SN/T 4643-2016.Standards for sampling，detecting and preserving specimen of nematodes.
1范围
SN/T 4643规定了出人境植物检疫中线虫标本的采集、制作和保存方法。
SN/T 4643适用于出人境检验检疫部门对线虫标本的采集、制作和保存工作。
2方法原理
根据植物病原线虫不同的寄生方式,采集表现瘿瘤、叶斑、坏死变色、畸形等症状的样品,或采集寄主植物的根及根围土壤或介质,用改良漏斗分离法等分离线虫,然后浸泡保存或制作成永久玻片,达到对线虫标本保存的目的。
3仪器、试剂和用具
3.1 仪器
体视显微镜(10×以上,具透射光源)、恒温培养箱、移液器(20μL~200μL)、离心机(2000r/min以上)、冷藏箱、天平、Fenwick漂浮器等。
3.2试剂
福尔马林(4%甲醛)、甘油、乙醇、蔗糖、封片剂(中性树胶、阿拉伯树胶、指甲油)、石蜡、溶液I (96%乙醇/甘油/蒸馏水体积比20: 1: 79)溶液I<甘油/96%乙醇体积比1 : 19).乙二胺四乙酸二钠、二甲基亚砜、氯化钠、氢氧化钠。
DESS溶液配制方法参见附录A。
3..3 用具
钟面皿或培养皿、细胞培养皿、盖玻片、载玻片、剪刀、线虫挑针、酒精灯、双层纸巾、线虫滤纸、纱布、500 μL微量离心管、密闭塑料盒、漏斗、漏斗架、乳胶管、止水夹、加热板、筛网(10目、60目、300目、400目、500目)、取样铲、塑料袋、水桶、记号笔等。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4643—2016
线虫标本采集分离保存规范
Standards for sampling,detecting and preserving specimen of nematodes2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局本标准主要起草人：顾建锋、陈先锋、张慧丽、何洁SN/T4643—2016
1范围
线虫标本采集分离保存规范
本标准规定了出人境植物检疫中线虫标本的采集、制作和保存方法：本标准适用于出人境检验检疫部门对线虫标本的采集、制作和保存工作。2方法原理
SN/T4643—2016
根据植物病原线虫不同的寄生方式，采集表现瘦瘤、叶斑、坏死，变色、畸形等症状的样品，或采集寄主植物的根及根围土或介质，用改良漏斗分离法等分离线虫，然后浸泡保存或制作成永久玻片，达到对线虫标本保存的目的。
3仪器、试剂和用具
3.1仪器
体视显微镜（10×以上，具透射光源）、恒温培养箱、移液器（20μL~200μL）、离心机（2000r/min以上）、冷藏箱、天平，Fenwick漂浮器3.2试剂
福尔马林（4%甲醛）、甘油、醇、燕糖、封片剂（中性树胶、阿拉伯树胶、指甲油）、石蜡、溶液I（96%乙醇/甘油/蒸馏水体积比2079）溶液Ⅱ（甘油/96%乙醇体积比1：19）、乙二胺四乙酸二钠、二甲基亚砜、氯化钠、氢氧化钠。
DESS溶液配制方法参见附录A
3.3用具
钟面皿或培养皿、细胞培养皿、盖玻片、载玻片、剪刀、线虫挑针、酒精灯、双层纸巾、线虫滤纸、纱布、500L微量离心管、密闭塑料盒、漏斗、漏斗架、乳胶管、止水夹、加热板、筛网（10目、60目、300目、400目、500目）、取样铲、塑料袋、水桶、记号笔等4、样品采集
4.1病变组织或土样的采集
植物病原线虫按寄生方式不同一般可分为内寄生和外寄生线虫。大多数寄生线虫危害寄主植物根和地下茎，如根结属线虫Meloidogyne寄生于根内，孢囊属线虫Heterodera部分外露于根部。但也有部分线虫（如粒属线虫Anguina、滑刃属线虫Aphelenchoides，伞滑刃属线虫Bursaphelenchus等）危害植物地上的芽、叶片、茎杆、种子、穗部等。部分植物受线虫危害后，有时可表现瘦瘤、叶斑、坏死、变色、畸形等症状，但地上部分症状一般不显著。植物受线虫危害后，发生明显病变的部位，往往也是病原线虫存在的部位。如粒属线虫在籽粒虫瘦1
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中，部分滑刃属线虫在穗部籽粒颖壳的内侧，根结属线虫和孢囊属线虫都在根部。检测茎、块茎、叶中的线虫时，要注意观察植株花、叶、芽等是否有枯死、褐色角斑、矮小、畸形等受害症状，块茎、鳞茎、球根等是否有干腐、变黑等症状。重点选取表现上述症状的花、叶、芽、块茎等植物组织。
无论针对植物内寄生或外寄生线虫，应考虑把样品可能带有的土壤或介质作为取样重点。取样时应用取样铲采集根系附近的土壤、介质，并尽量多采集根系，采集深度一般为土表下10cm～20cm。样品的数日可考虑具休情况设置，一般每个样品重量为0.5kg左右。4.2采集信息记录和编号
对于进口样品，需记录采集时间、采集地点、采集人，寄主等信息。对于国内采集的样品，还应记录其经纬度和海拔等，必要时摄影存档。从采集的样品到最后的凭证标本、显微照片及DNA等，均需有统一的唯一性标号相对应，可实现系统溯源。4.3采集样品的保存
采集到的组织或土样等要防止干燥，写好标签后应立即放在塑料袋中，密闭袋口，避免阳光直射，及时送实验空检测。如不能及时送检，可将样品置4℃~10℃冷藏箱贮存。5线虫分离
5.1直接解部法
该方法适用于分离孢囊属线虫、根结属线虫等内寄生线虫，以及粒属线虫等体型较大的线虫。其方法是洗净根或种子等表面，放在盛有适量水的玻片或培养皿中，用解剖针撕破组织表面，可见组织内的线虫，有时线虫游离到水中。用线虫挑针或移液器收集线虫或孢囊5.2直接浸泡法
该方法适用于分离地上和地下部分的迁移性内外寄生的线虫，如茎属Ditylenchus、滑刃属、穿孔属Radopholus等。将病组织剪成小段或撕开，加清水，浸泡数小时后即有线虫游出，在体视显微镜下用挑针或移液器收集线虫。
3贝曼漏斗法
该方法适合分离多数样品·但对土壤效果不佳。将10cm~15cm直径的漏斗固定在支架上，下端接一段硅胶管或乳胶管，管的近末端用止水夹夹紧。将待分离的样品（剪成小段的叶片、茎、芽、花或被碎的种子等）用纱布包好，轻轻放人盛有适量清水的漏斗（使样品略露出水面为宜）。20℃～25℃静置24h~48h，打开止水夹，用培养皿或钟面血接取线虫液5mL-~10mL，镜检。5.4浅盘分离法
该方法系贝曼漏斗法的改进，能一次分离较多的样品，因筛网面积大，通气性好能提高分离效率。浅盘分离法装置由两只不锈钢浅盘和双层纸市或纱布组成，上盘为10自的筛网，下盘为正常浅盘。分离线虫时，将双层纸巾或纱布平铺在上盘的筛网上，然后将待分离的样品（介质、土壤、及剪成小段的叶片、茎、芽、花、病残体或破碎的种子等）撒铺在表面：将筛网放在装有适量清水的底盘内（水量以刚好浸透样品为宜）。20℃~25℃静置24h~48h后，移去筛网，用400目分样师收集线虫，然后将线虫液转移到培养血或钟面血，镜检。
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5.5改良漏斗分离法
SN/T4643—2016
改良漏斗法吸取了浅盘法和传统漏斗法各自的优点，在提高了漏斗法分离效率的同时，又解决了浅盘法必须使用套筛而使植物组织等杂物经常堵塞400目筛的筛孔的问题，适合分离各类样品。改良漏斗分离装置由一只较并类似于贝曼漏斗的玻璃或有机玻璃作为外壳，上部装置则与浅盘装置相似。将线虫滤纸或双层纸巾平放在筛盘筛网上，用水淋湿滤纸边缘与筛盘结合部分，将待分离线虫的样品放置其上；从筛盘下部的空隙中将水注人分离器中，以淹没供分离的材料为止；在约20℃～25℃下放置24h~48h后，打开止水夹，用离心管接取约5ml的水样，静置20min左右或1500r/min离心3min，吸去离心管内上层清液后，即获得浓度较高的线虫水悬浮液。5.6直接过筛分离法
该方法可用于分离土壤中的线虫。将约500g土样置于5L水桶中，捏碎土块并用急水流冲成土壤悬浮液，静置约30s后将上清液通过60目的分离筛将悬浮液注入第二个水桶中，再静置约30s，将土壤悬浮液再经过300日的分样筛，收集筛子上的残留物，用漏斗法进行分离。5.7离心漂浮分离法
该方法可用于分离土壤中的线虫。将30g供试土样放在离心管内，加约100mL水并充分小心搅匀，置于离心机内以2000r/min离心5min，弃去上清液，加进配好的800g/.蔗糖溶液搅匀，再次以2000r/min离心5min，将上清液注进预先装水的烧杯里，用300目、400日，500目网筛套在一起，将烧杯内的水倒人筛网，并用水冲洗，最后将三个筛网里的线虫分别洗到带平行横纹的塑料培养血中，置于体视显徽镜下观察。
5.8淘洗-过筛-离心分离法
该方法可用于分离土壤中的线虫。称取土壤约100g，将称好的土倒人水盆中，加水搅勾，静置1min。将水倒人一组网筛，即上层为60目，下层为400目，边倒边震荡分样筛，防止水充满下层的400自筛而从筛中溢出。然后在盆中加人水后混匀，静置1min，倒人网筛中，如此重复三次。将400自的分样筛取下，用喷头把400目网筛中的线虫悬液中的泥浆冲洗干净，倒入烧杯中，静置。将静置烧杯中的上层水轻轻倒掉，只保留下层大药30mL水、线虫和泥浆的混合物。将混合物轻轻摇勾，倒人离心管中，在天平上调平衡，把平衡后的离心管放人离心机中，第一次离心（离心机的转速2000r/min，离心时间为4min）。倒掉第一次离心后的离心管内的上层液，保留土层，在离心管中分别注人比重为1180g/L的熊糖溶液约10mL，在天平上调平衡后，摇匀，放人离心机中进行第二次离心。离心后，迅速取出离心管，把离心管内的上层液倒入500目筛中，用水把蔗糖液冲掉，以防线虫在廉糖液中脱水变形。然后把线虫液冲人烧杯中，随后再转人试管中镜检。5.9Fenwick漂浮器法
该方法可用于孢囊属雌虫的分离。预先将漂浮器和筛子淋湿，漂浮筒内灌满清水。风干的土样放在顶筛中，用强水流冲洗，使全部淋洗到漂浮筒内，并从环颈水槽流到筛子中。静置2min后，把孢囊集中到三角瓶中，水加满而不外溢，孢囊等即漂浮到水面。将漂浮物倒在铺有滤纸的漏斗中，滤去水晾干后挑取孢囊观察。
6线虫标本及其DNA固定保存
6.1福尔马林保存
在体视显微镜下，用移液器将培养血中的线虫转移到500μL微量离心管中，2000r/min离心KoKAca
SN/T4643-—2016
3min，使线虫沉降到微量离心管底部：或静置片刻，使线虫自然沉况降。用移液器将微量离心管上层的水吸出，使管中仅留少量的线虫液（约10uL），然后向管中加人40095℃的福尔马林溶液，杀死线虫即可长期保存，
用该方法保存的线虫适合永久玻片制作及形态学观察，但不适合DNA提取。6.295%乙醇保存
在体视显微镜下，用移液器将培养皿中的线虫转移到500叫l微量离心管中，2000r/min离心3min，使线虫沉降到微量离心管底部；或静置片刻，使线虫自然沉降。用移液器将微量离心管上层的水吸出，使管中仅留少量的线虫液（约10uL），然后向管中加人40CuL.95%乙醇溶液用该方法保存的线虫适合INA提取，但不适合永久玻片制作及形态学观察。6.3DESS溶液保存
在体视显微镜下，用移液器将培养皿中的线重转移到500微量离心管中，2000r/min离心3min，使线虫沉降到微量离心管底部，或静置刻，使线虫自然沉降。用移液器将微量离心管上层的水吸出，使管中仅留少量的线虫液（约10叫，然后向管中加入400DESS溶液，杀死线虫，即可长期保存。
用该方法保存的线虫既适合DNA提取，又可进行水久玻片制作及形态学观察、6.4线虫永久玻片制作
对于上述用福尔马林溶液或DESS固定保存的线虫标木，可进一步制作线虫永久玻片保存。将微量高心管2000r/min离心3min.吸去层福尔马林或DESS溶液后.用移液器将线虫移至卡
细胞培养血中，加人溶液工至血的40℃恒温培养箱中放置12h。
Ⅱ.置于40C恒温培养箱中放
积，再将血置于加有1/10体积96%乙醇的密闭塑料盒中，置行细用移液器吸去皿中大部分溶液（注意不要吸走线虫），加满溶液星126以上，直至乙醇完全挥发。然后取一干净载玻片·在中间加一小滴甘油，在体视显微镜下用挑针将已完全脱水的雌、雄线虫各数条移至甘油滴的中央，排列整齐。取与线虫直径大小一致的玻丝3
3根--4
根，放在山油滴的边缘。
片，置于64℃的加热板上加热，待蜡块融化后自然冷却。在甘油滴两边对称放两块小蜡块，加盖玻用中性树胶、阿拉伯树胶或指甲油封片，待封注明中文名、拉丁名、样品编号、寄主、产地、制作日期、鉴定人等信息，放片剂十后再封1次。贴上标签
人标本盒中（注意保持玻片水平，以防线虫滑动）6.5标本保存要求
应建立完整的标本档案。标本应按照不同类别和保存要求分别置于专门的标本盒或标本柜内保存，定期检查。标本柜和标本盒应做到防潮、防震、防尘。标本保存场所应保持干燥、通风、凉爽、避光，4
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附录A
（资料性附录）
DESS溶液配制方法
A.1配制1L0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）SN/T4643—2016
称取乙二胺四乙酸二钠186.12g，加入500mL去离子水中，再逐渐加人5mol/L氢氧化钠，调节到pH8.0（有时可能需要5mol/L氢氧化钠500ml注意，每次不装加
5mol/l.氢氧化钠过多，每次加
大约5mL，每次间隔约半小时。当pH值为7时，乙二胺四乙酸钠开始溶解，这个过程需要数小时）。最后用去离子水定容至1L。
A.2配制1LDESS溶液
在1L的容量瓶中分别加人500ml0.mol/Lz胺四乙酸二钠（pH8.0）200mL二甲基亚和300mL去离子水，然后加人氯化钠至溶液饱租（通常需要加氯化钠300g~400g）。可先加氯化钠300g，待全部溶解后，每次加氯化钠20g~30g.搅拌并等待20min30min。如全部溶解，则重复上
述步骤。直到氯化钠不再溶解。该过程需要数小时。室温过夜，紧盖盖子以防水分挥发。最后将配制好的DESS溶液倒人试剂瓶中，弃去底部的氧化钠结晶，室温保存，盖紧瓶盖。S
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中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
线虫标本采集分离保存规范
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中国标准出版社出版
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中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16
印张0.75字数12千字
2017年11月第一版2017年11月第一次印刷印数1—500
书号：1550662-32257
定价16.00元
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