SN/T 4261-2015.Determination of benzo(a ) pyrene residue in Chinese herbal medicine for export.
1范围
SN/T 4261规定了中药材中苯并(a)芘残留量的气相色谱串联质谱测定方法及高效液相色谱测定方法。
SN/T 4261第一法和第二法均适用于熟地黄、人参、黄芪、甘草、半夏、番泻叶、菊花、枸杞、苦杏仁、绞股蓝、茯苓、僵蚕、蜂胶等中药材中苯并(a)芘残留量的测定，第一法可以对苯并(a)芘进行确证。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3方法提要
试样用水浸泡后,用正己烷萃取,硅胶固相萃取柱和聚苯乙烯二z烯基苯共聚物固相萃取柱净化，用气相色谱-串联质谱仪进行测定和确证，内标法定量。
4试剂和材料
除另有规定外,所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。
4.1 正已烷:HPLC级。
4.2二氯甲烷:HPLC级。
4.3 正已烷-二氯甲烷(3+1,体积比):量取300 mL正己烷与100mL二氯甲烷混合均匀。
4.11聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物固相萃取柱:500mg/6mL.
4.12 玻璃纤维滤纸:孔径1.5 μm。
5仪 器和设备
5.1 气相色谱-串联质谱仪:配有EI电离源、串联四级杆质量分析器。
5.2 分析天平:感量为0.01 mg和0.01 g。
5.3高速粉碎机。
5.4超声波提取仪。
5.5 离心机:4500 r/min。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4261—2015
出口中药材中苯并（a）花残留量的测定Determination of benzo(a)pyrene residue in Chinese herbal medicine for export2015-05-26发布
中华人民共和国
玉家质量监督检验检疫总局
2016-01-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4261—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国陕西出入境检验检疫局本标准起草人：何强、孔祥虹、李建华、李高华、吴双民、张莹、邹阳、张璐、李莹、付骋宇。1范围
出口中药材中苯并（a）残留量的测定SN/T4261—2015
本标准规定了中药材中苯并（α）比残留量的气相色谱-串联质谱测定方法及高效液相色谱测定方法。
本标准第一法和第二法均适用于熟地黄、人参、黄芪、甘草、半夏、番泻叶、菊花、枸杞、苦否仁、绞股蓝、茯苓、僵蚕、蜂胶等中药材中苯并α）芘残留量的测定，第一法可以对苯并（α）芘进行确证。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法第一法气相色谱-串联质谱法
3方法提要
相萃取柱和聚苯乙烯
试样用水浸泡后，用正已烷萃取，、硅胶固
用气相色谱-串联质谱仪进行测定和确证，内标法定量4试剂和材料
乙烯基苯共聚物固相萃取柱净化除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1正已烷：HPLC级。
二氯甲烷：HPLC级。
4.3正已烷-二氯甲烷（3+1，体积比）：量取300mL正已烷与100mL二氯甲烷混合均勺。4.4苯并（a）标准物质（Benzo（a）pyrene.CH，CAS号：50-32-8）：纯度大于等于99%4.5D-苯并花内标物（Benzo（a）pyrene-Di2CzDiCAS号：63466-71-7)：纯度大于等于98%。4.6苯并（a）花标准储备溶液：准确称取适量的苯并（a）花标准物质，用二氯甲烷配制成1000ug/mL的标准储备溶液，0℃~4℃保存。4.7D1z-苯并花内标物储备溶液：准确称取适量的Di2-苯并花标准物质，用正已烷配制成100μg/mL的标准储备溶液，或市购D-苯并花标准溶液，0℃～4℃保存。4.8D1-苯并花内标物工作溶液：将D12-苯并芪内标物储备溶液用正已烷逐级稀释，配制成0.05μg/mL的标准工作溶液，0℃～4℃保存。4.9系列标准工作溶液：取一定量的苯升（a）标准溶液和D1z-苯并芪内标物溶液混合，用正已烷定容，配制成苯并（a）比浓度为2ng/mL～100ng/mL，Dla-苯并花均为10ng/ml的系列标准溶液，0℃~4℃保存。
4.10硅胶固相萃取柱：1g/6mL
SN/T4261—2015
聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物固相萃取柱：500mg/6mL。4.11
玻璃纤维滤纸：孔径1.5μm。
5仪器和设备
1气相色谱-串联质谱仪：配有EI电离源、串联四级杆质量分析器。5.1
2分析天平：感量为0.01mg和0.01g。5.2
3高速粉碎机。
5.4超声波提取仪。
离心机：4500r/min。
5.6固相萃取装置。
具塞离心管：50mL。
3减压旋转蒸发器
浓缩瓶：50mL，100mL
试样制备与保存
人参、黄民、甘草、半夏、番泻叶、菊花、苦杏仁、绞股蓝、茯苓、僵蚕等样品取不少于200名·用高速粉碎机粉碎，过孔径约0.3mm的筛，取通过筛网的药材粉末装人洁净的容器内，密闭并标明标记，于0℃~4℃保存。熟地黄、构杞、蜂胶等样品先切成小块，装人洁净样品袋中在18℃冷冻2h以上，取出后迅速进行高速粉碎，粉碎后的样品再装入洁净容器内，密闭并标明标记，于18℃保存。7测定步骤
7.1提取
称取2g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，加入200μL的D2-苯并花内标溶液（4.8），再加人20ml.水，超声浸泡30min，加人15mL正已烷，振荡提取10min，4000r/min离心3min，取上层正已烷溶液丁100ml浓缩瓶中，用15mL正已烷再重复举取2次，合并正已烷萃取液，于40℃减压浓缩至约5ml.，待净化
蜂胶样品浓缩后需要用玻璃纤维滤纸过滤，并用约5mL正已烷淋洗玻璃纤维滤纸7.2净化
将硅胶固相萃取柱串接在聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物固相萃取柱上方，依次用5mL二氯甲烷、10mL正已烷活化，取样品溶液上样，并用约5mL正已烷洗涤样品浓缩瓶，洗涤液合并1样，再用15mL正已烷淋洗·弃去硅胶固相萃取柱.用5mL正已烷淋洗聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物固相萃取柱，最后用5mL正已烷-二氯甲烷溶液（4.3）洗脱，整个净化过程保持流速2mL/min~3mL/min，收集洗脱液，于40℃减压浓缩至干，加入1.0mL正已烷溶解定容，供气相色谱-申联质谱法测定和确证。7.3测定
7.3.1气相色谱-串联质谱参考条件气相色谱串联质谱参考条件如下：a）色谱柱：DB-5MS弹性石英毛细管柱，30m×0.25mm（内径）.膜厚0.25μm.或相当者：2bzxz.net
-TKAONKAca
SN/T4261—2015
b）色谱柱温度：120℃保持0.5min，以20℃/min的速度升温至250℃.保持8min，再以10℃/min的速度升温至290℃保持5min；
进样口温度：280℃：
色谱-质谱接口温度：290℃；
载气：氮气，纯度大于等于99.999%，流速1.0ml./min；进样量：1.0μL；
进样方式：不分流进样，1min后打开分流阀；电离方式：EI
电离能量：70eV；
离子源温度：250℃；
碰撞气：氩气，纯度大于等于99.999%，压力2.0mTorr；测定方式：多重反应监测模式（MRM)；多重反应监测条件：苯并(α）花及同位素内标Di2-苯并花的质谱检测条件见表1；溶剂延迟：15min。
表1苯并（a）花测定的MRM条件
化合物
苯并(α)
Di-苯并花
定量离子对
252/250
264/260
7.3.2气相色谱-串联质谱测定及确证7.3.2.1定量测定
碰撞能量
定性离子对
252/224
碰撞能量
根据样液中苯并（α）花含量情况，选定与样液浓度相近的标准工作溶液，标准工作溶液和样液中苯并（α）芪的响应值均应在仪器检测线性范围内，对标准工作溶液和样液等体积分时段参插进样测定，内标法定量，在7.3.1规定的气相色谱-串联质谱条件下，苯并（α）比标准溶液的气相色谱-串联质谱选择离子流图参见附录A中图A.1。
7.3.2.2定性测定
对标准工作液及样液按731规定的条件进行测定时，如果样液与标准工作液的选择离子图中样液中目标物质的保留时间与相近浓度标准溶液的保留时间偏差在土2.5%以内：且定性离子对的相对丰度与相近浓度标准溶液对应定性离子对的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。
表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%
充许的相对偏差/%
>10~20
-TiKAoNiKAca
SN/T4261—2015
平行试验
按以上检测步骤，对同一试样进行平行试验测定。7.5
空自试验
除不加试样外，均按上述检测步骤进行，7.6结果计算和表述
用色谱数据处理机或按式(1)计算试样中苯并（a）花含量：OXAXAX
CXAXAXM
式中：
试样中苯并（α）芪的含量，单位为微克母000
克cug/kg
标准工作液中苯并（α）范的浓度，单位为纳克每毫关升(ng/mL)：
样液中内标物Dis-举并芘的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；样液中苯并(a)芘的峰面积
标准工作液中内标物D苯并比的峰面积样液定容体积，单位为室升（ml）：标准工作液中内标物D茉并花的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
样液中内标物D苯开的峰面积：
标准工作液中苯并（a）花的峰面积；最终样液所代表的试样量，单立为克g计算结果应扣除空白值。
8测定低限，回收率
测定低限
本方法测定低限为1.0ug/kg
8.2回收率
苯并(a)范的添加水平及回收率数据参见附录B中表13.1。第二法济
液相色谱法
9方法提要
试样用水浸泡后，用正己烷萃取，硅胶固相苯取柱和聚乙烯-二乙烯基苯共聚物固相萃取柱净化，用液相色谱-荧光检测法进行测定，外标法定量。10试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。4
-riKAoNiKAca
10.1正已烷：同4.1。
二氯甲烷：同4.2。
10.3乙腈：HPLC级。
10.4正已烷-二氯甲烷（3+1，体积比）：同4.3。10.5乙睛-水（85+15.体积比）：量取850mL乙睛与150mL水混合均勾。10.6苯并（a）芘标准物质：同4.4。10.7苯并（a）能标准储备溶液：同4.6。SN/T4261-—2015
10.8苯并（a）芪标准工作溶液：将苯并（α）芘标准储备溶液根据需要用乙睛逐级稀释，配制成0.05μg/ml.~0.21g/mL的标准工作溶液，0℃~4℃保存。10.9系列标准工作溶液：分别取定量的米并（α）花标准工作溶液·用腈定容，配制成苯并（a）范浓度为2ng/mL~100ng/mL的系列标准液.0℃~4C保存。10.10
硅胶固相萃取柱：同4.10。
聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物固相萃取柱：同4.1玻璃纤维滤纸：孔径1.5um。
微孔滤膜：0.2qm，有机系。
仪器和设备
液相色谱仪：配有荧光检测器
11.2其他仪器和设备同5.2~5.9。试样制备与保存
同6。
13测定步骤
13.1提取
除不加人200μL的D12-苯并花内标溶液（4.8）外.其余同7.113.2净化
将硅胶固相萃取柱串接在聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物固相萃取柱上方，依次用5mL二氯甲烷，10mL正已烷活化，取样品溶液上样，并用约5mL正已烷洗涤样品浓缩瓶，洗涤液合并上样，再用15mL正已烷淋洗，弃去硅胶固相萃取柱，用5mL正已烷二氯甲烷溶液（4.3）洗脱聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物固相萃取柱，整个净化过程保持流速2ml./min~3mL/min，收集洗脱液，于40℃减压浓缩至干，加入1.0mL乙睛溶解定容，过0.2μm微孔滤膜，供液相色谱-荧光检测法检测。13.3测定
液相色谱条件
液相色谱条件如下：
色谱柱：多环芳烃专用液相色谱柱，长250mm，内径4.6mm，粒径5um，或相当者；a）
b）流动相：乙睛-水（85+15，体积比）等度洗脱：-TKAoNiKAca
SN/T4261—2015
柱温：35：
激发波长：384nm：发射波长：466nmd)
流速：Loml/min；
进样量：20μL。
液相色谱测定
根据样液中苯并（α）芪含量情况：选定与样液浓度相近的标准工作溶液，标准工作溶液和样液中苯并（α）能的响应值均应在仪器检测线性范围内，如果样液中苯并（a）花含量超出检测的线性范围，则稀释后再进样。对标准工作溶液和样液等体积分时段参插进样测定，以保留时间定性，外标法定量，在13.3.1给定的液相色谱条件下，本并（a）花标准溶液的液相色谱图参见附录A中图A.2。13.4
平行试验
按以上检测步骤，对同-试样进行平行试验测定。13.5
空自试验
除不加试样外，均按上述检测步骤进行13.6结果计算和表述
用色谱数据处理机或按式(2)计算试样中苯并(α）能含量：AXCXV
式中：
试样中苯并（a)芘的含量，单位为微克每下克（μg/kg）；样液中苯并（a）芪的色谱峰面积：标准工作液中苯并（a）芘的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL）：样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；标准工作液中米并（a）的色谱峰面积：最终样液所代表的试样量，单位为克（g）。计算结果应扣除空白值。
14测定低限回收率
14.1测定低限
本方法的测定低限为1.0ug/kg。14.2回收率
苯并(a)芪的添加水平及国收率数据参见附录B中表B.1..（2)
-iKAoNrKAca
附录A
（资料性附录）
SN/T4261-2015
苯并（a）标准溶液的气相色谱-串联质谱选择离子流图及液相色谱图Benzo(a)pyrene
11000252>250
Time(min)
Benzo(a)pyrene
3000252>224
Time(min)
Benzo(a)pyrene-Diz
264>260
Time(min)
苯并（a）花标准溶液的气相色谱-串联质谱选择离子流图0
苯并(a)芘标准溶液的液相色谱图30.00
SN/T 4261—2015
熟地黄
番泻叶
苦香仁
附录B
（资料性附录）
苯并（a）残留量检测的添加回收率数据表B.1
中药材中苯并（a）花检测的添加回收率数据气相色谱-串联质谱法
加标水平
回收率范围
82.0105.0
50.0~1010
82.0--164.0
85.5~102.5
87.2-~103.6
85.8--105.0
83.0~-105号
85.2--100.0
88.20-102.6
87.2~-104.4
81.0~101.0
80.5101.5
86.8-102.6
83.0-103.0
83.5102.5
88.2-104.2
82.0~-107.0
86.0~102.0
88.8~104.2
加标水平
液相色谱法
回收率范用
75.0~103.0
81.6101.2
82.0-102.6
80.0~98.0
81.4100.6
80.0~99.8
78.0--101.0
78.5~102.5
80.0100.2
79.5~100.5
81.2102.2
78.0~102.0
79.6--105.8
79.0100.0
79.5~98.0
79.0~101.0
80.0~1c1.5
80.6--102.8
绞股蓝
表B.1（续）
气相色谱-串联质谱法
加标水平
回收率范围
83.0~102.0
86.5~102.0
88.6101.0
85:0-105.5
88.8102.2
84.0--104
84.0-102.5
86.2-1030
加标水平
SN/T4261—2015
液相色增法
回收率范围
78.0-101.0
79.5~-100.0
82.0~101.2
78.0~101.0
75.0~100.0
77.6~98.6
77.0~97.0
78.5~99.0
82.0-±97.2
75.0-~99.0
80.0-~97.5
79.4--99.0
SN/T4261-—2015
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