SN/T 4660-2016.Identification technology protocol for deer species.
1范围
SN/T 4660规定了梅花鹿、马鹿物种的PCR鉴定方法。
SN/T 4660适用于梅花鹿、马鹿及其产品的物种鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3方法原理
根据GenBank数据库中已公布的梅花鹿、马鹿的线粒体基因组序列，根据种内具有保守性、种间具有特异性的原则选择合适的区域，设计、合成3条引物,样本经过提取总基因组DNA后,利用设计的特异性引物,对梅花鹿、马鹿的目的基因进行PCR扩增，根据PCR扩增结果判定样品中是否含有梅花鹿、马鹿的基因。
4形态特征
梅花鹿、马鹿形态特征参见附录A
5 PCR检测
5.1 主要仪器设备;
PCR仪、组织研磨器、超净工作台、制冰机、高速冷冻离心机、水浴锅、台式小型离心机、常规冰箱、旋涡振荡器、电泳仪、凝胶成像系统、微量可调移液器(10μL、100μL、1000μL)及配套吸头。
5.2试剂 与材料
除特别说明以外,本标准所用试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T6682的规定。
5.2.1无水乙醇。
5.2.2蒸馏水(应符合 GB/T 6682中一级水的规格)。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4660-2016
鹿种鉴定技术规范
Identification technology protocol for deer species2016-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-07-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口，SN/T4660-2016
本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中国农业科学院特产研究所、吉林农业大学、吉林省中韩动物科学研究院。本标准主要起草人，贾赞、栾慎顺、孙铭英、王全凯、张雪、宋大贺、王凯英、徐超、胡传伟、袁文泽。1范围
鹿种鉴定技术规范
本标准规定了梅花鹿，马鹿物种的PCR鉴定方法。本标准适用于梅花鹿、马鹿及其产品的物种鉴定。2规范性引用文件
SN/T4660-2016
下列文件对于本文件的应用是不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3方法原理
根据GenBank数据库中已公布的梅花鹿，马鹿的线粒体基因组序列，根据种内具有保守性、种间具有特异性的原则选择合适的区域，设计，合成3条引物，样本经过提取总基因组DNA后，利用设计的特异性引物，对梅花鹿，马鹿的目的基因进行PCR扩增，根据PCR扩增结果判定样品中是否含有梅花鹿马鹿的基因。
4形态特征
梅花鹿、马鹿形态特征参见附录A5PCR检测
5.1主要仪器设备
PCR仪、组织研磨器、超净工作台、制冰机、高速冷冻离心机、水浴锅、台式小型离心机、常规冰箱、旋涡振荡器，电泳仪、凝胶成像系统、微量可调移液器（10μL、100uL1000μL）及配套吸头。5.2试剂与材料
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T6682的规定。5.2.1无水乙醇。
5.2.2蒸馏水（应符合GB/T6682中一级水的规格）。5.2.3蛋白酶K（20mmol/μL）。5.2.410%十二烷基磺酸钠（SDS）。5.2.5十六烷基三乙基漠化铵（CTAB）。5.2.6氯化钠。
5.2.7三氯甲烷。
5.2.8异丙醇。
SN/T4660-2016
5.2.9Tris饱和酚。
5.2.1070%乙醇
5.2.11TE缓冲液。
TaqDNA聚合酶
32.5mmol/LdNTP。
5.2.1410倍缓冲液（Mg2+PLUS）。5.2.15
5琼脂糖、电泳缓冲液等（试剂配制见附录B）。5.2.16
5引物对如下：
DFP1：5-CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3（扩增梅花鹿、马鹿通用上游引物）DRP2：5-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3（扩增梅花鹿、马鹿通用下游引物）RDFP3：5-CATGTATAACAGTACATGAGTTAGCG-3（特异扩增马鹿上游引物）用双蒸水将引物稀释为20μmol/L工作浓度，一20℃保存备用。5.3检测方法
5.3.1样品的处理
5.3.1.1血液或精液样品：可直接使用200μL新鲜或冷藏、冷冻的均可。2动物组织、血凝块或毛发：100mg~200mg置于液氮中充分研磨，再将所研磨的材料取200μL5.3.1.2
放人1.5mL的离心管中。
5.3.2样品DNA的提取
注：可使用等效的商品化DNA提取试剂盒，按操作说明书进行操作，也可采用以下方法提取DNA5.3.2.1取血液/精液或在液氮下充分研磨的组织样品，加人50μL10%SDS/12.5μL蛋白酶K，充分混勾，65℃水浴加热10min。
2加100μL65℃预热的CTAB，上下颠倒混勾，65℃水浴加热20min。5.3.2.2
加人等体积的Tris-饱和酚，混匀。取上层水相于新管，加人等体积的酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）混勾，12000r/min室温高心5min。
取上层水相于新管，加人等体积的三氯甲烷混勾，12000r/min室温离心5min。5.3.2.5
取上层水相，加人1/10体积3mo1/L的醋酸钠，混匀，再加人2.5倍体积的无水乙醇，混匀，置于-20℃2h以上或过夜，12000r/min室温离心15min。弃上清，加人1mL预冷的70%的乙醇，12000r/min室温离心5min。5.3.2.7
吸弃残留液体，室温干燥10min左右.用50LTE缓冲液或ddH，O溶解，一20C保存备用5.3.2.8
PCR扩增检测
PCR反应体系组成
10×PCR缓冲液
dNTPs(2.5mmol/L)
DFP1或RDFP3(20pmol/μL）
DRP2(20pmol/μL)
样品DNA
ExTaqDNA聚合酶
灭菌水
总体积为50L体系，用漩涡混匀器进行混匀，瞬间离心，4℃备用。注：也可采用商品化试剂盒的PCR扩增体系。SN/T4660—2016
样品检测时，同时要设阳性对照和空白对照（阳性对照是已知的马鹿或梅花鹿组织提取的DNA，空白对照是ddHO)。
5.3.3.2PCR程序及反应条件
5.3.3.2.1DFP1/DRP2反应体系的条件：反应参数为：94℃5min；94℃变性30s，56℃退火30s，70C延伸30s，35个循环：然后72C延伸10min，最后4C保存。5.3.3.2.2RDFP3/DRP2反应体系的条件：94℃5min：94℃变性30s，62℃退火30s.72℃延伸30s，35个循环；然后72℃延伸10min，最后4℃保存。注：没有热盖PCR仪器需加人矿物油40μL。5.3.4PCR产物的电泳检测
用TAE电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶板（Goldview染料终浓度0.5μg/mL）。将平板放人水平电泳槽中，加入1XTAE电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面，将PCR扩增产物5μL和相应的上样缓冲液混合，分别加人样品孔中，电压80V~100V，电流40mA~50mA，电泳30min~45min。5.3.5凝胶成像系统观察
扩增产物经电泳结束后，用凝胶成像仪观察检测结果、拍照，记录试验结果。5.4结果判定
在经过琼脂糖凝胶电泳后，当两个阳性对照泳道孔分别出现一条307bp和246bp的清晰条带，阴性对照泳道孔不出现任何条带时，本检测试验才成立：根据DNA相对分子质量标准（DL600-Marker）来判断。
被测样品的两个泳道出现一条307bp的条带，未有246bp条带的，则初步判定为检出梅花鹿成分基因：
被测样品的两个泳道既出现307bp条带，又出现246bp条带的，则初步判定为检出马鹿成分基因；
被测样品的两个泳道均未出现条带的，则判定阴性（未检出梅花鹿和马鹿成分）。5.5确证实验
在PCR检测出现梅花鹿或马鹿阳性结果时，要对扩增产物进行测序分析，在测序部分和比对标准序列同源性达到95%以上时，才能判定为对应实验的阳性结果，进而确定为检出梅花鹿成分基因或马鹿基因成分，比对序列参考附录C。3
SN/T4660-2016
A.1梅花鹿形态特征概述
附录A
（资料性附录）
梅花鹿、马鹿形态特征概述
通过多年培育，梅花鹿体型变大，我国已成功培育出遗传稳定的敖东梅花鹿、四平梅花鹿，东丰梅花鹿、兴凯湖梅花鹿、双阳梅花鹿、西丰梅花鹿和长白山梅花鹿等梅花鹿种。梅花鹿的选育工作使产茸性能有了明显提高，并且还保持梅花鹿的优良特征。四平梅花鹿原产于吉林省四平市，是经过4个世代28年连续选育而形成的品种，比较高产。无肩峰，胸宽深：角柄端正，茸主干粗短，嘴头粗壮上冲，呈元宝形，夏毛以赤红色为主。上锯三权鲜茸平均单产3.25kg，鹿茸优质率85%。经产母鹿受胎率95%，繁殖成活率85%。敖东梅花鹿产于吉林省敖东地区。体型中等，体质结实：夏毛多呈褐色，成年公鹿体重约为135kg，成年母鹿体重约为80kg。平均鲜茸单产为3.34kg，成品茸为1.21kg。母鹿性成熟期为16个月龄。东丰梅花鹿是我国梅花鹿养殖业的重要发祥地。“东丰梅花鹿”1985年曾通过了农业部主持的品种鉴定，命名为“东丰型”梅花鹿。主要是利用当地梅花鹿类型，自1972年起经过5个世代的系统选育而成。夏毛呈棕黄色，花斑大小一致，无背线或背线不明显。上锯公鹿鲜茸平均单产为3.66kg。成年公鹿体重约128.8kg，成年母鹿体重约75.0kg，属梅花鹿中型品种。兴凯湖梅花鹿是在1952年前苏联送给中国国家领导人的乌苏里梅花鹿，引种115只（其中公鹿38只、母鹿77只）的基础上，经过多年风土驯化，4个世代系统选育而成。该品种驯化程度高，属森林湿地草原地区放牧型品种。夏毛呈棕红色，梅花斑点较大、靠背线两侧排列规整而清晰，上锯公鹿鲜茸平均单产为2.644kg。属梅花鹿中大型品种。双阳梅花鹿是在最早梅花鹿五个类型之一，1986年通过鉴定，上锯公鹿鲜茸平均单产3.0kg。西丰梅花鹿1995年通过鉴定，历经21年选育成功。上锯公鹿鲜茸平均单产3.205kg，母鹿的繁殖成活率74.56%
长白山梅花鹿1993年通过鉴定，历经18年选育成功，上锯公鹿鲜茸平均单产3.166kg，母鹿的繁殖成活率达81.37%。
2马鹿形态特征
中国是马鹿的原产地之一，马鹿因个体大，产首量高生长速度快出肉率高等优势而使其养殖数量和养殖规模不断提高。鹿茸以粗大、肥嫩、茸头饱满而著称。马鹿资源主要饲养于东北、西北和内蒙古，饲养数量大约30万只。我国人工培育的马鹿品种为清原马鹿，除此之外人工饲养的马鹿还有塔里木类型，天山类型，阿尔泰类型东北类型，甘肃类型和青海类型等。4
B.15XTris-硼酸（TBE）电泳缓冲液Tris
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
三蒸水定容至
充分溶解，4℃保存
酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）B.2
饱和酚（pH8.0）
异戊醇
使用前配制，4℃可保存两月。
30.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液
EDTA-Na*2HO
三蒸水
附录B
（规范性附录）
试剂的配制
1000ml
磁力搅拌器搅拌至完全溶解，1mol/LNaOH调节溶液pH至8.0三蒸水定容至bzxZ.net
1000ml
分装后，1.034×10°Pa，20min高压灭菌，备用。B.43mol/L乙酸钠（pH5.2）溶液三水乙酸钠
三蒸水
磁力搅拌器搅拌至完全溶解
冰乙酸调节pH至5.2
三蒸水定容至
1000mL
分装1.034×105Pa，20min高压灭菌，备用。SN/T4660—2016
SN/T4660—2016
附录C
（资料性附录）
梅花鹿、马鹿PCR鉴定方法涉及片段核苷酸序列C.1梅花鹿、马鹿扩增线粒体片段基因序列（307）CAAAGCACGTGATATAACCTTATGCCCGCCCCATCAAATATTTCATCCTGATGAAATTTCGGCTCCTTACTAGGAATTTGTCTAATCCTACAAATTCTCACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTATACATCTGACACAATAACAGCATTTTCCTCTGTCACCCATATCTGTCGAGATGTCAATTATGGTTGAATTATTCGATACATACACGCAAACGGGGCATCAATATTTTTCATCTGCCTATTCATACATGTAGGACGAGGCCTGTACTACGGATCATATATAGATCACGAGCTTAATTACCATG
2马鹿扩增线粒体片段基因序列（247）C.2
CATGTATAACAGTACATGAGTTAGCGTATTAGGACATACTATGTATAATAGTACATAAATTAATGTATTAAGACATATTATGTATAATAGTACATTATATTATATGCCCCATGCTTATAAGCATGTACTTTCCACTGTTTAAAGTACATAGTACACAATGTTGTTCATCGTACATAGCACATTAAGTCAAATCAGTCCTTGTCAACATGCGTATCCCGTCCCCTAGATCACGAGCTTAATTACCATG
SN/T4660-2016
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
鹿种鉴定技术规范
SN/T4660-2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010）68533533
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中国标准出版社秦皇岛印刷广印刷开本880X×12301/16印张0.75字数14千字2018年1月第一版 2018年1月第一次印刷印数1—500
书号：155066·2-32368定价16.00元199
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