SN/T 1197-2016.Detection of genetically modified ingredients in oilseed rape-Conventional and real-time PCR methods.
1范围
SN/T 1197规定了油菜及其加工产品中转基因成分筛选、基因特异性和品系特异性普通PCR和实时荧光PCR检测方法。
SN/T 1197适用于油菜及其加工产品中转基因成分筛选、基因特异性和品系特异性定性检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.2转基因产品检测 实验室技术要求
GB/T 27403实验室 质量控制规范食 品分子生物学检测
SN/T 1194植物及其产 品转基因成分检测抽样和制样 方法
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1转基因transgene
将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列,通过生物工程技术，使其在该物种中进行表达，以便使该物种获得新的品种特征。
3.1.2实时荧光PCRreal-time polymerase chain reaction
实时荧光聚合酶链式反应。是指在聚合酶链式反应体系中加人荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,荧光信号的强弱直接反映模板数量。
3.1.3内源基因endogenous gene
在检测物种中拷贝数恒定的.不显示等位基因变化的基因。该基因可用于判定物种特异性。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1197—2016
代替SN/T1197-2003
油菜中转基因成分检测
普通PCR和实时荧光PCR方法
Detection of genetically modified ingredients in oilseed rape-Conventional andreal-timePCR methods2016-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-07-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准替代SN/T1197—2003《油菜籽中转基因成分定性PCR检测方法》。本标准与SN/T1197一2003相比，主要技术性差异如下：修改了标准的中文名称和英文名称；增加了实时荧光PCR检测方法；
增加了品系特异性检测方法。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准主要起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：潘良文、李想、吕蓉、杨捷琳、刘月明、高琴。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1197-—2003。
SN/T1197—2016
1范围
油菜中转基因成分检测
普通PCR和实时荧光PCR方法
SN/T 1197—2016
本标准规定了油菜及其加工产品中转基因成分筛选、基因特异性和品系特异性普通PCR和实时荧光PCR检测方法。
本标准适用于油菜及其加工产品中转基因成分筛选、基因特异性和品系特异性定性检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T27403实验空质量控制规范食品分子生物学检测植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法SN/T1194
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
转基因transgene
将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过生物工程技术，使其在该物种中进行表达，以使使该物种获得新的品种特征3.1.2
实时荧光PCR
real-timepolymerasechainreaction实时荧光聚合酶链式反应。是指在聚合酶链式反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，荧光信号的强弱直接反映模板数量3.1.3
内源基因endogenousgene
在检测物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因。该基因可用于判定物种特异性。3.1.4
外源基因
exogenousgene
利用生物工程技术转人的其他生物基因，使该生物品种表现新的生物学性状，3.1.5
Ct值cyclethreshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。SN/T1197—2016
3.2缩略语
BAR：草丁（铵）麟乙酰转移酶基因（phosphinothricinacetyltransferasegene）BARNASE：ribonucleasegenefromBacillusamyloliquefaciens，米源于解淀粉芽孢杆菌的核糖核酸酶基因
BARSTAR：specificinhibitorofthebarnasegenefromBacillusamyloliquefaciens，来源于解淀粉芽孢杆菌的BARNASE基因的特兄抑制基因bp：basepair，碱基对
BXN：nitrilaseenzymegenefromKlebsiellapneumoniaesuhsp.Ozaenae，来源于肺炎克雷伯杆菌臭鼻亚种的晴水解酶基因
CP4-EPSPS：5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthasegene.5葬草酸-3-磷酸合成酶基因CruA：CruciferinAgene，油菜种子储藏蛋白基因CTAB：cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基漠化铵dATP：deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸dCTP：deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸dGTP：deoxyguanosinetriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸dNTP：deoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核苷三磷酸dUTP：deoxyuridinetriphosphate，脱氧尿苷三磷酸EDTA：ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸GOX：glyphosateoxidoreductasegene，草廿麟氧化还原酶基因HMGI/Y：Highmobilitygroupproteingene，高移动性蛋白家族基因NPTII：neomycin-3'-phosphotransferasegene，新霉素-3°-磷酸转移酶基因PAT：phosphinothricinacetyltransferasegenefromBacillusamyloliquefaciens，来源于解淀粉芽孢杆菌的草丁麟乙酰转移酶基因PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应PEP：phosphoenolpyruvatecarboxylasegene，磷酸烯醇式内酮酸羧化酶基因SDS：sodiumdodecylsulfate，十二烷基磺酸钠pCaMV35S：35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus，花椰菜花叶病毒35S启动子pFMV35S:35Spromoterfromamodifiedfigwortmosaicvirus，玄参花叶病毒35S启动子pNOS：promoterofnopalinesynthasegenefromAgrobacteriumtumefaciens来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子
pTA29:developmentally regulated promoter from anther-specific TA2g gene from Nicotiandtabucum，来源于烟草的花蕊特异性TA29基因的发育调节启动了Taq：TaqDNApolymerase,DNA聚合酶TE：Tris-HCI、EDTA缓冲液
tNOS：terminatorofnopalinesynthascgcnefromAgrobacteriumtumefaciens，来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子
Tris：tris（hydroxymethyl)aminomethanc，三（羟甲基）氨基甲烷UDG：uracilDNAglycosylasc，尿嘧啶DNA-糖基酶UNG酶：uracil-N-glycosylase，尿嘧啶-N-糖基化酶2
-KAONIKAca
4方法提要
SN/T1197—2016
提取样品DNA后，通过普通PCR或实时荧光PCR技术对样品DNA进行筛选基因或结构基因特异性片段扩增，根据PCR扩增结果电泳图或实时荧光扩增曲线，判断该样品中是否含有转基因成分。对外源基因检测阳性的样品，或已知为转基因阳性的样品，如需进一步进行品系筛查和确证，则采用品系特异性普通PCR或实时荧光PCR，特异性扩增上述品系特异性片段，根据PCR扩增结果（电泳图或实时荧光扩增曲线），判定该样品中含有娜（些)种转基因油菜品系成分。5仪器设备
5.1实时荧光PCR仪。
5.2普通PCR仪。
样品粉碎仪或研磨机。
天平：感量0.01g。
5水浴锅或恒温孵育器。
6冷冻离心机。
高压灭菌锅。
涡旋振荡器。
生物安全柜。
5.10pH计。
核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计微量移液器（2μ、10μL、100μL.200μL、1000μ）6
试剂和材料
除特别说明外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。样品DNA提取纯化试剂
6.1.11mol/LTris，HCl,pH8.0：称取121.1gTris，溶于800mL水中，搅拌，加人浓盐酸42mL，冷却至室温，用稀盐酸准确调整pHI至8.0，分装后高压灭菌备用。6.1.20.5mol/LNa-EDTA·2H,O.pH8.0：在800mLH,O中加人186.1gNa-EDTA·2H,O.在磁力搅拌器剧烈搅拌，用NaOH调节溶液pH值至8.0（约需20gNaOH颗粒），然后定容至1L分装后高压灭菌备用。
6.1.3DNA抽提缓冲液：量取100mL1mol/LTris·HCl，50mL0.5mol/LNaz-EDTA·2HzO.称取5.0gSDS，16.848gNaCl.定容至1L，分装后高压灭菌备用。6.1.4Tris饱和酚
6.1.5氯仿
6.1.6异丙醇
6.1.770%乙醇
6.1.8TE缓冲液：量取10mL1mol/LTris·HCI和2mL0.5mol/LNaz-EDTA·2H,O加水定容至1L，分装后高压火菌备用。
6.1.9蛋白酶K（20mg/mL)
-iiKAoNiKAca
SN/T1197—2016
6.1.10RNaseA(100mg/mL)
6.2普通PCR反应试剂
10XPCR缓冲液：含500mmol/LKCl.100mmol/LTris·HCl(pH8.3)，15mmol/LMgCl0.1%明胶。
6.2.210×MgClz:25mmol/L。
6.2.310XdNTP：含2.5mmol/LdATP,dUTP,dCTP,dGTP6.2.4Tag酶：5U/μL。
6.2.5超纯水：无菌、无DNA酶和RNA酶污染的双蒸水。6.2.6引物：根据附录A中的表A.1的序PCR护增的引物浓度为10umol/L。6.2.7浪化乙锭：10mg/ml.。
6.2.8DNA分子量标记100bp~2000bp。6.2.9琼脂糖。
台成物车
水配制成100μmol/L储备液，用于6.2.1050XTAE缓冲液：称取484gTris，量取114.2mL冰醋酸，200mL0.5mol/LNa2-EDTA2H，0，溶于蒸馏水中，定容至2L。分装后高压灭菌备用。6.2.1110×上样缓冲液：含0.25%溴酚蓝.0.25%二甲米青FF6.3实时荧光PCR反应试剂
6.3.1实时荧光PCR预混液：TagDNA聚合甘油水溶液、
PCR反应缓冲液，MgCl（3mM~7mM）dNTPs（含dATP，dUTP，dCTP，dGTP）和UNG酶按比倒配制的溶液6.3.2ROX荧光校正试剂（50X）。6.3.3引物和探针：根据附录A中的表A.2的序列合成引物和探针，加超纯水配制成100umol/L储备液，用于实时荧光PCR扩增的引物和探针浓度为10mol/I7检测步骤
7.1取样
按照SN/T1194中规定的方法执行7.2实验室环境要求
按GB/T19495.2规定的方法执行。7.3制样
制样按SN/T1194中规定的方法执行。在制样过程中，应采取有效措施防控制样器具和接触台面等对样品的污染。
对经过制样的油菜籽或颗粒状油菜来源加工制品，称取约30g~40g代表性样品，经粉碎仪或研磨机进行碾磨至样品粉末颗粒约0.2mm~0.3mm左右大小。对粉末状油菜来源制品，可直接进行DNA提取。
7.4样品DNA的提取与纯化
称取约200mg粉末状样品转人2.0mL离心管中，每个样品设置2管取样平行7.4.1
-TTKAONIKAca
SN/T1197—2016
7.4.2加入100μLDNA抽提缓冲液，混匀，注意不要使样品结块，再加人900μLDNA抽提缓冲液，震荡30s后，反复颠倒混合5min。
7.4.310000Xg离心5min，取上清700μL，加入5μLRNaseA（2mg/mL）.37℃保温30min。7.4.4加人等体积的Tris饱和酚，上下反复颠倒混匀共10min。7.4.510000×g离心5min，取上清液600μL，加人等体积的氯仿，上下反复颠倒混匀共5min，7.4.610000Xg离心5min，取上清液500μL，加人等体积的异丙醇，轻轻混合3min。7.4.710000×g离心10min，此时管底有白色沉淀。7.4.8去上清，加人70%乙醇1mL清洗1次～3次。倒去70%乙醇，短暂离心，用吸管尽可能除去乙醇洗液。低温冷冻干燥约2min，加50uLTE7.4.9
缓冲液（pH8.0），溶解DNA沉淀。注：也可按照GB/T19495.3的方法或采用具有相同效果的植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。7.5DNA浓度测定和定量
取5uL～10uL样品DNA溶液加双蒸水稀释至50uL，使用紫外分光光度计分别测定260nm和280nm处的吸光值，并记录ODs/ODz8比值以及样品DNA浓度值，OD26/OD2gc的比值在1.7~2.1之间时，适于PCR扩增。
7.6普通PCR检测
7.6.1PCR反应体系
普通PCR反应体系见表1.。
10XPCR缓冲液
dNTP（含dUTP）
Taa酶
UNG酶
上游引物
下游引物
模板DNA
超纯水
储液液度bzxZ.net
25mmol/1
2.5mmol/l
10μmol/L
10 μmol/L
通PCR反应体系
终浓度
0.008U/μL
400nmol/L
400nmol/L
20ng50ng
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整使用量/μL
补足至25
以对应的转基因油菜品系或含有相应外源基因的转基因油菜DNA作为阳性对照，非转基因油菜样品作为阴性对照，以加入超纯水作为空白对照进行PCR扩增。7.6.2PCR反应循环参数
PCR反应循环参数为：95℃/5min；94℃/20s，引物的退火温度（见表A.1)/40s，72℃/40s，40个循环；72℃/3min。PCR反应循环参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当调整。5
-rKAoNiKAca
SN/T1197—2016
7.6.3PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测将适量50XTAE稀释成1XTAE溶液，配制溴化乙锭（或其他具有相同效果的荧光染料）含量为0.5μg/ml的2.0%琼脂糖凝胶。
取15uLPCR产物，加1.5μL10×上样缓冲液点样行电泳，并加DNA分子量标记点样以判断PCR产物的片段大小。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在3V/cm～5V/cm长度，电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定，电泳检测结果用凝胶分析成像系统记录7.7
实时荧光PCR检测
7.7.1实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系配制见表2。每个样品设置2个平行重复。表2实时荧光PCR检测体系
10XPCR缓冲液
dNTP(含dUTP)
UNG酶
上游引物
下游引物
Tag醇
DNA模板
超纯水
储液浓度
25mmol/L
2.5mmol/L
10μmol/L
10μmol/L
10μmol/L
终浓度
2.5mmol/1.
0.2mmol/l
0.075U/μL
400nmol/L
400nmol/L
200nmol/L
0.05U/μL
20ng~50ng
使用量/uL
补足至25μL
可选用含有PCR缓冲液、MgClz、dNTP和Taq酶等成分的基于Tagman探针的实时荧光PCR预混液注：1）
进行实时荧光PCR扩增
ROX荧光试剂仪在具有ROX校正通道的实时荧光PCR仪上进行扩增时添加，否则用超纯水补足。2）
3）反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。7.7.2实时荧光PCR反应程序
两步法实时荧光PCR反应参数为：50℃/2min；95℃/10min；95℃/15s，60℃/60s，45个循环三步法实时荧光PCR反应参数为：50℃/2min；95℃/10min：95℃/5s.50℃/5s，60℃/20s，45个循环。
注：以上参数可根据不同型号实时荧光PCR仪和所选PCR扩增体系不同作适当调整。7.7.3仪器检测通道的选择
设置PCR反应管荧光信号收集条件，应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪器使用说明书。
KAONiKAca
7.7.4实验对照的设立
每个样品应有2个平行实验，同时每次检测应设立3个对照：SN/T1197—2016
阳性对照，为对应的转基因油菜品系或含有相应外源基因的转基因油菜基因组DNA，或含有上述片段的质粒标准分子DNA；
阴性对照，非转基因油菜样品DNA；空白对照（不含DNA模板）。
8质量控制
PCR检测的所有对照应满足以下条件，如有任何一条不满足时，实验应视为无效：a）空白对照和空白提取对照：普通PCR扩增中无目的条带，实时荧光PCR扩增中无荧光对数增长，相应的Ct值≥40.0
阴性对照：用外源基因和品系特异性检测体系扩增，普通PCR扩增中无目的条带，实时荧光b）
PCR扩增中无荧光对数增长，相应的Ct值≥40.0阳性对照：普通PCR扩增中有较亮的目的条带，实时荧光PCR扩增中有荧光对数增长，且荧c
光通道出现典型的扩增曲线。
9结果判定及表述
9.1结果判定
9.1.1普通PCR扩增结果判定
用油菜内源基因扩增体系对提取的DNA溶液进行PCR测试，在符合第8章所述的情况下，如在普通PCR扩增中未见有明亮的日的条带，则说明在DNA提取过程中未提取到可进行PCR测试的DNA，或DNA提取液中有抑制PCR反应的物质存在，应量新提取DNA：对油菜及其来源样品中转基因成分的检测，可参考附录B的内容进行筛选检测或品系特异性检测。
在符合第8章所述的情况下，对被检样品进行检测时：测试样品出现预期大小的扩增条带（扩增片段大小见表A.1），则可初步判断含有该外源基因或品系，可进步做实时荧光PCR或序列测定等确证实验，然后依据确证实验结果最终报告如果测试样品中未出现PCR扩增产物，则可判定测试样品中不含有该外源基因或品系。9.1.2实时荧光PCR结果判定
对油菜及其来源样品中转基因成分的检测，可参考附录B的内容进行筛选检测或品系特异性检测。
在符合第8章所述的情况下，对被检样品进行检测时：检测的外源基因或品系Ct值≥40，内源基因出现正常扩增，则可判定该样品不含所检外源基a)
因或品系。
检测的外源基因或品系Ct值35，内源基因出现正常扩增，则可判定该样品含有所检外源基b)
因或品系。
检测的外源基因或品系Ct值在35~40之间，应调整模板浓度，应重新进行实时荧光PCR扩c）
增。如再次扩增后外源基因或品系Ct值仍为40.0，则可判定为该样品含有所检基因或品7
SN/T1197—2016
系；如再次扩增后Ct值≥40.0，则可判定为该样品不含所检外源基因或品系。结果表述
结果为阳性的，表述为“检出×××外源基因或×××转基因品系”；结果为阴性的，表述为“末检出X×义外源基因或×X×转基因品系”10
防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照11
最低检出限
中的规定执行。
各基因片段的普通PCR和实时荧光PCR扩增的最低检出限分别见附录A表A.1和表A.2。S
附录A
（规范性附录）
SN/T1197—2016
油菜中转基因成分筛选、基因和品系特异性普通PCR和实时荧光PCR方法油转基因成分检测普通PCR检测引物见表A.1。表A.1油菜转基因成分检测普通PCR检测引物扩增片段
基因/品系名称
pCaMV35S
pFMV35s
CP4-EPSPS
(Modified)
BARNASE
BARSTAR
RT73(GT73）品系
MS8品系
引物序列
5'gctagtgtagaccagltcttg-3
5'-cactcttgtctcttgtcetc
5'-getcctacaaatgccatca-3
5'-gatagtgggattgtgcgtca-3
5-taaggtgggtggctggacta-3
5'-acttgcaccacaagggcata-
5'-agcctcaacaaggtcag
5'ctgctcgatgttgacaag
5'tgagactctaattggataccgagg
5'-tttggaactgacagaaccgcaac-35'-gcatgacgttatttatgagetggg
5'-gacaccgcgcgcgataatttat
5'-ctcaccttgctcctgccgag
5'-cgcclgagcciggcgaa
5'-etctgtttcgtcgtttc
gagtar3
5'-gaaacccatccacttgg
5'gacttgcgtgttcgute
5'-aacaccgttgagcttgagac3
5'-accatcgtcaaccactacata
5'-gctgccagaaacccacgtcat-
5'-gtcgacatgtetccggagag-3
5'-gcaaccaaccaagggtatc-3
5'-ggggttgcggattatcttc-3
5' ccgttgtttgtaaatcagce-3
5'-cagaagtatcagcgacctcc-3\
5'-tccattccaaaacgagcgggta-3\5'-acttcaaagcagccgctett-3
5'-cacccgaaccaacgctaagtt-3'
5'-aataacgctgcggacateta 3
5'-cagcaagattctctgtcaacaa-3
5cctttcttatcgaccatgtacte-3
5'aartttaasaacttgtgggalgct-3248
退火温度
内源基因
筛选检测
筛选检测
筛选检测
帝选检测
筛选检测
暗选检测
抗草士
膦油菜
抗草+
甘麟油菜
抗草丁及雄性
不育油菜
抗草丁麟油菜，
选择其
抗草丁胖及雄性
不育油菜
抗草丁膦及雄性
不育油菜
抗溴苯睛除草
剂油菜
RT73(GT73)品系
MS8品系
检测下限
（质量分数）
SN/T 1197—2016
基因/晶系名称
MS1品系
RFI品系
RF2品系
RF3品系
Oxy235品系
T45（HCN28）品系
Topas19/2
（HCN92）品系
引物序列
表A.1（续）
扩增片段
5'-cggtgagtaatattgtacggctaa-35-atetctggttaaacattccatctttg-35'cctgtggtctcaagatggatca-3
5'-ggtgactacacgcgactcat-3
5'-ttggtggacccttgagguaac-3
5'-ccatctatagggtgagacaat-3
5'-caataactttgttgggcttatgg-35'-ctcgtctcggacctccgaaaacc-35'-tttgtttattgetttcgcc3
5'ccaggggattcagttgga-3\
5'-tcccatttatttacggtcac-3
5'-ccalgggaattcatttacaa-3
5'-cggccrtaatcccaccccag-3
5-agttccaaacgtaaaacggctt-3
退火温度
油菜转基因成分检测实时荧光PCR检测引物和探针见衣A.2。表A.2
基因/品系名称
MS1品系
RFI品系
RF2品系
RF3品系
Oxy235品系
T45（HCN28）品系
Topas19/2
（HCN92）品系
油菜转基因成分检测实时荧光PCR检测引物和探针探针序列
引物序列
pCaMV35s
pFMV35S
CP4-EPSPS
(Modified)
5'-cccttgtgaagctcgacatc-3*
5'-ctgtcctctgaccattetgt3
5'-gcctctgccgacagtggt-3
5'-aagacgtggttggaacgtctte-3
5'-caaataacgiggaaaagagct-3
5'-tctttgtggtcgtcactgc-3
5-atcgttcaaacattggca-3
5'-attgcgggactctaatcata-3*
5'-aggatcteglcgtgacccat-3\
5'-gcacgaggaagcggtca-3\
5'-acaagcacggtcaacttcc-3
5-actcggccgtccagtegta-3
5'-gtcgucatgtetccggagag3\
5'-gcaaccaaccaagggtatc-3\
5'-gtcttcgtgttgctggaaccgtt-3\5'-gaactggcaggagcgagagct-3
5'-gcaaatcctctggcctttcc-3'
5'-cttgcccgtattgatgacgtc-3
5'-ccgaccgtcacaccgatgtulaga35'caangatggaccccacceacg-3\
5'-ctgacagccactcactaatgc-3'
5*-catcgcaagaccggcaacagg-3\5'-cacccagceggccacagtcgat-3
5'-ccgagccgcaggaaccgcaggag-35'-iggcegcggttgtgateregltaa-35'-tgctcacgtttctacactcgcgcteg-35'-ttcatgttcggcggtctcgcg-3*
扩增片段
油菜内源
筛选检测
筛选检测
筛选检测
筛选检测
筛选检测
筛选检测
筛选检测
筛选检测
检测下限
（质量分数）
检测下限
（质量分数）
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