SN/T 4259-2015.Determination of alternaria toxins residues in fruit and vegetables for export-LC-MS/MS method.
1范围
SN/T 4259规定了水果和蔬菜中链格孢霉素链格孢酚、腾毒素、链格孢酚甲醚四种链格孢菌毒素含量的液相色谱-串联质谱检测方法。
SN/T 4259适用于苹果、梨、葡萄、猕猴桃、柑桔、西红柿.黄瓜、白菜、辣椒等样品中链格孢霉素、链格孢酚、腾毒素、链格孢酚甲醚含量的测定和确证。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
3方法提要
试样中的链格孢菌毒素用乙腈提取后,经聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物固相萃取柱串联氨基固相萃取柱净化,或凝胶渗透色谱仪(GPC)结合氨基固相萃取柱净化，用液相色谱串联质谱仪进行测定和确证,外标法定量。
4试剂和材料
除另有规定外,所用试剂均为分析纯,水为符合GB/T 6682规定的一级水。
4.1乙 腈:HPLC级。
4.2甲 醇:HPLC级。
4.3二氯甲烷。
4.4乙 酸乙酯。
4.5环已烷。
4.6 甲酸。
4.7氯化钠。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4259—2015
出口水果蔬菜中链格孢菌毒素的测定液相色谱-质谱/质谱法
Determination of alternaria toxins residues in fruit andvegetablesforexport-LC-MS/MSmethod2015-05-26发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-01-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T4259—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国陕西出人境检验检疫局。本标准主要起草人：李建华、何强、孔祥虹、邹阳、张璐、李莹、付骋宇。1范围
出口水果蔬菜中链格孢菌毒素的测定液相色谱-质谱/质谱法
SN/T4259—2015
本标准规定了水果和蔬菜中链格孢霉素、链格孢酚、腾毒素、链格孢酚甲醚四种链格孢菌毒素含量的液相色谱-串联质谱检测方法。本标准适用于苹果、梨、葡带、猴桃、柑桔、西红柿、黄瓜、白菜、辣椒等样品中链格孢霉素、链格孢酚、腾毒素、链格孢酚甲醚含量的测定和确证。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3方法提要
试样中的链格孢菌毒素用乙睛提取后，经聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物固相萃取柱串联氨基固相萃取柱净化，或凝胶渗透色谱仪（GPC）结合氨基固相萃取柱净化，用液相色谱申联质谱仪进行测定和确证，外标法定量。
试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1乙睛：HPLC级。
4.2甲醇：HPLC级。
3二氯甲烷。
4.4乙酸乙酯。
4.5环已烷。
5甲酸。
氯化钠。
无水硫酸钠：650℃灼烧4h，贮于密封容器中备用。乙酸乙酯-环己烷（1+1，体积比）：量取1000mL乙酸乙酯与1000mL环己烷混合均勾。4.10甲醇-水溶液（1+4，体积比）：量取100mL甲醇与400mL水混合均勾。4.11甲酸-甲醇-乙酸乙酯溶液（0.5+50+50.体积比）：量取100mL甲醇、100mL乙酸乙酯、1mL中酸混合均匀。
4.12乙睛-水溶液（1+1，体积比）：量取100ml乙睛与100mL水混合均勾。链格孢需素标准物质（Altenuene.C.HlOg，CAS：29752-430）：纯度大于等于99.0%。4.13
链格孢酚标准物质（Alternariol.CiHioO,.CAS：641-38-3）：纯度大于等于98.5%4.14
SN/T4259-—2015
4.15腾毒素标准物质（Tentoxin，Ce.HN.O4，CAS：28540-82-1）：纯度大于等于99.5%。4.16链格孢酚甲醚标准物质（Alternariolmonomethyl-ether，CHiO，CAS：26894-49-5）：纯度大于等于99.0%
4.17标准储备溶液：准确称取适量的链格孢霉素、链格孢酚、腾毒素、链格孢酚甲醚，分别用乙睛制成100μg/mL的标准储备溶液，0℃4℃保存，4.18混合标准工作溶液：分别取适量的链格孢霉素、链格孢酚、腾毒素、链格孢酚甲醚标准储备液，根据需要用乙腈水溶液（4.12）逐级稀释，配制成适当浓度的标准工作溶液。0℃～4℃保存。4.19聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物固相萃取柱：HLB柱，60mg，3mL或相当者。使用前依次用3ml甲醇、5mL水活化，保持柱体湿润。4.20氨基固相萃取柱：500mg，3mL。使用前在柱上端装填约2ctm高的无水硫酸钠（4.8），然后用5mL二氯甲烷活化，保持柱体湿润。4.21微孔滤膜：0.2#m，有机系
5仪器和设备
液相色谱-串联质谱仪：配有ESI电离源，串联四级杆质量分析器。5.2凝胶渗透净化系统
5.3分析天平：感量0.01mg.0.015.4组织捣碎机。
5.5振荡器。
离心机：转速不低于3000r/min。5.7
固相萃取装置，带真空泵。
减压旋转蒸发器。
氮吹仪。
具塞离心管：50mL。
浓缩瓶：50mL100mL
5试样制备与保存
取代表性样品约500g，将其可食用部分切碎后，用组织捣碎机将样品加工成浆状，混匀，装人洁净的容器内，密闭并标明标记，于18℃冷冻保存。
注：在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化：7测定步骤
7.1提取
7.1.1苹果、梨、葡萄、猕猴桃、柑桔、西红柿、黄瓜、白菜称取5g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，加入4g氯化钠，10ml水，15mL乙睛，振荡提取10min，3000r/min离心5min，将上层乙睛提取液转移到浓缩瓶中。再分别用15mL乙睛重复提取两次，合并乙睛提取液，于40℃水浴中减压浓缩至近干，氮气吹干，用1.0mL甲醇溶解残渣，再用9.0mL水稀释，过滤，待净化。
-TTKAONKAca
7.1.2辣椒
SN/T4259—2015
称取5g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，加入4g氯化钠，10mL水，15mL乙，10ml正已烷，振荡提取10min，3000r/min离心5min，用玻璃吸管移取中间的乙睛层于浓缩瓶中。再分别用15mL乙晴重复提取两次，合并乙腈提取液，于40℃水浴中减压浓缩至近干，氮气吹干，用10.0mL乙酸乙酯-环已烷（4.9)溶解残渣，过滤，待净化。7.2净化
7.2.1苹果、梨、葡萄、猕猴桃、柑桔、西红柿、黄瓜、白菜取提取液（7.1.1)5.0mL加人HLB固相萃取柱（4.19），待样品溶液流完后，保持柱体湿润，用5mL甲醇-水（4.10）淋洗，减压抽干2min.将氮基柱（4.20）串接在IILB固相萃取柱下方，用5ml.二氯甲烷淋洗，弃去淋洗液，再用7mL甲酸甲醇-乙酸乙酯溶液（4.11）洗脱，整个净化过程保持2mL/min~）℃减压蒸至近干，氮气吹干，用2.00mL乙睛-水（4.12）溶解定容，过3mL/min的流速，收集洗脱液，400.2μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定和确证7.2.2辣椒
取提取液（7.1.2)5.0mL用凝胶渗透色谱净化，收集洗脱液，于40℃减压蒸至近干，加入2mL二氯甲烷，过氨基柱（4.20）净化，用2nL二氯中烷洗涤浓缩瓶，洗涤液一并过氨基柱，再用5mL二氯甲烷淋洗，弃去淋洗液，用7mL甲酸-甲醇-乙酸乙酯溶液（4.11）洗脱，整个净化过程保持2mL/min～3mL/min的流速，收集洗脱液40
C减压蒸至近干，氮气吹干，用2.00mL乙腈-水（4.12）溶解定容，过0.2um滤膜，供液相色谱-串联质谱测定和确证凝胶渗透色谱净化参考条件：
凝胶柱：内径25mm，柱长400mma，填料为Bio-Beads-S-xsBeads（200mesh400mesh），或a)
相当者；
流动相：乙酸乙酯-环已烷（4.9）：流速：5.0mL/min；
进样量：5.0mL；
收集方式：时间模式，收集19.0min~30.0min洗脱流出液。7.3
液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
色谱柱：C柱，长50mm，内径2.1mm，粒径1.7μm，或相当者；a)
流动相：乙睛-水梯度洗脱，参见表1，梯度变化模式为线性递增或递减；b)
表1流动相条件
mL/min
-TKAONIKAca
SN/T4259—2015
柱温：35℃：
进样量：2.0L。
质谱参考条件
质谱检测参考条件参见附录A。
7.3.3液相色谱-串联质谱检测及确证7.3.3.1定量测定
表1（续）
根据样液中链格孢霉毒素含量情况，选定与样液浓度相近的标准工作溶液，标准工作溶液和样液中链格孢霉毒素的响应值均应在仪器检测线性范围内，如果样液中链格孢霉毒素含量超出检测的线性范国，则稀释后再进样。对标准工作溶液和样液等体积分时段参插进样测定，外标法定量，在7.3规定的色谱及质谱条件下，4种链格孢霉毒素标准品的液相色谱-串联质谱选择性离子流图参见附录B中图B.1.
7.3.3.2定性测定
对标准工作液及样液按7.3规定的条件进行测定时，如果样液与标准工作液的选择离子图中，样液中日标物质的保留时间与相近浓度标准溶液的保留时间偏差在土2.5%以内；且定性离了对的相对丰度与相近浓度标准溶液对应定性离子对的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。
表2定性确证时相对离子丰度的最大充允许偏差相对离了丰度/%
允许的相对偏差/%
7.4空白试验
除不加试样外，均按上述检测步骤进行。7.5结果计算和表述
>20~50
用色谱数据处理机或按式(1)计算试样中链格孢霉毒素含量。AXe.xV
式中：
试样中链格孢霉毒素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg)；10~-20
..................1
-TiKAoNiKAca
样液中链格孢霉毒素的色谱峰面积；标准工作液中链格孢霉毒素的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；标准工作液中链格孢霉毒素的色谱峰面积；最终样液所代表的试样量，单位为克（g）。测定低限、回收率
测定低限
本方法中4种链格孢霉毒素的测定低限均为0.01mg/kg。回收率
4种链格孢霉毒素的添加水平及回收率数据参见附录C中表C.1。SN/T4259—2015
-TrKAoNKAca
SN/T4259—2015
参考条件
电离方式：ESI；
毛细管电压：3kV：
萃取电压：3V；
附录A
（资料性附录）
质谱检测参考条件
脱溶剂气：氮气，纯度299.9%，600L/h锥孔气：氮气，纯度≥99.9%，50L/h，碰撞气：氩气，纯度≥99.999%.0.2mL/min脱溶剂气温度：400℃；
离子源温度：115℃；
采集模式：多重反应监测模式（MRM）：多重反应监测条件见表A.L
表A.14种链格孢霉毒素测定的MRM条件化合物
链格孢霉素
链格孢酚
腾毒素
链格孢酚甲醚
为定量离子对。
MRM离子对
291.1/229.0
291.1/247.1
257.1/213.1*
257.1/146.9
413.4/141.0
413.4/271.3
271.1/256.1*
271.1/228.1
驻留时间
锥孔电压
碰撞能量
注：以上条件为采用WatersQuattroPremierXE申联四级杆质谱仪时的质谱检测参数，若选用其他仪器，可根据具体情况进行调整。
-TiKAoNiKAca
附录B
（资料性附录）
4种链格孢霉毒素的液相色谱-串联质谱选择性离子流图11000-
35000-
17500-
291.1>229.0
257.1>213
TTTTYT
Tentoxin
413.4>141-0
820007
271.1>256.1
41000-
35000-
17500-
41000-
291,1>247.1
SN/T4259-—2015
257.1>146.9
413.4>271.3
Tentoxin
271.1>228.1
图B.14种链格孢霉毒素标准品液相色谱-串联质谱选择性离子流图SN/T4259—2015
歡猴桃
西红柿
加标水平
附录C
（资料性附录）
4种链格孢霉毒素的添加回收率数据水果蔬菜中4种链格孢霉毒素的添加回收率数据回收率范围/%
链格范霉素
72.9~99.5
81.0--101.8
84.9~105.2
74.8~108.2
81.0109.5
82.5--110.8
85.3~108.7
84.5~-110.5
86.3108.4
76.2107.4
79.8-~108.9
81.0~-106.5bzxz.net
78.9-103.8
81.2~-104.7
82.5-106.2
78.5~102.6
79.5106.9
80.8-108.6
77.6~102.2
78.6-101.2
81.5~102.4
78.4~110.2
80.8~109.5
82.7--109.6
74.1~-102.3
79.3~101.4
84.3~102.5
链格孢酚
75.6~-101.1
79.8~104.3
82.9~-103.5
77.5---101.2
81.0-~105.6
82.5--102.0
77.6--105.2
83.6--110.8
84.5~108.9
83.5-~-108.6
81.9107.8
84.9-108.8
81.3m-106.4
83.5~107.8
85.4-109.0
75.1~99.3
77.8-~103.3
79--102.8
82.3~-101.6
83.2-103.6
84.6~-104.5
75.8105.2
79.6--105.8
83.8-104.9
78.8~100.0
80.2~103.6
81.6~103.8
腾毒素
82.9~112.4
83.6--105.2
84.3--113.9
83.7~106.5
82.8110.2
83.6~108.6
81.2-~106.5
85.0--109.8
86.5~109.7
79.8~105.6
86.5--110.9
84.9-~109.1
81.5~105.8
84.5~-107.3
84.4~110.8
79.5109.3
81.3~110.8
86.2--108.C
83.9--107.5
84.2-106.7
85.1-109.2
85.6115.4
86.0~~113.7
85.5~-116.7
84.5-106.2
85.4~110.5
84.9~106.9
链格泡酚甲醛
78.9--103.3
79.8-~102.6
86.4~113.5
85.7~115.8
86.3108.2
79.3-~105.3
84.6--108.9
85.2~-109.0
79.2~105.3
83.1~106.8
79.6~106.9
82.3~107.0
84.1--108.5
87.6~111.5
79.4-113.1
82.2~111.1
81.0~109.0
77.6--104.1
81.5~105.0
82.8-107.2
79.2~100.2
82.1~103.4
83.9~-105.6
78.2~-107.4
82.0~106.9
84.5~107.8
Foreword
ThisstandardwasdraftedaccordancewithGB/T1.1-2009.SN/T4259—2015
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The standard is mainly drafted by Li Jianhua,He Qiang,Kong Xianghong,Zou Yang,Zhang Lu,LiYing，FuChengyu.
SN/T4259—2015
Determinationof alternariatoxinsresiduesinfruitandvegetablesforexportLc-MS/MSmethod1
This standard specifies the methods of qualified and quantified determination of alternuene(ALT),alternariol(AOH),alternariol monomethyl ether(AME)andtentoxin infruits andvegetables byLC-MS/MS.
This standard is applicable to determination and corroboration of ALT,AOH,AME and tentoxin con-tents in apple,pear,grape,kiwi fruit,citrus,tomato,cucumber,cabbage and hot pepper.2Normative references
theapplicationof this document.Fordated references,The following documents are essential foronly dated version applx to this document.Forundated references,the latest edition ( including allthe amendments )apply to this document.GB/T6682 waterforanalyticallaboratoryuse3Methodsummary
nandtestmethods.
Specification
ALT,AOH,AME and tentoxin in the test sample are extracted with acetonitrile.After concentrated,the solution was cleaned with polystyrene-divinylbenzene copolymer SPE column and NH, SPEcol-umns,orcleaned withGPCandNH2SPEcolumns.ThendetectedbyLc-MS/MSandquantitativedu-singexternal standard method.4 Reagents and materials
Unless specified,all reagents should be of analytical grade;\water\is the first grade water prescribedbyGB/T6682
4.1Acetonitrile：HPLCGrade.
4.2Methanol:HPLC Grade
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