SN/T 4675.4-2016.Determination of lactic acid in wine for export-Enzymatic method.
1范围
SN/T 4675.4规定了葡萄酒中D/L-乳酸含量的酶法测定方法。
SN/T 4675.4适用于葡萄酒中D/L-乳酸含量的测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3方法提要
首先将试样加水稀释,然后往比色皿依次加人缓冲液、反应液、试验稀释液和酶液进行反应,采用分光光度计测定吸光度变化,利用吸光度差值定量。
在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)条件下,总乳酸(L-乳酸和D-乳酸)在L-乳酸脱氢酶(L-LDH)和D-乳酸脱氢(D-LDH)所催化的反应中被氧化成丙酮酸。通常,反应向有利于乳酸方向进行。从反应产物中除去丙酮酸可以使反应的平衡朝着生成丙酮酸的方向进行。
在L-谷氨酸存在时,在谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)催化反应中,丙酮酸转化成L-丙氨酸。
5仪器和设备
5.1 分光光度计(能在340 nm、334 nm和365 nm处进行检测)。
5.2 玻璃比色皿或一次性比色皿(光程为1 cm)。
5.3 超声波水浴。
5.4 水平振荡器。
5.5 分析天平(感量0.001 g)。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4675.4—2016
出口葡萄酒中乳酸的测定
Determination of lactic acid in wine for export-Enzymatic method2016-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-07-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
出口葡萄酒中乳酸的测定
SN/T4675.4—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010）68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
斤本880×12301/16
印张0.5
字数12千字
2017年11月第一版
反2017年11月第一次印刷
印数1-500
书号：1550662-32234
定价14.00元
SN/T4675《出口葡萄酒质量安全分析方法》共分为30个部分：SN/T4675.1
SN/T4675.2
SN/T4675.3
SN/T4675.4
SN/T4675.5
SN/T4675.6
SN/T4675.7
SN/T4675.8
SN/T4675.9
SN/T4675.10
SN/T 4675.11
SN/T 4675.12
SN/T 4675.13
SN/T4675.14
SN/T 4675.15
SN/T4675.16
SN/T 4675.17
SN/T4675.18
SN/T4675.19
SN/T 4675.20
SN/T4675.21
SN/T4675.22
SN/T4675.23
SN/T4675.24
SN/T4675.25
SN/T4675.26
SN/T 4675.27
SN/T 4675.28
出口葡萄酒中甘油的测定酶法：出口葡萄酒中2.3-丁二醇的测定气相色谱法；出口葡萄酒中乙醇稳定碳同位素比值的测定；出口葡萄酒中乳酸的测定酶法；出口葡萄酒中有机酸的测定离子色谱法；出口葡萄酒中葡萄糖、果糖和熊糖的测定；出口葡萄酒中乙醛的测定气相色谱-质谱法；出口葡萄酒中5-羟甲基糠醛的测定液相色谱法；出口葡葡酒中二甘醇的测定气相色谱-质谱法；SN/T4675.4-—2016
出口葡萄酒中赭曲霉毒素A的测定液相色谱-质谱/质谱法；出口葡萄酒中7种花色苷的测定超高效液相色谱法；出口葡萄酒中溶菌酶的测定液相色谱法；出口葡萄酒中2，4.6-三氯甲苯醚残留量的测定气相色谱质谱法出口葡萄酒中纳他霉素的测定液相色谱-质谱/质谱法；出口葡萄酒中水杨酸、脱氢乙酸和对氯苯甲酸的测定液相色谱法；出口葡萄酒中富马酸的测定液相色谱-质谱/质谱法：出口葡萄酒中丁基锡含量的测定气相色谱-质谱/质谱法：出口葡萄酒中二硫代氨基甲酸酯残留量的测定顶空气相色谱法；出口葡萄酒中钠、镁、钾、钙、铬、锰、铁、铜、锌、砷、硒、银、镉、铅的测定：出口葡萄酒中稀土元素的测定电感耦合等离子体质谱法；出口葡萄酒中可溶性无机盐的测定离子色谱法；出口葡萄酒中总二氧化硫的测定比色法；出口葡萄酒及葡萄汁中氨氨的测定连续流动分析仪法；出口葡葡酒福林-肖卡指数的测定分光光度计法；出口葡萄酒颜色的测定CIE1976(Lab）色空间法；出口葡萄酒浊度的测定散射光法；出口葡葡酒碱性灰分的测定；
出口葡萄酒细菌、霉菌及酵母的计数；SN/T4675.29出口葡萄酒中酒香酵母检验实时荧光PCR法：出口葡萄酒中拜氏接合酵母检验实时荧光PCR法。SN/T4675.30
本部分为SN/T4675的第4部分
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分等同采用国际葡萄与葡萄酒组织（OIV）的方法OIV-MA-AS313-07《乳酸》。本部分在技术内容上与该方法一致。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。I
SN/T4675.4—2016
本部分起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、拜发分析系统销售（北京)有限公司。本部分主要起草人：刘青、李志勇、宋阳、关丽军、刘朝霞、邵仕萍、刘董、曾静、廖冰君、郑璇-YYKAONIKAca
1范围
出口葡萄酒中乳酸的测定
SN/T4675的本部分规定了葡萄酒中D/L-乳酸含量的酶法测定方法。本部分适用于葡萄酒中D/L-乳酸含量的测定。2规范性引用文件
SN/T4675.4—2016
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法方法提要
首先将试样加水稀释，然后往比色Ⅲ依次加入缓冲液、反应液，试验稀释液和酶液进行反应，采用分光光度计测定吸光度变化，利用吸光度差值定量。在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）条件下，总乳酸（L乳酸和D乳酸）在L乳酸脱氢酶（L-LDH）和D乳酸脱氢（DLDH)所催化的反应中被氧化成丙酮酸。通常，反应向有利于乳酸方向进行。从反应产物中除去内酮酸可以使反应的平衡朝着生成内酮酸的方向进行。在L-谷氨酸存在时,在谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)催化反应中，丙酮酸转化成L-丙氨酸。反应（1）：L-乳酸+NAD+
一丙酮酸+NADH+H
反应（2）：D-乳酸+NAD+
内酮酸十NADH+H
反应（3)：丙酮酸+L-谷氨酸=L-丙氨酸+α-酮戊二酸反应生成的NADH量，通过测定在波长34Onm处吸光度的增加而得到，NADH量与乳酸的原始数量成正比。
注：通过反应（1）和反应（3）可以单独测定L-乳酸含量，通过反应（2）和反应（3）可以单独测定D-乳酸含量。4试剂和材料此内容来自标准下载网
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水采用GB/T6682规定的一级水。4.1氢氧化钠(NaOH)。
4.2甘氨酰甘氨酸（C,H.N2O.）。4.3谷氨酸（CH,NO）。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）。4.5谷丙转氨酶（GPT)。
4.6L乳酸脱氢酶(L-LDH)。
D乳酸脱氢酶（DLDH)
10mol/L氢氧化钠溶液：准确称取40.0g氢氧化钠，用水溶解，定容至100mL后，转移至塑料瓶4.8
KAoNiKAca
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中保存。
4.9缓冲溶液[0.6mol/L甘氨酰甘氨酸，c（Mg+）=10-3mol/L，pH=10]:准确称取4.75g甘氨酰甘氨酸和0.88gL-谷氨酸溶于约50mL水中，用少量10mol/L氢氧化钠溶液（4.8）将pH值调至10，再加水定容至60mL。
4.10反应液c(NAD)=40×10-3mol/L]：准确称取900mgNAD溶于30mL双蒸水中。4.11谷丙转氨酶悬浮液[c（GPT)=20g/I]：准确称取2001mg谷丙转氨酶，加水溶解，定容至10mL。使用不经稀释的悬浮液。
4.12L-乳酸脱氢酶悬浮液[c（L-LDH）=5mg/mL]：准确称取50mgI-乳酸脱氢酶，加水溶解，定容至10ml
4.13D乳酸脱氢酶悬浮液[c(D-LDH)=5mg/mll：准确称取50mgD-乳酸脱氢酶，加水溶解，定容至10mL
仪器和设备
5.1分光光度计（能在340nm334nm和365nm处进行检测）5.2玻璃比色血或一次性比色血（光程为1cm）5.3超声波水浴。
5.4水平振荡器。
分析天平（感量0.001g）。
6测定步骤
样品前处理
葡萄酒中乳酸定量，通常可对未预先脱色的葡萄酒直接进行测定（起泡酒需预先脱气：将100ml试样倒人带排气塞的瓶中，在室温下使用水平振荡器或超声水浴脱气，直至无气泡逸出）。如果乳酸浓度低于100mg/L，则不需要进
生行稀释
如果乳酸浓度高于100mg/L，则按以下方式进行稀释：100mg/L~1g/L，用水按1/10进行稀释1g/L~2.5g/L，用水按1/25进行稀释；2.5g/L~5g/L，用水按1/50进行稀释6.2测定
总乳酸定量
在波长340nm，光程1cm的比色皿中进行吸光度测定，用水做空白对照。在光程1cm的对照比色血中和样品比色血依次按表1分别加人试剂：表1
缓冲溶液（4.9）
反应液（4.10）
3样品液
5酶思浮液（4.11)
试剂加入顺序表
对照血
样品血
单位为学升
TIKAONKAca
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将上述溶液混勾，约5min后，读取对照溶液和测试样品溶液的吸光度Ar。然后分别加入0.02mlL-乳酸脱氢酶悬浮液（4.12）和0.05mLD乳酸脱氢酶悬浮液（4.13），混匀后，等待反应进行完毕（约30min)后，读取对照溶液和测试样品溶液的吸光度A。算出对照溶液和测试溶液各自的吸光度之差（A：一A,)，△AR和△As：最后，用测试溶液吸光度差值减去对照溶液吸光度差值：A一△A一△AR。进行测定前应注意：避免手指与盛装反应介质的玻璃器血相接触，因为这可能带人L-乳酸，从而使结果产生误差。在进行定量测定前，应使缓冲溶液的温度在20℃～25℃之间。6.2.2L-乳酸和D-乳酸的定量测定L-乳酸和D乳酸的定量测定可以根据总乳酸的操作方法分别求出，在求出A1之后分别进行：加入0.02ml.L-乳酸脱氢酶悬浮液（4.12），使其混勾，等待反应完全（约20min），读取对照溶液和测试溶液的吸光度（A.)。
加入0.05mLD乳酸脱氢酶悬浮液（4.13），使其混勾，等待反应完全（约30min），测量对照溶液和测试溶液的吸光度（A：）。
算出对照和测试两种情况的L-乳酸的吸光度之差（A一A，）和D乳酸的吸光度之差（A：一A2）。最后，用测试溶液吸光度差值减去对照溶液吸光度差值：A=△A一△AR注：酶作用所需的时间彼被此间可能有很大差别。所以上述算法只能说是一般指导性的。建议按每一批进行测定。如果只需作L-乳酸定量，在加人L-乳酸脱氢酶之后的反应时间可减少至10min。7结果计算和表述
7.1试样中乳酸的含量按式（1)计算获得，计算结果需扣除空白值，并保留至小数点后两位：式中：
X-2xXX10..
试样中乳酸含量，单位为克每升（g/L)：试验中所用液体的总体积，单位为毫升（mL）（L-乳酸，V=2.24mL；D-乳酸和总乳酸，V=2.29mL）；待定量物质的相对分子质量（DL乳酸，M=90.08）；比色血光程，单位为厘米（cm）（d=1cm）；试样体积，单位为毫升（mL）（0.2mL）；两次测定吸光度差值；
NADH在波长340nm处的吸收系数，（e=6.3mmol-1·L·cm-1）：代人上述参数最终得出简化式（2)和式(3）：7.2试样中总乳酸和D-乳酸：
X=0.164×△A×F（F为稀释倍数）其中：
在波长334nm处测量时，X=0.167×△A×F，（e=6.2mmol-1·L·cm-1）。在波长365nm处测量时，X-0.303X△AXF，（e-3.4mmol-1：Lcm-1）。7.3试样中L-乳酸：
X=0.160X△A×F（F为稀释倍数）其中：
在波长334nm处测量：X=0.163×△A×F，（c=6.2mmol-1.L·cm-）。·（1)
·（2)
（3）
TTKAONKAca
SN/T 4675.4—2016
在波长365nm处测量：X=0.297×△A×F，（e-3.4mmol-1.L.cm-）。8
测定范围
本方法的测定范围为30mg/L300mg/L。9
精密度
精密度两次独立测定绝对值差值不能超过数学平均值的8.0%。SN/T4675.4-2016
书号：155066·2-32234
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