初期病鸭精神萎靡、缩颈、翅下垂、呆滞、共济失调;食欲减退,厌食;半天至-天后，身体失去平衡歪向一侧，发生全身性抽搐,两腿痉挛式划动。死时头向后仰，呈脚弓反张姿势。最急性病鸭,常未见任何异常,而突然抽搐痉挛死亡。病程短,可在1 d~2 d内死亡。一个.鸭群感染3d~4 d后可以全部死亡,但大多数在第二天死亡。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3464—2012
鸭病毒性肝炎I型检疫技术规范
Quarantine protocol for cuck viral hepatitis serotype I2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
SN/T3464--2012
本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起节。本标准修改来用了（0IE陆生动物诊断试验和疫苗手册2010版2.3.8.B中的诊断技术部分内，涵盖了病毒分离与鉴定、PCR方法及中和试验.增加了荧光PCR方法，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国惠州出人境检验检疫局、吉林农业大学。本标准半要起草人：王伟利、宋战昀、姜焱、李影、孟庆峰、肖成感、周宁、孟日增、刘阳、刘和平、吴连鹏、石建乎王振国。
1范围
鸭病毒性肝炎I型检疫技术规范
SN/T3464—2012
本标准规定了鸭病毒性肝炎I型检疫技术规范，包括病毒分离与鉴定、PCR及荧光PCR方法、血清中和试验等诊断技术
本标准适用于进出境鸭病毒性肝炎I型的检疫、疫情监测和流行病学调查。2
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DVH：鸭病毒性肝炎
DHVI：鸭病毒性肝炎I型病毒
DEL：鸭胚肝细胞
DEK：鸭胚肾细胞
FCS：胎牛血清
4临床诊断
4. 1 发病症状
鸭病毒性肝炎I型（duckviralhapatitisSerotypeALDVH
是由鸡病毒性肝炎病毒I型(DHV
1)引起的维鸭的一种急性高度致死性传染病.主要侵害4周龄以内的维鸭，特别是不足1周龄的维鸭最易感染，死亡率可达90%以上。感染初期病鸭精神娄靡、缩颈、翅下垂、呆滞、共济失调：食欲减退，厌食：半天至一天后，身体失去平衡歪向一侧，发生全身性抽，两腿痉挛式划动。死时头向后仰，呈脚弓反张姿势。最急性病鸭，常未见任何异常，而突然抽痉挛死亡。病程短，可在1d～2d内死亡。一个鸭群感染3d4d后可以全部死亡，但大多数在第二天死亡。4.2病理变化
剖检可见病变主要发生在肝脏，肝脏肿大、有点状或斑状出血，也有可能伴有明显的脾脏肿大、肾肿胀和肾血管充血。肝脏显微病变的特点是肝细胞广泛坏死和胆管增生，不同程度的细胞炎性反应和出血。
4.3流行病学
该病一年四季均可发生。病鸭及隐性带毒成鸭是主要的传染源。在自然界条件下，本病只发生于1
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锥鸭，鹅亦功感染。主要是1周龄内的雏鸣病，战鸭望隐性感染，自前，发病伴龄有增大趋势：该病多与沙门氏菌、大肠杯菌、曲霹菌、鸭疫里狱氏杆菌、鸭霍乱等混合或继发感染。本病通过消化道和呼吸道感裂，垂直传播。母源抗体的高低是本病发生的主要因素，饲养管理不良，缺乏维生素和矿物质，鸭含潮湿、谢挤，均可促使本病的发牛。康复鸭仍然可从粪使中排毒，粪便对环境污染，在鸭病毒性肝炎的传播起重推用
近年来临床在较大龄鸭群或记作免疫接种的鸭飛发生本病时，病例常缺乏典型的病理变化：仪见肝脏稍肿大、瘀血，表面有末梢毛细血管扩张被裂而无严重的斑点状出血，易造成误诊、漏诊。必须经过病源分离鉴定确诊。
5病毒分离与鉴定
5.1仪器，材料与试剂
5.1.1仪器
生物安全护、速冷炼离心机、研、孵化箱组织勾浆器。5.1.2材料
移液器（200μl~1C00L，20lL~200RL）及吸头，吸管（5ml.，10ml.），5ml离心管一次性注射器（1mL,5ml.)、细胞培养瓶、微孔滤膜（0,22pm）手术班刀和手术镊了。5.1.3试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，试验用水应符合G3/T6682分析实验室用水规格。生弹盐水、肯霉素、链雷素、ILank's平衡盐溶液、Hank无钙镁平衡盐溶液、抗菌素溶液、胰酶消化液、细胞培养液、维持液，原维持液、稀释液、细跑生长液（见A，1～A.10）、新生犊牛血清。5.2实验动物
1~71龄健康锥鸭.10~-14H龄健康鸭胚或8~-10日龄SPF鸡胚、DEL细胞（见B.1)。5.3病料采集与处理
无菌采集的病鸭肝脏用次菌生理盐水制成20%的匀浆.3000r/min离心30min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，加人抗菌素至终浓度为青箱素2000IU/ml.，链得素2000μg/mL，作为待检梓品备：
5.4病毒分离试验
5.4.1动物接种试验
取对DIHVI型易感的1～7日龄维鸭5只，皮下或肌肉接种.1:述滤液，0.2ml./只，另设雏鸭接种生现龄水对照组。接种后分开饲养，随时观察。如果出现特征性的临床症状，并于接毒后18h--48h出现死亡，通带在24h内死亡。检可见IVI型感染的病变并能从肝脏中重新分离出病毒。5.4.2鸭(鸡)胚接种试验
将上清液进行系列稀释后，旬个稀释度接种于6枚10.~14日龄鸭胚或6枚8-~1日龄鸡胚的尿囊腔内，0.2mL/枚，另设鸭胚或鸡胚接种生理盐水对照组，鹅胚于24h~-72万后蛇亡，鸡胚接种后5d~&发生死亡。胚胎的眼规病变为发育阻滞，全身皮下出血，伴有腹部和后肢部的严重水肿。胚肝呈红2
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黄色肿胀并有坏死灶。死亡时间较长的胚胎中，尿囊液明显变绿，肝脏病变和发育阻滞会更明显。5.4.3细胞培养分离试验
取14d~17的鸭胚按常规方法制作原代DEL细胞，于5%COz培养箱内培养2d长成单层，弃去营养液.用维持液清洗2次，接种待检样品，0.1mL/10ml.37℃感作1h，待维持液清洗1次后，加入适量维持液，放入5为CO，培养箱内培养，每天镜检，观察CPE情况。同时设维持液对照瓶。如果含有DHVI型病毒则能引起CPF，且CPE特征为细胞变圆坏死。如果覆盖·-层含1%琼脂糖的维持液时,CPE能形成直径为1mm的蚀斑
5.5病毒鉴定
病毒分离物选用电镜观察、中和试验、PCR及荧光FCR等方法进行鉴定.通常用以上一种或多种方法鉴定DHV型。
6反转录聚合酶链式反应（KT-PCR）6.1仪器、材料与试剂
6.1.1仪器
PCR扩增仪、低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析系统、组织匀浆器。6.1.2材料
可调微量移器(200 μL~1 000 μL,20 μL~200 μl,2 μL~-20 μI., 0. 5 μl -~10 μL)、1. 5 ml0.2mI.离心管和吸头（用DEPC水处理后高压灭菌备用，处理方法见附录A.11)。6.1.3试剂
Trizol、三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇、DEPC水、反转录酶、dNTPs（每种浓度均为10mmol/L）、5XRT缓冲液、RNA抑制剂RNasin(40U/μl)RNascA(20μ/mL)TagDNA聚台酶（5U/μL）、琼脂糖（电泳级）、DNAMarkerDL2000、50XTris-冰乙酸（TAE）电泳缓冲液、溴化Z锭溶液（10mg/ml）、1%琼脂糖凝胶(见A,12~-A.15)。6.2阳性对照
由指定单位提供或将DHVT标准毒株通过鸭胚传代培养或细胞培养，其培养物经过淡活制备而成。
6. 3阴性对照
由指定单位提供或将健康的鸭压尿囊液，冻融2～3次，50001/min离心10min.取上清液备用。6.4引物
根据GenBank中DHV［的保守基网序列，设计合成·对特异性引物：上游物5-ACAATGACCCAGCCTTAG3，下游引物5-CCACTGTATCTTCCCTIC3，便用前用DEPC水溶解成25pmol/μL，一20℃保存备用。6.5RNA的提取
取含DHV1毒的鸭胚尿粪液或细胞培养液经&000r/min离心10min底取上清备用：取病变肝3
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组织0.5g，按1：10体积比用生理盐水研磨，冻融3次，4℃，8000r/min离心15min，取上清液备用。参照Trizol法提取，按照试剂说明书进行。取上述样品200L，加700l的Trizol溶液充分振荡，加200L三氯甲烷，4℃，12000r/min离心15min取上清液至少500μL，加异丙醇500μL充分混勾.4C，12000r/min离心15min弃上清，沉淀用75%的乙醇洗涤，4℃，12000r/min离心10min：加11μLDEPC水溶解沉淀，一20C保存备用。或按照市售的RNA抽提试剂盒操作说明提取病毒RNA。
6.6PCR检测
6.6.1RT反应
RT反应采用20L体系见表
RT反应体系
10.mmol/LdNTPs
5XRT缓冲液
25pmcl/μL下游引
(40U/μL)RNasinRNA
逆转录酶
DHV-I RNA
反应参数设置：
第一阶段，42℃.60m
第二阶段95℃5mi
第三阶段，4℃5minWww.bzxZ.net
6.6.2PCR反应
PCR反应体系，采用50pL反应体系见表2表2
10×PCR缓冲液（Mg+）
25pmal/l上游引物
25pmol/μL下游引物
10mmo/LdNTPs
U/plTag醇
RT产物
PCR反应体系
6.6.3扩增程序及反应条件
将PCR反应管置于PCR扩增仪，反应参数设置第一阶段，95℃预变性5min。
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第二阶段，94℃变性1min、50℃退火1min.72℃延伸1min，共30个循环。第三阶段，72℃延伸10min，最后4℃保存。6.7PCR产物的电泳检测
用TAE电泳缓冲液配制成1%琼脂糖平板（漠化乙锭终浓度0.5ug/mL）。将平板放入水平电泳槽中，加人1XTAE电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面收Pe
物6与6上样缓冲液混合·分
别加人样品孔中，取5uLDNAMarkerDL2o00加人到标准相对分子质量对照孔内。5V/cm恒压电泳30min~45min。
6.8结果判定
用凝胶成像系统进行分析。阳性样品扩增一条大小为4bp的特异性条带，阴性对照和空白对照应无该特异性条带：在阴性和阳性对照成立情况下如被检样品无条带，则结果为阴性，如被检样品有条带，大小为440bp，即判定为DHV1工病毒核酸阳性。取PCR扩增产物进行序列测定，进一步确认待测样品的结果。序列参见附录C。
如果出现与设计长度不同的条带，为非特异性反应：需重复试验，两次试验都为非特异性反应时，可判为阴性。
7实时荧光PCR试验
仪器、材料与试剂
7.1.1仪器
荧光PCR检测仪、低温高速离心机组织匀浆器，7.1.2材料
可调微量移液器（200μL~1000l20L头（处理方法同6.1.2）、光学PCR反应管7.1.3试剂
20μL0.5μL~10μL）、离心管和吸Trizol、三氟甲烷、异丙醇、75%乙醇、DEPC水，反转录酶、dNTPs（每种浓度均为10mmol/L）、5XRT缓冲液、RNA抑制剂RNasin(40U/μL)、TaqDNA聚合酶(5U/μL）、TE(pH8.0)、ExTaqDNA聚合酶（5U/μL）、10×ExTaqbuffer、dNTPs2.5mmol/L、上、下游引物均为20pmol/μL，探针10pmal/μl。商品化的荧光PCR试剂盒可以用来进行荧光PCR反应体系的配制。7.2阳性对照
同6.2。
7.3阴性对照
同6.3。
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7.4引物与探针
根据GenBank中DHVT的非结构蛋白基因序列，设计合成·-对特异性引物：上游引物5.ATGTAACTGATGAGATATGGCAGGT-3，下游引物5'-TTGATGTCATATCCCAAGACAGC-3'，均配制成20心!/μI2O℃保存;TaQMa探针(FAM>5'-FAM-AIGIGTTCAGGATCCCCAIGIAC-TACCGT-TAMRA-3(TAMRA)均配制成10pmo1/ml.20℃保存。7.5RNA 抽提
按照6.5或按照RNA抽提试剂盒操作说明提取病毒RNA。同时设阳性对照和阴性对照。7. 6荧光 PCR 检测
7.6.1荧光PCR反应体系
5 U/r-L 避转录酶
5 U/μ Tan
10XFx× Ta 缓冲液
上游引物
下游引物
IHY RNA
灭菌三熊水
荧光 PCR反应体系
总体积为25L体系，用漩涡混勾器进行混瞬间离心，备用，7.6.2荧光PCR反应参数
在检测区进行。将7.6.1中加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。反应参数设置：
第-阶段,40℃ 25 min
第二阶段,94 ℃ 3 min，
第三阶段，93℃15s.55℃45s（在此收集荧光）、40个循环。7.7结果判定
7.7.1结果分析条件设定
读取检测结果。阅值设定原则以阅值线测好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器司根据仪器噪音情况进行调整。
7.7.2质控标准
阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。阳性对照的Ct值应≤32.).并出现特定的扩增曲线如阴性对照和阳性对照条件不满足以1条件，此实验视为无效，需重做。7.7.3结果描述及判定
SN/T3464—2012
明性：无Ci值并且无扩增曲线，表明样品中无鸭病毒性肝炎1型病毒核酸，附性：C1≤32.0，且出现特定的扩增曲线，表示样品4存在鸭病毒性肝炎I型病毒核酸8病毒中和试验
8.1仪器、材料与试剂
8. 1. 1 仪器
生物安仑柜，高速冷冻离心机、孵化箱。8.1.2村料
一-次性注射器（1nL,5mL）、吸管（5mL.10mI)、0.22mm滤。8.1.3试剂
生埋盐水，育霉紊，链霉素、LHVI阳性血清（在国内诊断检疫仅用DHVI，对进境鸭的检按还应加上DHV 、DHV Ⅲ抗血消）。
8.2实验动物
12.~14日龄的易感健康鸭胚、也可选用9～10日龄的SPF鸡压8.3操作方法
8.3.1病料处理
无菌来取数例病鸭的肝脏组织10，于研钵中剪碎匀浆，按1：10（质量：体积）加入生理盐水。将勾浆液转至5mL灭菌离心管中，4℃，30001/min离心10min。弃去.1层脂防，抽取中间清亮的液体，再经无菌的0.22μm德器过滤，收集滤过的液体，加入抗菌素至终浓度为青霉素20001U/ml.，链霉素2000μg/mL.作为病料样品直接接种；或分装灭菌容器、一20C保存待检，保存期不超过1年。取0.5mL病料样品，m人4,5ml.的生理盐水，制备成100倍稀释的待检病毒液。8. 3. 2试验
选取75只鸭胚或鸡胚，分为A，B和共三组，每组各25只胚，处理如下：a）A组（中和试验组）：取2ml.阳性血清和2ml.的待检摘毒液，混合均勾，置于37芒温箱中作用30min后，每胚经尿囊腔接种0.2mL。b）B组（接种试验纠)：取2ml.的生理盐水，加入2nI.待检病毒液，混匀，每只胚经尿囊腔接种0. 2 mL,
c）C组（对照组）：每只胚经尿囊腔接种0.2ml的生理盐水。将上述三组接种的鸭（鸡）胚用石蜡封口后，置于37℃孵化箱内继续孵化，每天照蛋2次，剔除接种SN/T3464-2012
后24h内死亡的胚，分组记录其死亡情况及胚胎剖检病变。观察至第7d(如用鸡胚，则为10d）。8.4结果判定
当C组中没有任何胚胎死亡，才可进行如下判定，否则应重检。阳性结果：B组特征性死亡的鸭（鸡）胚总数达20%以上（含20%），而A组的胚不死亡。a
6）可疑结果，B组特征性死亡的鸭（鸡）胚总数低于20%，而A组的胚不死亡。此可疑结果应重检，仍为可疑时则判为阳性。
阴性结果：A组和B组的胚均不死亡。9微量血清中和试验
9.1仪器、材料与试剂
9.1.1仪器
生物安全柜、高速冷冻离心机、CO，培养箱、倒置显微镜、水浴锅、9.1.2试剂
生理盐水、维持液、培养液、胎牛血清、鸡血清、睫蛋白酶、谷氨酰胶、Hanks无钙镁平衡盐溶液、抗菌素溶液、琼脂糖维持液、10%福尔马林1%的结晶紫9.1.3材料
DHVI型毒株、1mL离心管、DHV
工型阳性血清、DHVI型阴性血清、DEL细胞单层的准备、DEK细胞悬液的准备（见B.2），移液器（200μL1000uL.20L孔细胞培养板和6孔细胞培养板
9.2病毒毒价（TCIDso）测定
200L）及吸头、0.22μm滤器、96取DHV-T细胞适应毒用稀释液将进行10倍系列稀释，加人96孔培养板内，每孔50uL，每个稀释度接种8个培养孔，然后每孔加人100L的DEK细胞悬液，然后每孔补加稀释液50μL。加盖后，置37℃5%二氧化碳培养箱培养
96h，取出观察
并记录CPE.按
Reed-Muench方法计算出病毒的
TCIDso·使用前配制成含200TCID/50ML的病毒悬液备用
9.3操作步骤
9.3.1血清灭活
DHV阳性血清、阴性血清、被检血清样品经56℃，30min灭活。9.3.2血清稀释及中和感作
分别取阳性血清、阴性血清、被检血清样品·用稀释液作两倍系列稀释，从稀释度1：4开始每个稀释度加人等量病毒悬液，稀释度1：2的加人等量的稀释液用作血清对照，然后置37℃中和感作60min。
9.3.3病毒对照设立
将病毒稀释为1000TCID/50μL，100TCID/50uL10TCIDs/50μl，1TCIDsa/50μL，每个8
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稀释度做4孔，每孔加入50μL.再加入100uL的DEK细胞悬液，每孔补加稀释液50μL。9.3.4中和试验
将感作好的血清混合液加人96孔板内（第1~11孔），每孔100uL，每个稀释度需做4个孔，第12孔加人100μL的稀释液用作正常细胞对照，然后原代DEK细胞用含10%胰酶消化大豆蛋白磷酸盐肉汤、2mmol/L谷氨酰胺、0.17%碳酸氢钠和2%鸡血清的BME细胞生长液调整为3×105个/mL，取100μLDEK细胞悬液加到上述病毒血清混合物。置37℃3%~5%二氧化碳培养箱培养96h，取出后在低倍倒置显微镜观察并记录CPE，或用10%福尔马林固定和1%的结品紫染色后观察9.4结果判定
当细胞对照和血清对照正常，朗性血清各孔出现CPE.阳性血清效价与原滴定的效价相差1个滴度以内，病毒对照的回归滴度与原测定滴度相差不超过100.5时，整个试验有效。能够完全抑制病毒产生CPE的血清最高稀释倍数为该Ⅲ清的抗体中和效价血清抗体效价在1：16以上（含1：16）判为阳性。
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A. 1 青囊素,链霉素
附录A
（规范性附录）
溶液配制
取青霉素100万单位，链霉素！g+溶于10)ml灭菌Hank平衡盐溶液，浓度为背霉素10000U/ml和链霉素10000g/ml。青莓系的工作浓度为2000U/ml.,链霉素的工作浓度为2000μg/mlA.2Hanks平衡盐溶液
氯化钠8.0g.葡萄糖1.0g，氯化钾0.4g，磷酸氢二钠0.12g，磷酸二氢钾（.0G，酚红0.02g，氟化钙（含2个水)0.18g硫酸镁（含7个水>0.2g，加水至1000ml,115℃高压灭菌15min.冷却后放4℃保存备用，使用前用3.5%的碳酸氢钠调整pH值至7.2。A.3Hank's无钙镁平衡盐溶液
氯化钠8.0g+葡萄糖1.0g·氯化钾0.1号磷酸氮二钠0.12g，磷酸二氢钾0.06多，酚红0.02g.加水至 000 ml.,l15 C离压灭菌 15 rnin,冷却后放 4 ℃:保存备用,使用前用 3. 5%的碳酸氢钠调整 pH值至 7. 2。
A.4抗菌素溶液
选用庆大氰素，按每意升含【方单位用水配制，放4亡保存备用。A.5胰酶消化液
用Hank2s无钙、镁平衡盐溶液配成0.125%溶液，经过滤除菌后分装，一20℃备用。A.6细胞培养液
MEM培养基500mI（或按说明配制）4℃保存备用，使用时按10%的FCS.2mmol/L.谷氨酰胺、0.17头的碳酸氛钠和1%的抗菌素溶液加人配成细胞培养液。A.7维持液
MEM培养基500mL（或按说明配制)4C保存备用.使用时加入【%的抗菌素溶液。A.8琼脂维持液
MEM培养基500mL(或按说明配制)4℃保存备用，使用时按4%加入鸡血清和按0.2%加入10
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