SN/T 4647-2016
基本信息
标准号： SN/T 4647-2016
中文名称：草莓疫霉红心病菌检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4647-2016.Detection and identification of Phytophthora fragariae Hickman.
1范围
SN/T 4647规定了草莓疫霉红心病菌( Phytophthora fragariae Hickman)的检疫鉴定方法。
SN/T 4647适用于进出境草莓种苗的根及果实上的草莓疫霉红心病菌的检疫和鉴定。
2规范性引用 文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3草莓疫霉红心病菌基本信息
学名: Phytophthora fragariae Hickman
分类地位:草莓疫霉红心病菌属藻菌界(Chromista)、卵菌门(Oomycota)、霜霉纲(Peronosporea).
霜霉目(Peronosporales)、霜霉科(Peronosporaceae)疫霉属(Ph ytophthora )。Phytophthora fragariae有2个变种: Phytophthora fragariae Hickman var. fragariae Wilcox &. Duncan和Phyto phthora fra-gariae Hickman var. rubi Wilcox &. Duncan。
草莓疫霉红心病菌的其他信息参见附录A。
4方法原理
根据草莓疫霉红心病菌在寄主上的症状、形态学特征和PCR特异性扩增片段为鉴定依据。
1范围
SN/T 4647规定了草莓疫霉红心病菌( Phytophthora fragariae Hickman)的检疫鉴定方法。
SN/T 4647适用于进出境草莓种苗的根及果实上的草莓疫霉红心病菌的检疫和鉴定。
2规范性引用 文件
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3草莓疫霉红心病菌基本信息
学名: Phytophthora fragariae Hickman
分类地位:草莓疫霉红心病菌属藻菌界(Chromista)、卵菌门(Oomycota)、霜霉纲(Peronosporea).
霜霉目(Peronosporales)、霜霉科(Peronosporaceae)疫霉属(Ph ytophthora )。Phytophthora fragariae有2个变种: Phytophthora fragariae Hickman var. fragariae Wilcox &. Duncan和Phyto phthora fra-gariae Hickman var. rubi Wilcox &. Duncan。
草莓疫霉红心病菌的其他信息参见附录A。
4方法原理
根据草莓疫霉红心病菌在寄主上的症状、形态学特征和PCR特异性扩增片段为鉴定依据。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 46472016
草莓疫霉红心病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Phytophthora fragariae Hickman2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4647—2016
本标准起草单位：中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、中华人民共和国南沙出入境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王振华、叶芸、陈萍、李金市、徐雪、魏春艳、李彬、徐家文、王英超、陈建军、曾宪东、陈孝宇、程颖慧、郑剑。
1范围
草莓疫霉红心病菌检疫鉴定方法SN/T4647—2016
本标准规定了草莓疫霉红心病菌（PhytophthorafragariaeHickman）的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境草莓种苗的根及果实上的草莓疫霉红心病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3草莓疫霉红心病菌基本信息
学名：Phytophthora fragariae Hickman分类地位：草莓疫霉红心病菌属藻菌界（Chromista）、卵菌门（Oenycota）、霜霉纲（Peronosporea）霜霉目（Peronosporales）、霜霉科（Peronospora疫霉属（Phytophthora）
Phytophthorafragariae有
2个变种：PhytophthorafragariaeHickkmanvarfragariaeWilcox&Duncan和Phytophthorafra-gariaeHickman var.rubi Wilcox&Duncan
草莓疫霉红心病菌的其他信息参见附录4方法原理
根据草荐疫霉红心病菌在寄主上的症状、形态学特征和PCR特异性扩增片段为鉴定依据5仪器设备和主要试剂
5.1仪器设备
生物显微镜、体视显微镜、植物生长培养箱、高速冷冻离心机、纯水仪、生物安全柜、灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器。5.2主要试剂和培养基
除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T6682要求。5.2.11%次氯酸钠。
5.2.2DNA提取试剂：DNA提取试剂盒。异丙醇，无水乙醇，蛋白酶K20mg/mL），苯酚：三氯甲烷：异戊醇（2524：1)溶液，3mol/LNaAc(pH5.2)。5.2.3PCR试剂：10X×PCR缓冲液（含25mmol/LMgSO,）TagDNA聚合酶，dNTPs（dATP、1
SN/T4647—2016
dTTP、dCTP、dGTP)。
5.2.4凝胶电泳试剂：琼脂糖，TAE.Loading缓冲液，EB。5.2.5V8培养基：V8液100mL.加人2.5g碳酸钙.15g琼脂，蒸馏水900mL，灭菌。5.2.6玉米粉琼脂培养基（CMA）：琼脂15g，玉米粉50g，蒸馏水1000mL，调整pH至6.0.121℃，15min灭菌。
6病菌的鉴定
6.1症状检查
取样品量1%～5%（若样品少可适量增大比例）的种苗、果实进行检查。检查根是否有根腐症状，颜色灰色至褐色，类似“鼠尾状”，根部中柱是否由白色变成红色。植株是否矮小、萎，幼叶蓝绿色，老叶红色、橙色或黄色，结果少。果实的组织是否变褐，水渍状，成熟果实是否变软，表面是否有白色稀疏菌丝体（参见附录A和附录B)。
保湿培养
如根系、花蕾或病果上只有可疑病状而无明显病症，则将病根（截成2cm5cm，从根部的端部切断）或繁殖材料置于样品袋中，于16℃～20℃下保湿培养，每天观察症状的变化，并进行显微镜检或分离培养。
6.3分离培养和诱集
6.3.1分离培养
取具有疑似发病症状的根小段或繁殖材料，用自来水冲洗并用吸水纸吸干表面水分。用1%次氯酸钠表面消毒1min~2min，用无菌水冲洗3次，用无菌吸水纸吸干表面水分后，放于CMA培养基上，16℃~20℃黑暗培养7d14d，如有真菌菌落出现，转到V8培养基上，16℃~20℃12h光照/黑暗培养。
6.3.2卵孢子诱集
将感病的根切碎，按1：2的比例与无土的堆肥充分混合，置于1L容量的盆钵中，将12周龄的草莓（Fragariaesca）种植进来，转人15℃的植物生长培养箱，每天18h光照，每周浇水3次。5周后，诱集植物的根洗净堆肥，检查是否有草莓的红心症状。如果检测到有特征性的卵孢子，即表明显示症状的根部存在红心疫霉病菌（参见附录C）。6.3.3孢子囊培养
将长有菌落得V8培养基切成小块，放在灭菌培养皿中，加人少许灭菌水使培养基表面有游离水，20℃光照培养，1d～2d后观察，如有孢子囊生成，可将培养皿放置4℃，观察游动孢子产生。6.3.4卵孢子培养
取用无菌水洗过，长为15mm的根段放置在含有5mm深的无菌蒸馏水的培养皿中，15℃暗处培养2周后，观察有否卵孢子形成。2
-TKAOKAca
6.4分子生物学鉴定
6.4.1DNA提取
SN/T4647—2016
取疑似寄主植物病组织或收集分离到的真菌菌丝，CTAB法提取核酸（见附录D）。6.4.2PCR检测
P.fragariae的PCR检测方法见附录D。用草莓疫霉红心病菌标准菌株DNA作阳性对照，用灭菌蒸馏水作空白对照。
若PCR初筛结果为阴性，不用做以下实验若PCR初筛结果为阳性，继续以下实验。7鉴定特征
菌落特征
在V8培养基上生长缓慢，在生物显微镜下观察，菌落突起，形态均勾，菌丝絮状，白色无隔7.2病原形态
孢子囊无乳突，椭球形、卵圆形或者倒梨形，孢子囊大小32μm~90μm（平均为60um）×22um52um（平均为38μm）。孢子囊有明显的孢子梗，孢子梗单一或假轴式分支。每个孢子囊萌发产生大约30个～50个肾形的游动孢子。游动孢子为双鞭毛，平均直径为12um。新的孢子囊从老的孢子囊内部发育或从其外部发育，从中能够释放游动孢子。雄器顶生（少有中间生的），平均大小为22m×16μm，为穿雄生或者侧生。藏卵器为顶生或者侧生，球形，直径28μm~46μm（平均直径为39μm），平滑，有纹饰，基部漏斗形，成熟时为金黄褐色。成熟的卵孢子透明，球形、桶形至不规则形，直径22um～44μm（平均直径为33μm），有厚而平滑的壁。卵孢子萌发时常产生一个孢子囊。7.3与近似种的形态区别
草莓疫霉红心病菌与大雄疫霉（typ2）在形态上很相似，菌落形态、卵孢子和孢子囊很接近，只是寄主不同，参见附录E。
结果判定
根据草莓疫霉红心病菌的鉴定特征和分子生物学的检测结果综合判定，如病菌的形态学特征与第7章描述的鉴定指标相符，则可鉴定为草莓疫霉红心病菌。若6.4.2PCR初筛为阴性，可报告未检出草莓疫霉红心病菌；若6.4.2PCR初筛和6.3病菌的分离物PCR检测为阳性，且形态特征符合7.2中描述可报告检出草莓疫霉红心病菌。9样品保存
样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出草莓疫霉红心病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。3
-TTKAONTKAca
SN/T4647—2016
菌株保存与处理
从检测样品中分离并鉴定为草莓疫霉红心病菌的菌株，应妥善保存。菌株在含30%甘油的冻存管中于一80℃保存，或将菌株转接在V8斜面上培养，待菌丝体长满斜面后，置于4℃下保存，并定期（180d）转管。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。9.3
结果记录与资料保存
完整的实验记录包括样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。4
-irKAoNirKAca
A.1分布
主要分布在美洲、欧洲、亚洲。北美洲：加拿天、美国、墨西哥大洋洲：澳大利亚、新西兰
非洲：埃及，
南美洲：厄瓜多尔。
附录A
（资料性附录）
草莓疫霉红心病菌其他相关信息SN/T4647-2016
欧洲：爱尔兰、奥地利、比利时、丹麦、德国、俄罗斯、法国、荷兰、立陶宛、卢森堡、挪威、瑞典、瑞士、斯洛伐克、斯洛文尼亚、乌克兰、意大利、英国亚洲：黎巴嫩、日本、塞浦路斯叙利亚、印度、中国台湾。A.2
寄主范围
该病最初是1949年在兵库县、大阪府、静冈县的露地栽培草每上发现的。主要寄主除栽培草莓外。还有罗甘莓（黑莓和树莓的杂交种），由McKeen于1958年发现被自然侵染。在自然条件下，侵染蔷薇科草莓属Fragaria、路边青属（Geum）、委陵菜属（Potentilla
idaeus）植物。
症状特征
悬钩子属（Rubus）、覆盆子（Rubus病株矮化，在温度高时发生萎為，病被侵染的植株在整个种植期间都有发生，最典型的症状是根腐，害暴发通常从草莓中心病株开始，范围不断扩大，地上部分表现症状通常是在低注、潮湿的地方不规则成片出现，病菌能随水流快速扩广散，造成大面积危害。地
上部叶片
从下部叶开始，重病植株矮化幼叶浅蓝绿色，老叶红色，橙色或黄色，重病株长势差，植株很少结果或不结果，匍甸茎根少，最终死亡。幼龄主根的腐烂从根尖向根茎发展，末端常呈灰色至褐色，类似“鼠尾状”，根上有长裂口，根部中柱变红，从根尖延伸到根茎以上变红。初期的红中柱容易与邻近的健康白色皮层组织区分开来，但是随着腐烂进一步发展和皮层变褐，中柱变得不明显。侧根上也可见腐病和红中柱。果实被害后产生不规则的水渍状褐色病斑，后迅速扩展至整个果面，使果实腐烂，病部亦长出白色霉状物。A.4发病规律
该病菌以卵孢子的形态在土壤中存活多年，有实验证明，该病菌保存4年后仍存活良好，据一些报道表明，在草莓种植后的田间，病菌能保持活力达13年～15年。自前除草莓和罗甘莓外，尚不知自然界是否存在其他的寄主。在委陵菜亚科的几个种上进行的人工接种试验表明，病菌在诸如树和黑莓等寄主上具有存活潜力。
该病害适合在晚秋和早吞的潮湿、冷凉的条件下发生。卵孢子萌发形成1个或几个孢子囊，孢子囊萌发适温是10℃~15℃，低于5℃或高于20℃不能萌发。萌发释放出游动孢子，靠日间游离水游至5
-iiKAoNiKAca
SN/T4647—2016
寄主的根尖侵入寄主，侵染适温10℃~17℃，低于2℃或高于25℃侵染十分缓慢或不能发生侵染，卵孢子在中柱周围可能在韧皮部的筛管内形成，最后病根腐烂，大量卵孢子留在土壤内，可以在土壤中存活多年，使该地多年受到污染A.5
品种抗性
感病品种：Evangeline,Veestar，Glooscap,GovernorSimcoe,Honeoye,Jewel,Kent，Micmac,St.Pierre,BaronSolemacher.
抗病品种Annapolis，Brunswick，Cabot，Cavendish，Mira，Sable，Sparkle.中抗品种：Wendy.Mohawk
A.6传播途径
带菌的草莓或树莓的种植材料及其果实、根系、土壤是远距离传播主要途径KAOMiKAca
附录B
（资料性附录）
草莓疫霉红心病菌病害症状特征图草莓疫霉红心病菌病害症状特征图如图B.1~图B.6所示。图B.1
草莓叶片症状
图B.3侵染植株症状
侵染主根症状
注：图片引白http：//omalra.gov.on.ca/。SN/T4647—2016
图B.2草莓果实症状
侵染根系症状
图B.6剖开主根症状
SN/T4647—2016
附录C
（资料性附录）
草莓疫霉红心病菌菌落和菌丝形态特征图草莓疫霉红心病菌菌落和菌丝形态特征图如图C.1~图C.3所示。图C.1
说明：
孢子囊：
菌落生长初期形态特征
戴卵器、雄器、卵孢子；
一层出现象。
注：仿自A.Vaziri。
孢子囊和孢子梗形态特征
图C.3草莓疫霉红心病菌（PhytophthorafragariaeHickman）形态图8
D.1主要试剂
D.1.1DNA提取的主要试剂
附录D
（规范性附录）
PCR检测
SN/T4647-—2016
CTAB提取液、液氮、RNaseA、Iis饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、75%乙醇。D.1.250×TAE
冰醋酸
NaEDTA·2H,0
加去离子水至1L，使用时加水稀释至1×TALD.1.36×加样缓冲液
溴酚蓝
薰糖水溶液
实验步骤
D.2.1总DNA提取
质量浓度）
采用CTAB法提取样品或病原菌总DNA。将样品或分离培养得到的菌丝体放在研钵中，液氮冷冻后充分研磨。称取液氮研磨处理过的菌丝粉未或根0.1g，移到2mL的离心管中，加人65℃预热的CTAB提取液700uL，置于水浴锅中水浴30
min，期间不断混
勾：加人5μL10mg/mLRNaseA，
充分混勾，在37℃放置30min：加入等体积的Tris饱和盼.充分摇勾，在13000g下离心15min；取上清液，加入等体积三氯甲烷/异戊醇（241）.在13000g
下离心
5min：再取上清液，加人等体积三氯min：加人等体积预冷异丙醇，轻轻摇晃，置于一20℃冰箱甲烷/异戊醇（24：1），在13000品下离小15静置30min在13000g下离心15min；弃上清液，加人70%乙醇500μL，13000g下离心3min，去上清液，重复2次，得到DNA沉淀，充分干燥后，加人30μL～50μLTE或无菌去离子水，充分溶解后，置于-20℃冰箱中保存。
注：也可以采用商品化试剂盒提取总DNA。D.2.2PCR反应
菌丝体PCR扩增
选用下列PCR引物，扩增的目标区域为病原菌ITS基因组序列。上游引物DC1.5-ACTTAGTTGGGGGCCTGTCT3下游引I物DC5：5-CGCCGACTGGCCACACAG-3PCR反应体系见表D.1.反应参数：94℃2min；94℃30s.66℃30s.72℃1min.30个循环；72℃10min。PCR产物大小为533hp。9
SN/T4647-2016
试剂名称
10×PCR缓冲液（含镁离子）
dNTP(2.5mmol/L)
上游引物（10umol/L）
下游引物（1Cμmol/L）
TaqDNA聚合酶（5U/μL)
EDNA模板
病组织PCR扩增wwW.bzxz.Net
PCR反应体系
加样量/uL
补水至25μL
选用下述组套式PCR引物，扩增的目标区域为病原菌ITS基因组序列。第-轮PCR上游引物ITSI：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3下游引物ITS45-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3PCR反应体系见表D.1，反应参数：94℃2min；94℃1min，58℃1mim，72℃1.5min，30个循环：72℃10min
第二轮PCR上游引物P.fragint：5'-TCGATGTCAAACTTGA-3下游引物ITS4：5TCCTCCGCTTATTGATATGC-3套式PCR反应体系见表D.2，反应参数：94℃2min94℃40s，50℃1min，72℃2min，30个循环，72℃4min。PCR产物大小为800bp。表D.2
试剂名称
10XPCR缓冲液（无镁离子）
dNTP(2.5mmol/L)
上游引物（10#mol/L）
下游引物（10μmol/L）
TaQDNA聚合酶（5U/μL)
第一轮PCR产物100倍稀释液
琼脂糖电泳
制备凝胶
PCR反应体系
加样量/μuL
补水至25L
将1×TAE配制1.5%琼脂糖凝胶，加热溶化后冷却至55℃左右。将溴化乙锭（EB)加入到配制好的凝胶中，EB终浓度为0.5ug/mL。将凝胶倒人凝胶槽中，插上样品梳子。冷却凝固后拔掉梳子，在电泳槽内加人1×TAE.缓冲液要没过凝胶表面约1mm。10
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草莓疫霉红心病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Phytophthora fragariae Hickman2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4647—2016
本标准起草单位：中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、中华人民共和国南沙出入境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王振华、叶芸、陈萍、李金市、徐雪、魏春艳、李彬、徐家文、王英超、陈建军、曾宪东、陈孝宇、程颖慧、郑剑。
1范围
草莓疫霉红心病菌检疫鉴定方法SN/T4647—2016
本标准规定了草莓疫霉红心病菌（PhytophthorafragariaeHickman）的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境草莓种苗的根及果实上的草莓疫霉红心病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3草莓疫霉红心病菌基本信息
学名：Phytophthora fragariae Hickman分类地位：草莓疫霉红心病菌属藻菌界（Chromista）、卵菌门（Oenycota）、霜霉纲（Peronosporea）霜霉目（Peronosporales）、霜霉科（Peronospora疫霉属（Phytophthora）
Phytophthorafragariae有
2个变种：PhytophthorafragariaeHickkmanvarfragariaeWilcox&Duncan和Phytophthorafra-gariaeHickman var.rubi Wilcox&Duncan
草莓疫霉红心病菌的其他信息参见附录4方法原理
根据草荐疫霉红心病菌在寄主上的症状、形态学特征和PCR特异性扩增片段为鉴定依据5仪器设备和主要试剂
5.1仪器设备
生物显微镜、体视显微镜、植物生长培养箱、高速冷冻离心机、纯水仪、生物安全柜、灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器。5.2主要试剂和培养基
除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T6682要求。5.2.11%次氯酸钠。
5.2.2DNA提取试剂：DNA提取试剂盒。异丙醇，无水乙醇，蛋白酶K20mg/mL），苯酚：三氯甲烷：异戊醇（2524：1)溶液，3mol/LNaAc(pH5.2)。5.2.3PCR试剂：10X×PCR缓冲液（含25mmol/LMgSO,）TagDNA聚合酶，dNTPs（dATP、1
SN/T4647—2016
dTTP、dCTP、dGTP)。
5.2.4凝胶电泳试剂：琼脂糖，TAE.Loading缓冲液，EB。5.2.5V8培养基：V8液100mL.加人2.5g碳酸钙.15g琼脂，蒸馏水900mL，灭菌。5.2.6玉米粉琼脂培养基（CMA）：琼脂15g，玉米粉50g，蒸馏水1000mL，调整pH至6.0.121℃，15min灭菌。
6病菌的鉴定
6.1症状检查
取样品量1%～5%（若样品少可适量增大比例）的种苗、果实进行检查。检查根是否有根腐症状，颜色灰色至褐色，类似“鼠尾状”，根部中柱是否由白色变成红色。植株是否矮小、萎，幼叶蓝绿色，老叶红色、橙色或黄色，结果少。果实的组织是否变褐，水渍状，成熟果实是否变软，表面是否有白色稀疏菌丝体（参见附录A和附录B)。
保湿培养
如根系、花蕾或病果上只有可疑病状而无明显病症，则将病根（截成2cm5cm，从根部的端部切断）或繁殖材料置于样品袋中，于16℃～20℃下保湿培养，每天观察症状的变化，并进行显微镜检或分离培养。
6.3分离培养和诱集
6.3.1分离培养
取具有疑似发病症状的根小段或繁殖材料，用自来水冲洗并用吸水纸吸干表面水分。用1%次氯酸钠表面消毒1min~2min，用无菌水冲洗3次，用无菌吸水纸吸干表面水分后，放于CMA培养基上，16℃~20℃黑暗培养7d14d，如有真菌菌落出现，转到V8培养基上，16℃~20℃12h光照/黑暗培养。
6.3.2卵孢子诱集
将感病的根切碎，按1：2的比例与无土的堆肥充分混合，置于1L容量的盆钵中，将12周龄的草莓（Fragariaesca）种植进来，转人15℃的植物生长培养箱，每天18h光照，每周浇水3次。5周后，诱集植物的根洗净堆肥，检查是否有草莓的红心症状。如果检测到有特征性的卵孢子，即表明显示症状的根部存在红心疫霉病菌（参见附录C）。6.3.3孢子囊培养
将长有菌落得V8培养基切成小块，放在灭菌培养皿中，加人少许灭菌水使培养基表面有游离水，20℃光照培养，1d～2d后观察，如有孢子囊生成，可将培养皿放置4℃，观察游动孢子产生。6.3.4卵孢子培养
取用无菌水洗过，长为15mm的根段放置在含有5mm深的无菌蒸馏水的培养皿中，15℃暗处培养2周后，观察有否卵孢子形成。2
-TKAOKAca
6.4分子生物学鉴定
6.4.1DNA提取
SN/T4647—2016
取疑似寄主植物病组织或收集分离到的真菌菌丝，CTAB法提取核酸（见附录D）。6.4.2PCR检测
P.fragariae的PCR检测方法见附录D。用草莓疫霉红心病菌标准菌株DNA作阳性对照，用灭菌蒸馏水作空白对照。
若PCR初筛结果为阴性，不用做以下实验若PCR初筛结果为阳性，继续以下实验。7鉴定特征
菌落特征
在V8培养基上生长缓慢，在生物显微镜下观察，菌落突起，形态均勾，菌丝絮状，白色无隔7.2病原形态
孢子囊无乳突，椭球形、卵圆形或者倒梨形，孢子囊大小32μm~90μm（平均为60um）×22um52um（平均为38μm）。孢子囊有明显的孢子梗，孢子梗单一或假轴式分支。每个孢子囊萌发产生大约30个～50个肾形的游动孢子。游动孢子为双鞭毛，平均直径为12um。新的孢子囊从老的孢子囊内部发育或从其外部发育，从中能够释放游动孢子。雄器顶生（少有中间生的），平均大小为22m×16μm，为穿雄生或者侧生。藏卵器为顶生或者侧生，球形，直径28μm~46μm（平均直径为39μm），平滑，有纹饰，基部漏斗形，成熟时为金黄褐色。成熟的卵孢子透明，球形、桶形至不规则形，直径22um～44μm（平均直径为33μm），有厚而平滑的壁。卵孢子萌发时常产生一个孢子囊。7.3与近似种的形态区别
草莓疫霉红心病菌与大雄疫霉（typ2）在形态上很相似，菌落形态、卵孢子和孢子囊很接近，只是寄主不同，参见附录E。
结果判定
根据草莓疫霉红心病菌的鉴定特征和分子生物学的检测结果综合判定，如病菌的形态学特征与第7章描述的鉴定指标相符，则可鉴定为草莓疫霉红心病菌。若6.4.2PCR初筛为阴性，可报告未检出草莓疫霉红心病菌；若6.4.2PCR初筛和6.3病菌的分离物PCR检测为阳性，且形态特征符合7.2中描述可报告检出草莓疫霉红心病菌。9样品保存
样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出草莓疫霉红心病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。3
-TTKAONTKAca
SN/T4647—2016
菌株保存与处理
从检测样品中分离并鉴定为草莓疫霉红心病菌的菌株，应妥善保存。菌株在含30%甘油的冻存管中于一80℃保存，或将菌株转接在V8斜面上培养，待菌丝体长满斜面后，置于4℃下保存，并定期（180d）转管。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。9.3
结果记录与资料保存
完整的实验记录包括样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。4
-irKAoNirKAca
A.1分布
主要分布在美洲、欧洲、亚洲。北美洲：加拿天、美国、墨西哥大洋洲：澳大利亚、新西兰
非洲：埃及，
南美洲：厄瓜多尔。
附录A
（资料性附录）
草莓疫霉红心病菌其他相关信息SN/T4647-2016
欧洲：爱尔兰、奥地利、比利时、丹麦、德国、俄罗斯、法国、荷兰、立陶宛、卢森堡、挪威、瑞典、瑞士、斯洛伐克、斯洛文尼亚、乌克兰、意大利、英国亚洲：黎巴嫩、日本、塞浦路斯叙利亚、印度、中国台湾。A.2
寄主范围
该病最初是1949年在兵库县、大阪府、静冈县的露地栽培草每上发现的。主要寄主除栽培草莓外。还有罗甘莓（黑莓和树莓的杂交种），由McKeen于1958年发现被自然侵染。在自然条件下，侵染蔷薇科草莓属Fragaria、路边青属（Geum）、委陵菜属（Potentilla
idaeus）植物。
症状特征
悬钩子属（Rubus）、覆盆子（Rubus病株矮化，在温度高时发生萎為，病被侵染的植株在整个种植期间都有发生，最典型的症状是根腐，害暴发通常从草莓中心病株开始，范围不断扩大，地上部分表现症状通常是在低注、潮湿的地方不规则成片出现，病菌能随水流快速扩广散，造成大面积危害。地
上部叶片
从下部叶开始，重病植株矮化幼叶浅蓝绿色，老叶红色，橙色或黄色，重病株长势差，植株很少结果或不结果，匍甸茎根少，最终死亡。幼龄主根的腐烂从根尖向根茎发展，末端常呈灰色至褐色，类似“鼠尾状”，根上有长裂口，根部中柱变红，从根尖延伸到根茎以上变红。初期的红中柱容易与邻近的健康白色皮层组织区分开来，但是随着腐烂进一步发展和皮层变褐，中柱变得不明显。侧根上也可见腐病和红中柱。果实被害后产生不规则的水渍状褐色病斑，后迅速扩展至整个果面，使果实腐烂，病部亦长出白色霉状物。A.4发病规律
该病菌以卵孢子的形态在土壤中存活多年，有实验证明，该病菌保存4年后仍存活良好，据一些报道表明，在草莓种植后的田间，病菌能保持活力达13年～15年。自前除草莓和罗甘莓外，尚不知自然界是否存在其他的寄主。在委陵菜亚科的几个种上进行的人工接种试验表明，病菌在诸如树和黑莓等寄主上具有存活潜力。
该病害适合在晚秋和早吞的潮湿、冷凉的条件下发生。卵孢子萌发形成1个或几个孢子囊，孢子囊萌发适温是10℃~15℃，低于5℃或高于20℃不能萌发。萌发释放出游动孢子，靠日间游离水游至5
-iiKAoNiKAca
SN/T4647—2016
寄主的根尖侵入寄主，侵染适温10℃~17℃，低于2℃或高于25℃侵染十分缓慢或不能发生侵染，卵孢子在中柱周围可能在韧皮部的筛管内形成，最后病根腐烂，大量卵孢子留在土壤内，可以在土壤中存活多年，使该地多年受到污染A.5
品种抗性
感病品种：Evangeline,Veestar，Glooscap,GovernorSimcoe,Honeoye,Jewel,Kent，Micmac,St.Pierre,BaronSolemacher.
抗病品种Annapolis，Brunswick，Cabot，Cavendish，Mira，Sable，Sparkle.中抗品种：Wendy.Mohawk
A.6传播途径
带菌的草莓或树莓的种植材料及其果实、根系、土壤是远距离传播主要途径KAOMiKAca
附录B
（资料性附录）
草莓疫霉红心病菌病害症状特征图草莓疫霉红心病菌病害症状特征图如图B.1~图B.6所示。图B.1
草莓叶片症状
图B.3侵染植株症状
侵染主根症状
注：图片引白http：//omalra.gov.on.ca/。SN/T4647—2016
图B.2草莓果实症状
侵染根系症状
图B.6剖开主根症状
SN/T4647—2016
附录C
（资料性附录）
草莓疫霉红心病菌菌落和菌丝形态特征图草莓疫霉红心病菌菌落和菌丝形态特征图如图C.1~图C.3所示。图C.1
说明：
孢子囊：
菌落生长初期形态特征
戴卵器、雄器、卵孢子；
一层出现象。
注：仿自A.Vaziri。
孢子囊和孢子梗形态特征
图C.3草莓疫霉红心病菌（PhytophthorafragariaeHickman）形态图8
D.1主要试剂
D.1.1DNA提取的主要试剂
附录D
（规范性附录）
PCR检测
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CTAB提取液、液氮、RNaseA、Iis饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、75%乙醇。D.1.250×TAE
冰醋酸
NaEDTA·2H,0
加去离子水至1L，使用时加水稀释至1×TALD.1.36×加样缓冲液
溴酚蓝
薰糖水溶液
实验步骤
D.2.1总DNA提取
质量浓度）
采用CTAB法提取样品或病原菌总DNA。将样品或分离培养得到的菌丝体放在研钵中，液氮冷冻后充分研磨。称取液氮研磨处理过的菌丝粉未或根0.1g，移到2mL的离心管中，加人65℃预热的CTAB提取液700uL，置于水浴锅中水浴30
min，期间不断混
勾：加人5μL10mg/mLRNaseA，
充分混勾，在37℃放置30min：加入等体积的Tris饱和盼.充分摇勾，在13000g下离心15min；取上清液，加入等体积三氯甲烷/异戊醇（241）.在13000g
下离心
5min：再取上清液，加人等体积三氯min：加人等体积预冷异丙醇，轻轻摇晃，置于一20℃冰箱甲烷/异戊醇（24：1），在13000品下离小15静置30min在13000g下离心15min；弃上清液，加人70%乙醇500μL，13000g下离心3min，去上清液，重复2次，得到DNA沉淀，充分干燥后，加人30μL～50μLTE或无菌去离子水，充分溶解后，置于-20℃冰箱中保存。
注：也可以采用商品化试剂盒提取总DNA。D.2.2PCR反应
菌丝体PCR扩增
选用下列PCR引物，扩增的目标区域为病原菌ITS基因组序列。上游引物DC1.5-ACTTAGTTGGGGGCCTGTCT3下游引I物DC5：5-CGCCGACTGGCCACACAG-3PCR反应体系见表D.1.反应参数：94℃2min；94℃30s.66℃30s.72℃1min.30个循环；72℃10min。PCR产物大小为533hp。9
SN/T4647-2016
试剂名称
10×PCR缓冲液（含镁离子）
dNTP(2.5mmol/L)
上游引物（10umol/L）
下游引物（1Cμmol/L）
TaqDNA聚合酶（5U/μL)
EDNA模板
病组织PCR扩增wwW.bzxz.Net
PCR反应体系
加样量/uL
补水至25μL
选用下述组套式PCR引物，扩增的目标区域为病原菌ITS基因组序列。第-轮PCR上游引物ITSI：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3下游引物ITS45-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3PCR反应体系见表D.1，反应参数：94℃2min；94℃1min，58℃1mim，72℃1.5min，30个循环：72℃10min
第二轮PCR上游引物P.fragint：5'-TCGATGTCAAACTTGA-3下游引物ITS4：5TCCTCCGCTTATTGATATGC-3套式PCR反应体系见表D.2，反应参数：94℃2min94℃40s，50℃1min，72℃2min，30个循环，72℃4min。PCR产物大小为800bp。表D.2
试剂名称
10XPCR缓冲液（无镁离子）
dNTP(2.5mmol/L)
上游引物（10#mol/L）
下游引物（10μmol/L）
TaQDNA聚合酶（5U/μL)
第一轮PCR产物100倍稀释液
琼脂糖电泳
制备凝胶
PCR反应体系
加样量/μuL
补水至25L
将1×TAE配制1.5%琼脂糖凝胶，加热溶化后冷却至55℃左右。将溴化乙锭（EB)加入到配制好的凝胶中，EB终浓度为0.5ug/mL。将凝胶倒人凝胶槽中，插上样品梳子。冷却凝固后拔掉梳子，在电泳槽内加人1×TAE.缓冲液要没过凝胶表面约1mm。10
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