SN/T 4649-2016.Detection and identification of Did ymella bryoniae (Auersw.) Rehm.
1范围
SN/T 4649规定了瓜类蔓枯病菌Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm的检疫鉴定方法。
SN/T 4649适用于进出口瓜类植物种子、植株、果实中瓜类蔓枯病菌的检疫鉴定。
4方法原理
瓜蔓枯病菌的症状表现、培养性状，形态学特征致病性及PCR特异性扩增检测结果作为瓜蔓枯病菌的检疫鉴定依据。
5仪器设备和主要试剂
5.1 仪器设备
生物显微镜、体视显蔽镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器。
5.2主要 试剂
除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。
1%次氯酸钠.DNA提取相关试剂(盒),PCR相关试剂，电泳试剂。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)(配制方法见附录A)。
6检验方法
6.1 取样和制样
按照SN/T1809的方法抽取进出境瓜类种子样品。
挑选皱缩、干瘪、变色、残缺的种子或有霉变的籽粒。对送检的植株茎部、叶部和果实进行检查时，选取叶片上呈现近圆形或不规则形的黑褐色病斑;茎部选取呈椭圆形或短条状褐色凹陷斑;果实选取圆形、暗褐色的凹陷斑,病斑表面呈星状开裂，内部呈木栓状干腐，发黑、腐烂的果实(参见附录B和附录C)进行病原菌的分离。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T46492016
瓜蔓枯病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Didymella bryoniae (Auersw.) Rehm2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国新疆出人境检验检疫局、石河子大学本标准主要起草人：王瓣、张小菊、孙燕飞张祥林、张伟、李亚伟、张瑜SN/T4649—2016
1范围
瓜蔓枯病菌检疫鉴定方法
SN/T4649-2016
本标准规定了瓜类蔓枯病菌Didymellabryonide（Auersw.）Rehm的检疫鉴定方法本标准适用于进出口瓜类植物种子，植株、果实中瓜类蔓枯病菌的检疫鉴定2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不件。凡是不注日期的引用文件，其最新版SN/T1809进出境植物种子检疫规3瓜蔓枯病菌基本信息
学名：Didymellabryoniae（Auersw无性世代学名：Ascochytacitrulline有性世t代学名：Did ymella bryoniae注日期的版本适用于本文
分类地位：瓜蔓枯病菌属子囊菌门（Ascomycota）、格超腔菌目opleosporales）、隔孢假壳科（Didy态属球壳抱目（Sphieropidales）、壳霉科（Sphaeropsi-mosphaeriaceae），亚隔抱壳属（Didymella无性caceae）壳二孢属（Ascochyta）4方法原理
瓜蔓枯病菌的症状表现、培养性状形态学特征致病性及PCR等异性扩增检测结果作为瓜蔓枯病菌的检疫鉴定依据。
5仪器设备和主要试剂
5.1仪器设备
生物显微镜、体视显蔽镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器。5.2
主要试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。1%次氧酸钠.DNA提取相关试剂（盒）.PCR相关试剂.电泳试剂马铃薯葡葡糖琼脂培养基（PDA)(配制方法见附录A)SN/T4649—2016
6检验方法
6.1取样和制样
按照SN/T1809的方法抽取进出境瓜类种子样品。挑选皱缩、干癌、变色，残缺的种子或有霉变的籽粒。对送检的植株茎部、叶部和果实进行检查时，选取叶片上呈现近圆形或不规则形的黑褐色病斑：茎部选取呈椭圆形或短条状褐色凹陷斑：果实选取圆形、暗褐色的凹陷斑，病斑表面呈星状开裂，内部呈木栓状干腐，发黑、腐烂的果实（参见附录B和附录C)进行病原菌的分离。
6.2分离培养
可将挑选出的可疑瓜类种子置于25℃保湿24h，再经一20℃下24h冷冻处理后用做培养。叶片，茎杆和果实样品可用无菌刀片切取病健交界处3mm～5mm左右的组织进行培养。病斑表面散生有黑色小点（病菌的分生孢子器）的，可以直接用挑针挑取移至培养基上培养。无菌条件下将供试材料用3%次氧酸钠表面消毒5min~10min无菌水洗3次将处理好的材料置于含青/链每素微酸性的PDA培养基平板上，每Ⅲ放置3粒~4粒种子或5块一6块组织，于25C下12h光照黑暗交替培养，培养第3天后开始观察·若发现乳白色或白色可疑菌落，立即用PDA培养基进行纯化。在无菌条件下挑取菌丝制片，于显微镜下观察菌丝和分生孢子形态。如无分生抱子产生，可在25℃的恒温箱中黑暗条件培养5d7d,4d紫外灯照射（间隔12h).再2d暗处理后进行观察，并制片镜检。
6.3PCR检测
将分离出的病原菌.接种到PDA培养基上，25C培养5d，挑取菌丝，用CTAB法或商业化试剂盒提取供试菌株DNA，进行常规PCR检测（参见附录D）。PCR扩增产物检测中，阳性样品应出现314bp的泳带。
6.4致病性测定
实验室首次检出该病菌需做致病性测定。将形态特征与瓜蔓枯病菌相符且PCR检测阳性的分离物进行致病性测定。用灭菌土播种健康瓜类种子，待长出3片一5片真叶后，用灭菌牙签或刀片在茎杆处穿刺或切开组织，用无菌打孔器在培养基上取瓜蔓枯病菌菌丝块，接种在伤口上，用湿润的脱脂棉包裹伤口.用塑料袋覆盖.28C左右.相对湿度100%，黑暗条件下保湿48h，接种后5d一10d后观察接种点附近是否出现可疑病斑，观察症状并对发病子叶再做病原菌分离，鉴定再次分离到的病原菌是否与接种用菌为同一种。
7鉴定特征
该病菌在PDA培养基上的菌落边缘稀薄，中间稠密，略隆起，背面初为白色至黄色，后期变为黑色，正面颜色与菌龄有关，基质内的菌丝深褐色，有同心轮纹不形成子囊座和分生抱子器·打开培养血盖时可闻到灰土味”，分生抱子器黑褐色至黑色，球形至肩球形，直径47.7m～325.1um，分生子圆形或圆简形，无色，单孢、双孢，偶有三孢，大小为（4.5pm~11.5μm）×（2.5μm~6.5μm），平均9.0μmx4.1μms
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8结果判定
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若供试样品中分离出的菌株培养性状和形态特征符合第7章中描述，且PCR扩增结果呈阳性，可8.1
判定检出瓜蔓枯病菌。
8.2若分离菌株的培养性状和形态特征符合第7章中描述·但PCR扩增结果阴性，可判定未检出瓜蔓枯病菌。
8.3若分离菌株的培养性状和形态特征不符合第7章中描述，可判定未检出瓜蔓枯病菌。9
样品保存
样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出瓜蔓枯病菌的样品应保存于4冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。9.2菌株保存与处理
从检测样品中分离并鉴定为瓜蔓枯病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于PDA培养基斜面上。20℃~25℃培养5d，4℃冰箱保存：或将菌丝块转人30%灭菌甘油.4℃冰箱保存：或将菌株冷冻干燥后，一40℃以下冰箱保存，
9.3结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源，种类，时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片3
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附录A
（规范性附录）
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）制备方法青/链霉素微酸性PDA培养基：将洗净后去皮的马铃薯200g切碎，加水1000mL煮沸半小时.用纱布滤去马铃薯，加水补足1000mL，然后加20g葡萄糖和15g~20g琼脂·加热使琼脂完全溶化后，分装在三角瓶中.调整pH至5.6，121C高压灭菌20min。培养基中加人链霉素或青霉素·使抗生素浓度为50单位/mL~100单位/mL，也可再加人3mL乳酸（终浓度0.3%），倒Ⅲ备用。学兔兔wwwbzfxwcon
B.1寄主范围
附录B
（资料性附录）
瓜蔓枯病菌相关信息
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瓜类尊枯病菌在甜芦科植物范围内有广泛的侵架性常见的9种葫芦科植物：黄瓜（Cuc就ms就zvusL)冬瓜(Benineasa hispida Cogn.),南瓜(Cncurbita moschataDuch,瓜(Cucumis melo L.)胡芦[Lagenaria slcerariaMo.)S.I.西iCuruttusugarisSchrad丝瓜(Luffa cylindrica Roem，苦 Momordica charamtia Lageneria fal arisSchrad这些瓜类作物均可受蔓枯病
菌感染，其中以黄瓜、西瓜、冬瓜、氯瓜、甜瓜和葫芦受害最重丝瓜次之南厂瓜和苦瓜仪轻微受害
B.2症状
瓜蔓枯病菌在瓜的整个生育期地上各部购可受，以叶片、瓜蔓受幼苗于叶受害，先出现水浸状小点，后扩展为青妖色大吃鼠，如从吐想蓝受害·初现水漫状小斑·后
扩展到整个子叶，引起子叶粘死，幼苗亡，叶片受害后，最初为浅褐色水漫状小点，后还渐扩大成直径为的黑褐色大斑：叶缘受害，则形成黑褐色班形，医形大斑·病部干，分生抱子器。蔓茎受害，早期多发生在茎基部的分枝处，呈水设状快害处初现植圆形或短条状、媽色凹陷斑，并不断胶质物·附着在病部表面，多密生黑色子秘黄色胶计干润后起结成深红色至黑红色的颗粒状蔓叶枯类，横切病可见落周一圈表皮层变揭，其维管点致便
束不变色，仍为绿色，这一点与枯菱有是不同果实受售，初为术漫状的习
小斑，后扩大成圆形、暗褐色
星状开裂，内部呈木格状干腐
的凹陷斑，在一些品种的果实上，病斑表面常·发黑后则腐烂，病斑上也
可产生许多分散的黑色小点。果实染病病斑圆形，初亦星的渍状，洋喝色或黑色凹陷斑，斑上有很多小黑点，同时出现不规则圆形龟裂斑，后期果实离败？B.3
分布范围
全国各地均有发生，广泛分布在世界各地·包括美国、加拿大、荷兰，瑞典日本，印度，中国台湾等地在我国北京山东，新船江苏，浙江上海，甘市，湖北，海南等地的瓜类产区均有蔓活病的报道B.4传播方式
该病是一种可积累流行的土传、种传病害。病菌以子囊壳、分生孢子器、菌丝体潜伏在病残组织上留在土壤中越冬，翌年产生分生孢子进行初侵染。植株染病后释放出分生孢子借风雨传播，进行再侵染。感病的植株、病残体以及受侵染的种子等植物性材料是远距离传插播主要途轻，5
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附录C
（资料性附录）
感病植株的症状、病菌形态特征图图C.1图C.3给出了感病植株的症状，病菌形态特征。瓜蔓粘病菌感病植株的症状
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注，王拍摄。
病苗分生孢子器
图C.3病原菌形态
b)病菌分生孢子
D.1瓜蔓枯病菌DNA提取
称取充分混匀的待测培养物10
预热的600LCTAB裂解液，据病
出冷却至室温后，加人等体积的至吸取上清液（约600）至一新的
内醇，再加人1/10体积的3mo/
附录D
（资料性附录）
瓜蔓枯病菌普通PCR检测方法
异丙醇时）放置30min以上：4℃，1淀定两次室温15000度离心5min手人50L的去离子水或TE缓冲液
也可用相应市售DNA提取试
D.2PCR检测
Db-1(5-3)
Db-2.(5'-3\)
CCACCACT
AGAGTTO
PCR产物的目标条带为314b
PCR检测反应体系：10X维#
0.5pLDb-1.0.5μlDb-2:0.5L
PCR反应程序为95℃5mn
PCR扩增产物检测
扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶石
D.4结果判定
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管中，加人65℃
nin混勾一次取
心15min小心
0.8倍体积的异
时）或4℃（加人
500L，洗涤沉
挥发殆尽后.加
2.5mmol/L):
统分析。
PCR扩增产物检测，阳性对照出现一条314bp的泳带，阴性对照和空白对照没有该泳带，待检样品如出现314bp的泳带为检测结果阳性，如未出现314bp的泳带为检测结果阴性SN/T46492016
参考文献
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[11]陈秀蓉，魏勇良.瓜类蔓枯病的寄主及越冬菌态研究].中国西瓜甜瓜，1991，（2】：7-9.10
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