SN/T 2055-2016
基本信息
标准号： SN/T 2055-2016
中文名称：豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：4273308
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 2055-2016.Detection and identification of Cowpea severe mosaic virus.
1范围
SN/T 2055规定了植物检疫中豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法。
SN/T 2055适用于豆科繁殖材料(种子、植株)中豇豆重花叶病毒的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3基本信息
学名:Cowpea severe mosaic virus
缩写:CPSMV
分类地位:伴生豇豆病毒科(Secoviridae),豇豆花叶病毒亚科(Comovirinae),豇豆花叶病毒属(Comovirus)。
该病毒的其他信息参见附录A。
4方法原理
根据豇豆重花叶病毒与抗体之间的特异性反应,对植物样品进行ELISA检测:根据该病毒核酸的序列进行PCR特异性检测,通过电泳条带大小进行结果判定;根据该病毒核酸序列设计特异性引物和荧光探针,通过检测的荧光信号进行结果判定。
5仪器设备及试剂
5.1仪器设备
酶标仪、天平(感量,1/10000 g)、pH计、微量榨汁机、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离温室、恒温水浴、低温冰箱等。
微量移液器(2 μL,10 μL,20 μL,100μL,200μL,1000 μL)酶联板、研钵、离心管花盆、消毒土等。
5.2 试剂
酶联免疫吸附测定试剂见附录B的B.1、RT-PCR检测试剂见附录C的C.1.实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D的D.1。
试验用水应符合GB/T 6682要求。
1范围
SN/T 2055规定了植物检疫中豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法。
SN/T 2055适用于豆科繁殖材料(种子、植株)中豇豆重花叶病毒的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3基本信息
学名:Cowpea severe mosaic virus
缩写:CPSMV
分类地位:伴生豇豆病毒科(Secoviridae),豇豆花叶病毒亚科(Comovirinae),豇豆花叶病毒属(Comovirus)。
该病毒的其他信息参见附录A。
4方法原理
根据豇豆重花叶病毒与抗体之间的特异性反应,对植物样品进行ELISA检测:根据该病毒核酸的序列进行PCR特异性检测,通过电泳条带大小进行结果判定;根据该病毒核酸序列设计特异性引物和荧光探针,通过检测的荧光信号进行结果判定。
5仪器设备及试剂
5.1仪器设备
酶标仪、天平(感量,1/10000 g)、pH计、微量榨汁机、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离温室、恒温水浴、低温冰箱等。
微量移液器(2 μL,10 μL,20 μL,100μL,200μL,1000 μL)酶联板、研钵、离心管花盆、消毒土等。
5.2 试剂
酶联免疫吸附测定试剂见附录B的B.1、RT-PCR检测试剂见附录C的C.1.实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D的D.1。
试验用水应符合GB/T 6682要求。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2055—2016
代替SN/T2055-2008
豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of Cowpea severe mosaic virus2016-08-23发布
中华人民共和国
甜涂品意真历
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T2055—2016
本标准代替SN/T2055—2008《虹豆重花叶病毒检疫鉴定方法》，与SN/T2055—2008相比，主要变化如下：
增加了常规RT-PCR检测方法；
增加了实时荧光RT-PCR检测方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局，本标准主要起草人：李桂芬、孔君、李彬、马洁、陈青、魏梅生、张永江。本标准所代替标准的历次发布情况为：SN/T2055-2008
1范围
豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法
本标准规定了植物检疫中豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法。本标准适用于豆科繁殖材料（种子、植株）中豇豆重花叶病毒的检疫鉴定。2规范性引用文件
SN/T2055—2016
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3基本信息
学名：Cowpea severemosaicvirus缩写：CPSMV
分类地位：伴生豇豆病毒科（Secoviridae），豇豆花叶病毒亚科（Comovirinae），紅豆花叶病毒属(Comovirus)。
该病毒的其他信息参见附录A。
4方法原理
根据虹豆重花叶病毒与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行EI.ISA检测：根据该病毒核酸的序列进行PCR特异性检测，通过电泳条带大小进行结果判定；根据该病毒核酸序列设计特异性引物和荧光探针，通过检测的荧光信号进行结果判定。5仪器设备及试剂
仪器设备
酶标仪、天平（感量，1/10000g）、pH计、微量榨汁机、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离温室、恒温水浴、低温冰箱等。微量移液器（2μL，10μL，20L，100μL200μL，1000μL）、酶联板、研钵、离心管、花盆、消毒土等。5.2试剂
酶联免疫吸附测定试剂见附录B的B.1、RT-PCR检测试剂见附录C的C.1、实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D的D.1。
试验用水应符合GB/T6682要求
6样品制备
6.1种子
挑取畸形、不成熟种子及随机挑选的种子播于灭菌土中，待长出幼叶后，将表现症状的植株单独编1
SN/T2055—2016
号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。采集的叶片分成2份，根据需要分别用于酶联测定和分子检测
6.2植株
有症状（如叶片畸形、花叶、斑驳等）的植株编号单独检测。没有症状的分组并编号检测，分组方法和检测方法同6.1。
7检测方法
7.1酶联免疫吸附测定
见附录B。
7.2RT-PCR检测方法
见附录C。
实时荧光RT-PCR检测方法
见附录D。
生物学测定
见附录E。
8结果判定
样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行先用DAS-ELISA方法进行检测。
若DAS-ELISA结果为阴性
PCR的检测结果为阴性
则判定样品不携带CPSMV：检测结果时.RT
为CPSMV序列.则判定样品携带CPSMV：或用实时荧光RT为阳性，则对产物进行测序，测定的序列PCR进行检测，若检测结果为阴性，则判定样品不携带CPSMV：若检测结果为阳性，则判定样品携带CPSMV
若DAS-ELISA结果为阳性时.RTPCR检测或实时荧光RTPCR检测为阳性，即可判定待检样品携带CPSMV。
9样品保存与结果记录
9.1样品保存
经检测确定携带豇豆重花叶病毒的样品应在合适的条件下保存，种子在室温干燥保存1年；植株一80℃保存1年，做好标记和登记工作。9.2结果记录
完整的记录包括：样品的来源、时间、地点、方法和结果等并要有经手人和实验人员的签字。酶联测定需有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测需有电泳结果图片，实时荧光RT-PCR检测需要有反应原始数据，生物学测定需有鉴别寄主的症状照片。2
KAOKAca
A.1寄主范围
A.1.1自然寄主
附录A
（资料性附录）
豇豆重花叶病毒背景资料
SN/T2055—2016
毛菱豆（Calopogoniummucunotdes），直生刀豆（Canavaliaensiformis），距瓣豆（Centrosemapu-mar），大翼豆（Macroptilium
bescens），鼓麻（Crotalariajuncea），Desmoctiumcanescens·大豆（GlyeineLathyroides），菜豆（Phaseolusvulgaris四棱豆（Psophocarpustetragonolobus），绿豆（Vignaradiata），豇豆（Vignaunguiculata）,CrotalariapaulineaA.1.2人工寄主
豆科：木豆（Cajanuscajan）、豌豆（isumsatiu
DesmodiumcanescensSesbuniaeaitaia终车轴草（Trifoliumincarnatum），望江南（Cassiaoccidentalis）。夹竹桃科：长春花（Catharanthusroseus）蒙科：黎（Chenopodiumalbum）觉色蒙（Chenopodiumamaranticolor），Chenopodiumcapitatum、昆黎（Chenopodiumquinoa）
茄科：曼陀罗（Datura stramonium）、克里夫兰烟（Nicotianaclevelandii）、矮牵牛（Petuniahybri-da），普通烟（Nicotianatabucum）、心叶烟（Nicotianaglutinosa）。莞科：千日红（Gomphrenaglobosa）。A.2病害症状
几乎所有的寄主在接种叶上形成褪绿斑或坏死斑，系统症状为斑驳或花叶，幼叶通常形成明显疱状在巴西，受侵染的大豆出现植株矮化、芽枯、结英数减少、产量降突起、畸形。一些寄主表现系统坏死。低。毛蔓豆出现严重花叶和疱状突起，距瓣豆出现腿绿和花叶症状：藏麻叶片出现褪绿斑驳和畸形或褪绿斑症状；绿豆叶片出现轻花叶和坏死斑症状；豇豆叶片出现褪绿花叶和严重畸形。A.3地理分布
美国、特立尼达（特立尼达和多巴哥共和国）、波多黎各岛、萨尔瓦多、哥斯达黎加、委内瑞拉、苏里南、巴西、秘鲁、墨西哥。
A.4传播途径
机械传播；花粉、种子传播；甲虫传播，主要是叶甲科甲虫传播，大约有10种，其中Cerotomaruficornis，C.trifurcata是最重要的传播介体。3
kAoNiKAca
SN/T2055—2016
A.5粒体形态
豇豆重花叶病毒粒体为等轴对称球状体，无包膜，直径25nm，如图A.1所示。图A，1豇豆重花叶病毒电镜照片（图中标尺100nm）A.6基因组
CPSMV基因组有2条RNA组成，RNA-1长5957nt；RNA-2长3732nt。-KAoNiKAca
B.1试剂
附录B
（规范性附录）
酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）DAS-ELISA方法：包被抗体为多克隆抗体，检测抗体为多克隆抗体（酶标抗体）。B.1.2
对硝基苯磷酸二钠(pNPP)。
包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NaCO）
碳酸氢钠（NaHCO：）
蒸馏水定容至1L，4℃储存。
PBST缓冲液（pH7.4)
氯化钠（NaCL）
磷酸二氢钾（KH,PO）
磷酸氢二钠（Na2HPO.）
氯化钾（KCL）
吐温-20（Tween-20）
蒸馏水定容至1L。
样品抽提缓冲液（pH7.4）
亚硫酸钠（NazSO,）
PVP(MV24000-40000)
4℃储存。
酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4）
BSA（牛血清白蛋白）
PVP(MV24000~40000)
4℃储存。
底物缓冲液（pH9.8）
二乙醇胺
氯化镁（MgClz）
SN/T2055—2016
KAoNiKAca
SN/T2055—2016
溶于800mL蒸馏水，用盐酸调pH值至9.8，然后用蒸馏水定容至1L。4℃储存。B.2实验步骤
B.2.1包被抗体
按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体，每孔加100uL酶联板加盖或用保鲜膜包好，放在37C孵育2h。清空孔中溶液，用PBST加满各孔，3min后倒掉孔中溶液，在吸水纸1拍干。再重复2次上述洗板过程。
B.2.2样品制备与加样
待测样品按1：10（重量：体积）加人抽提缓冲液，在研钵中研磨，2000r/min离心10min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照增性对照做相应处理或按说明书进行。加人制备好的检测样品，阴性对照、阳性对照，100μL/孔，酶联板加盖或用保鲜膜包好，放在4孵育过夜。酶联板用自来水彻底冲洗，再用PBST洗涤3次，每次3min，B.2.3加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度并加人到酶联板中，100uL/孔：酶联板加盖或用保鲜膜包好，37℃，4h。酶联板用自米水彻底冲洗，再用PBST洗涤3次，每次3min。B.2.4加底物
将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL（现配现用），100μL/孔加人到酶联板中室温避光孵育。
B.2.5读数
在不同的时间内如30min.60min90min,120min或更长时间，用酶联仪在405nm处读OD值。B.3结果判定
对照孔的OD40值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内：即：缓冲液孔和阴性对照孔的OD45值0.15，当阴性对照孔的OD值0.05时，按0.05计算：阳性对照OD40s值/阴性对照OD值5；同一样品的重复性基本一在满足了上述的质量要求后，结果原则上可判定如下：样品OD值/阴性对照OD4s值2.判为阳性；样品OD4m值/阴性对照（OD值在2左右，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证；样品OD4as值/阴性对照ODe值<2，判为阴性若满足不了上述的质量要求，则不能进行结果判定。6
KAOIKAca
C.1试剂
核酸提取试剂
核酸提取试剂为商品化TR|zo试齐C.1.2
50XTAE
三羟甲基氨基甲烷（Tris）
冰乙酸
Z二胺四乙酸二钠（EDTA·2H，O)附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测方法
加蒸馏水至1L。用时加蒸馏水稀释至IXTAEC.1.36×加样缓冲液
0.25%溴酚蓝。
40%（质量浓度）蔗糖水溶液。
2实验步骤
总RNA提取
SN/T2055—2016
取0.1g样品，加入1mLTRIzol试剂充分研磨室温放置5min?12000g离心5min，取上清到另一离心管中；加人三氯甲烷500μl充分震荡15s，室温放置3min：12000g4℃离心15min；取上层水相加人另一离心管中，加入等体积异丙醇10min弃去上清；加入1mL70%乙免费标准bzxz.net
000g.4C.离心
醇洗涤；RNA沉淀干燥后，加经过焦碳酸二乙酯（DEPC)处理的ddH,O40μL溶解即可。注：或者按照等效RNA提取试剂盒进行操作C.2.2引物序列
根据虹豆重花叶病毒的CP基因序列（GeneBank序列号：NC003544、M83309、GQ229416）和标准毒株（ATCCPV-273和DSMZPV-0050)CP基因序列设计一对简并引物如下：CPSMV-CP-F:5'-ACACARGTIMGICCIGATAC3.其中R=A/G,I=IMP次黄嘌呤核苷酸）.M-C/A。
CPSMV-CP-R:5'GCTACIGGACTRCTRCTCA-3'其中I-IMP（次黄嘌岭核苷酸）.R=A/G,
预期扩增大小为356bp
C.2.3反转录
反转录总体系为12.5uL。在PCR管中依次加人3μL总RNA，μL下游引物CPSMY-CP-R（浓度为20pmol/uL)，65℃温浴7min，然后冰浴5min，瞬时离心，再向PCR管中加入下列试剂：M7
SN/T2055—2016
MLVRT(200U/μl)0.5μL,5XRT缓冲液2.5μL,dNTP(10mmol/L)0.5μL,RNasin(40U/μL)0.5uL、DEPC处理的ddH,O4.5μL反应参数：42℃60min95℃10min，合成的cDNA于-20℃冰箱保存备用。C.2.4PCR扩增
PCR反应体系见表C.1。反应参数：94℃3min；94℃45s.52℃45s，72℃1min，35个循环；72℃延伸7min。
试剂名称
10XPCRBuffer
dNTP(1ommol/L)
CPSMV-CP-F(20pmol/μL)
CPSMV.CPR(20pmol/uL.)
Taq酶(5U/μl)
cDNA模板
5琼脂糖凝胶检测
PCR反应体系
加样量/L
补足反应总体积至25μL
用1×TAE配制1%琼脂糖凝胶，加热溶化后冷却至55℃左右。将凝胶倒人凝胶槽中，插上样品梳子。冷却凝固后拔掉梳子，在电泳槽内加入1×TAE，缓冲液要没过凝胶表面约1mm。将加样缓冲液与样品混合后加人样品孔，同时设计PCR的阴性对照和阳性对照，并加入分子量标准物。接通电源，以3V/cm~5V/cm电场强度进行电泳，0.5h后观察结果。电泳结束后，将凝胶放人0.5g/mL的漠化乙锭（EB）染色液中染色10min~15min。将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察，记录结果。C.3
结果判断
阳性对照在356bp处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性阳性对照在356bp处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，且待测样品在356bp处无扩增条带，判定结果为阴性。
D.1主要试剂
D.1.1RNA提取试剂
附录D
（规范性附录）
实时荧光RT-PCR检测方法
TRIzol试剂、三氯甲烷、异内醇、70%乙醇。D.1.2实时荧光RT-PCR试剂
RealtimePCRMasterMix(2X)。
引物探针
SN/T2055—2016
根据豇豆重花叶病毒标准毒株（ATCCPV-273和DSMZPV-0050)CP基因序列设计一对引物及Taqman探针如下：
CPSMV-F:5'-GGTCAATCCCGGCATTATTG-3'CPSMV-R:5-GGCTTCTGCAGGTGTTCCAA-3;CPSMV-Probe:5'(FAM)-TGTAGC ACA ATCAGG GCAAACACAGCA-(TAMRA)3*。D.3
核酸提取
取0.1g植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移人灭菌的1.5mL.离心管中，加人1mL.TRIzol试剂充分研磨，室温放置5min12000g离心5min，取上清到另一离心管中；加人三氯甲烷500ul，充分震荡15s，室温放置3min；12000g，4℃离心15min；取上层水相加人另一离心管中，加入等体积异丙醇；12000g，4℃，离心10min，充去上清，加入1mL70%乙醇洗涤；RNA沉淀干燥后，加经过焦碳酸二乙酯（DEPC)处理的ddHzO40μL溶解即可。注：或者按照等效RNA提取试剂盒进行操作。D.4
cDNA合成
反转录总体系为13μL。特异性下游引物CPSMV-R(20μmol/L)0.5μL、RNA模板1μL、无RNA酶ddH,O7.5μL，在PCR仪上65℃处理5min，迅速冷却后再向PCR管中加入下列试剂：MMLVRT(200U/μL)0.5μL.5XRT缓冲液2.5μL,dNTP(10mmol/L)0.5μL、RNasin(40U/μL)0.5μL
反应参数：42℃60min，95℃10min。5实时荧光RT-PCR反应
实时荧光PCR反应体系见表D.1。9
SN/T2055—2016
试剂名称
实时荧光PCR反应体系
RealtimePCRMasterMix(2X)
CPSMV-F(20μmol/L)
CPSMV-R(20μmol/L)
CPSMV-Probe(20μmol/L)
DEPC处理水
设置阳性对照、阴性对照及空白对照反应程序：94℃3min；94℃15s.60℃60sD.6结果判定
45个循环
加样量/uL
足反应总体积至20l
检测样品的Ct值大于或等于40时，则判定豇豆重花叶病毒阴性检测样品的Ct值小于或等于35时，则判定豇豆重花叶病导阳性检测样品的C值小于40而大于35时，应重新进行测试，如果重新测试的Ct值大于或等于40时，则判定虹豆重花叶病毒阴性；如果重新测试的Ct值小于40，则判定虹豆重花叶病毒阳性。S
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。
代替SN/T2055-2008
豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of Cowpea severe mosaic virus2016-08-23发布
中华人民共和国
甜涂品意真历
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T2055—2016
本标准代替SN/T2055—2008《虹豆重花叶病毒检疫鉴定方法》，与SN/T2055—2008相比，主要变化如下：
增加了常规RT-PCR检测方法；
增加了实时荧光RT-PCR检测方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局，本标准主要起草人：李桂芬、孔君、李彬、马洁、陈青、魏梅生、张永江。本标准所代替标准的历次发布情况为：SN/T2055-2008
1范围
豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法
本标准规定了植物检疫中豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法。本标准适用于豆科繁殖材料（种子、植株）中豇豆重花叶病毒的检疫鉴定。2规范性引用文件
SN/T2055—2016
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3基本信息
学名：Cowpea severemosaicvirus缩写：CPSMV
分类地位：伴生豇豆病毒科（Secoviridae），豇豆花叶病毒亚科（Comovirinae），紅豆花叶病毒属(Comovirus)。
该病毒的其他信息参见附录A。
4方法原理
根据虹豆重花叶病毒与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行EI.ISA检测：根据该病毒核酸的序列进行PCR特异性检测，通过电泳条带大小进行结果判定；根据该病毒核酸序列设计特异性引物和荧光探针，通过检测的荧光信号进行结果判定。5仪器设备及试剂
仪器设备
酶标仪、天平（感量，1/10000g）、pH计、微量榨汁机、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离温室、恒温水浴、低温冰箱等。微量移液器（2μL，10μL，20L，100μL200μL，1000μL）、酶联板、研钵、离心管、花盆、消毒土等。5.2试剂
酶联免疫吸附测定试剂见附录B的B.1、RT-PCR检测试剂见附录C的C.1、实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D的D.1。
试验用水应符合GB/T6682要求
6样品制备
6.1种子
挑取畸形、不成熟种子及随机挑选的种子播于灭菌土中，待长出幼叶后，将表现症状的植株单独编1
SN/T2055—2016
号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。采集的叶片分成2份，根据需要分别用于酶联测定和分子检测
6.2植株
有症状（如叶片畸形、花叶、斑驳等）的植株编号单独检测。没有症状的分组并编号检测，分组方法和检测方法同6.1。
7检测方法
7.1酶联免疫吸附测定
见附录B。
7.2RT-PCR检测方法
见附录C。
实时荧光RT-PCR检测方法
见附录D。
生物学测定
见附录E。
8结果判定
样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行先用DAS-ELISA方法进行检测。
若DAS-ELISA结果为阴性
PCR的检测结果为阴性
则判定样品不携带CPSMV：检测结果时.RT
为CPSMV序列.则判定样品携带CPSMV：或用实时荧光RT为阳性，则对产物进行测序，测定的序列PCR进行检测，若检测结果为阴性，则判定样品不携带CPSMV：若检测结果为阳性，则判定样品携带CPSMV
若DAS-ELISA结果为阳性时.RTPCR检测或实时荧光RTPCR检测为阳性，即可判定待检样品携带CPSMV。
9样品保存与结果记录
9.1样品保存
经检测确定携带豇豆重花叶病毒的样品应在合适的条件下保存，种子在室温干燥保存1年；植株一80℃保存1年，做好标记和登记工作。9.2结果记录
完整的记录包括：样品的来源、时间、地点、方法和结果等并要有经手人和实验人员的签字。酶联测定需有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测需有电泳结果图片，实时荧光RT-PCR检测需要有反应原始数据，生物学测定需有鉴别寄主的症状照片。2
KAOKAca
A.1寄主范围
A.1.1自然寄主
附录A
（资料性附录）
豇豆重花叶病毒背景资料
SN/T2055—2016
毛菱豆（Calopogoniummucunotdes），直生刀豆（Canavaliaensiformis），距瓣豆（Centrosemapu-mar），大翼豆（Macroptilium
bescens），鼓麻（Crotalariajuncea），Desmoctiumcanescens·大豆（GlyeineLathyroides），菜豆（Phaseolusvulgaris四棱豆（Psophocarpustetragonolobus），绿豆（Vignaradiata），豇豆（Vignaunguiculata）,CrotalariapaulineaA.1.2人工寄主
豆科：木豆（Cajanuscajan）、豌豆（isumsatiu
DesmodiumcanescensSesbuniaeaitaia终车轴草（Trifoliumincarnatum），望江南（Cassiaoccidentalis）。夹竹桃科：长春花（Catharanthusroseus）蒙科：黎（Chenopodiumalbum）觉色蒙（Chenopodiumamaranticolor），Chenopodiumcapitatum、昆黎（Chenopodiumquinoa）
茄科：曼陀罗（Datura stramonium）、克里夫兰烟（Nicotianaclevelandii）、矮牵牛（Petuniahybri-da），普通烟（Nicotianatabucum）、心叶烟（Nicotianaglutinosa）。莞科：千日红（Gomphrenaglobosa）。A.2病害症状
几乎所有的寄主在接种叶上形成褪绿斑或坏死斑，系统症状为斑驳或花叶，幼叶通常形成明显疱状在巴西，受侵染的大豆出现植株矮化、芽枯、结英数减少、产量降突起、畸形。一些寄主表现系统坏死。低。毛蔓豆出现严重花叶和疱状突起，距瓣豆出现腿绿和花叶症状：藏麻叶片出现褪绿斑驳和畸形或褪绿斑症状；绿豆叶片出现轻花叶和坏死斑症状；豇豆叶片出现褪绿花叶和严重畸形。A.3地理分布
美国、特立尼达（特立尼达和多巴哥共和国）、波多黎各岛、萨尔瓦多、哥斯达黎加、委内瑞拉、苏里南、巴西、秘鲁、墨西哥。
A.4传播途径
机械传播；花粉、种子传播；甲虫传播，主要是叶甲科甲虫传播，大约有10种，其中Cerotomaruficornis，C.trifurcata是最重要的传播介体。3
kAoNiKAca
SN/T2055—2016
A.5粒体形态
豇豆重花叶病毒粒体为等轴对称球状体，无包膜，直径25nm，如图A.1所示。图A，1豇豆重花叶病毒电镜照片（图中标尺100nm）A.6基因组
CPSMV基因组有2条RNA组成，RNA-1长5957nt；RNA-2长3732nt。-KAoNiKAca
B.1试剂
附录B
（规范性附录）
酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）DAS-ELISA方法：包被抗体为多克隆抗体，检测抗体为多克隆抗体（酶标抗体）。B.1.2
对硝基苯磷酸二钠(pNPP)。
包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NaCO）
碳酸氢钠（NaHCO：）
蒸馏水定容至1L，4℃储存。
PBST缓冲液（pH7.4)
氯化钠（NaCL）
磷酸二氢钾（KH,PO）
磷酸氢二钠（Na2HPO.）
氯化钾（KCL）
吐温-20（Tween-20）
蒸馏水定容至1L。
样品抽提缓冲液（pH7.4）
亚硫酸钠（NazSO,）
PVP(MV24000-40000)
4℃储存。
酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4）
BSA（牛血清白蛋白）
PVP(MV24000~40000)
4℃储存。
底物缓冲液（pH9.8）
二乙醇胺
氯化镁（MgClz）
SN/T2055—2016
KAoNiKAca
SN/T2055—2016
溶于800mL蒸馏水，用盐酸调pH值至9.8，然后用蒸馏水定容至1L。4℃储存。B.2实验步骤
B.2.1包被抗体
按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体，每孔加100uL酶联板加盖或用保鲜膜包好，放在37C孵育2h。清空孔中溶液，用PBST加满各孔，3min后倒掉孔中溶液，在吸水纸1拍干。再重复2次上述洗板过程。
B.2.2样品制备与加样
待测样品按1：10（重量：体积）加人抽提缓冲液，在研钵中研磨，2000r/min离心10min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照增性对照做相应处理或按说明书进行。加人制备好的检测样品，阴性对照、阳性对照，100μL/孔，酶联板加盖或用保鲜膜包好，放在4孵育过夜。酶联板用自来水彻底冲洗，再用PBST洗涤3次，每次3min，B.2.3加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度并加人到酶联板中，100uL/孔：酶联板加盖或用保鲜膜包好，37℃，4h。酶联板用自米水彻底冲洗，再用PBST洗涤3次，每次3min。B.2.4加底物
将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL（现配现用），100μL/孔加人到酶联板中室温避光孵育。
B.2.5读数
在不同的时间内如30min.60min90min,120min或更长时间，用酶联仪在405nm处读OD值。B.3结果判定
对照孔的OD40值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内：即：缓冲液孔和阴性对照孔的OD45值0.15，当阴性对照孔的OD值0.05时，按0.05计算：阳性对照OD40s值/阴性对照OD值5；同一样品的重复性基本一在满足了上述的质量要求后，结果原则上可判定如下：样品OD值/阴性对照OD4s值2.判为阳性；样品OD4m值/阴性对照（OD值在2左右，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证；样品OD4as值/阴性对照ODe值<2，判为阴性若满足不了上述的质量要求，则不能进行结果判定。6
KAOIKAca
C.1试剂
核酸提取试剂
核酸提取试剂为商品化TR|zo试齐C.1.2
50XTAE
三羟甲基氨基甲烷（Tris）
冰乙酸
Z二胺四乙酸二钠（EDTA·2H，O)附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测方法
加蒸馏水至1L。用时加蒸馏水稀释至IXTAEC.1.36×加样缓冲液
0.25%溴酚蓝。
40%（质量浓度）蔗糖水溶液。
2实验步骤
总RNA提取
SN/T2055—2016
取0.1g样品，加入1mLTRIzol试剂充分研磨室温放置5min?12000g离心5min，取上清到另一离心管中；加人三氯甲烷500μl充分震荡15s，室温放置3min：12000g4℃离心15min；取上层水相加人另一离心管中，加入等体积异丙醇10min弃去上清；加入1mL70%乙免费标准bzxz.net
000g.4C.离心
醇洗涤；RNA沉淀干燥后，加经过焦碳酸二乙酯（DEPC)处理的ddH,O40μL溶解即可。注：或者按照等效RNA提取试剂盒进行操作C.2.2引物序列
根据虹豆重花叶病毒的CP基因序列（GeneBank序列号：NC003544、M83309、GQ229416）和标准毒株（ATCCPV-273和DSMZPV-0050)CP基因序列设计一对简并引物如下：CPSMV-CP-F:5'-ACACARGTIMGICCIGATAC3.其中R=A/G,I=IMP次黄嘌呤核苷酸）.M-C/A。
CPSMV-CP-R:5'GCTACIGGACTRCTRCTCA-3'其中I-IMP（次黄嘌岭核苷酸）.R=A/G,
预期扩增大小为356bp
C.2.3反转录
反转录总体系为12.5uL。在PCR管中依次加人3μL总RNA，μL下游引物CPSMY-CP-R（浓度为20pmol/uL)，65℃温浴7min，然后冰浴5min，瞬时离心，再向PCR管中加入下列试剂：M7
SN/T2055—2016
MLVRT(200U/μl)0.5μL,5XRT缓冲液2.5μL,dNTP(10mmol/L)0.5μL,RNasin(40U/μL)0.5uL、DEPC处理的ddH,O4.5μL反应参数：42℃60min95℃10min，合成的cDNA于-20℃冰箱保存备用。C.2.4PCR扩增
PCR反应体系见表C.1。反应参数：94℃3min；94℃45s.52℃45s，72℃1min，35个循环；72℃延伸7min。
试剂名称
10XPCRBuffer
dNTP(1ommol/L)
CPSMV-CP-F(20pmol/μL)
CPSMV.CPR(20pmol/uL.)
Taq酶(5U/μl)
cDNA模板
5琼脂糖凝胶检测
PCR反应体系
加样量/L
补足反应总体积至25μL
用1×TAE配制1%琼脂糖凝胶，加热溶化后冷却至55℃左右。将凝胶倒人凝胶槽中，插上样品梳子。冷却凝固后拔掉梳子，在电泳槽内加入1×TAE，缓冲液要没过凝胶表面约1mm。将加样缓冲液与样品混合后加人样品孔，同时设计PCR的阴性对照和阳性对照，并加入分子量标准物。接通电源，以3V/cm~5V/cm电场强度进行电泳，0.5h后观察结果。电泳结束后，将凝胶放人0.5g/mL的漠化乙锭（EB）染色液中染色10min~15min。将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察，记录结果。C.3
结果判断
阳性对照在356bp处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性阳性对照在356bp处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，且待测样品在356bp处无扩增条带，判定结果为阴性。
D.1主要试剂
D.1.1RNA提取试剂
附录D
（规范性附录）
实时荧光RT-PCR检测方法
TRIzol试剂、三氯甲烷、异内醇、70%乙醇。D.1.2实时荧光RT-PCR试剂
RealtimePCRMasterMix(2X)。
引物探针
SN/T2055—2016
根据豇豆重花叶病毒标准毒株（ATCCPV-273和DSMZPV-0050)CP基因序列设计一对引物及Taqman探针如下：
CPSMV-F:5'-GGTCAATCCCGGCATTATTG-3'CPSMV-R:5-GGCTTCTGCAGGTGTTCCAA-3;CPSMV-Probe:5'(FAM)-TGTAGC ACA ATCAGG GCAAACACAGCA-(TAMRA)3*。D.3
核酸提取
取0.1g植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移人灭菌的1.5mL.离心管中，加人1mL.TRIzol试剂充分研磨，室温放置5min12000g离心5min，取上清到另一离心管中；加人三氯甲烷500ul，充分震荡15s，室温放置3min；12000g，4℃离心15min；取上层水相加人另一离心管中，加入等体积异丙醇；12000g，4℃，离心10min，充去上清，加入1mL70%乙醇洗涤；RNA沉淀干燥后，加经过焦碳酸二乙酯（DEPC)处理的ddHzO40μL溶解即可。注：或者按照等效RNA提取试剂盒进行操作。D.4
cDNA合成
反转录总体系为13μL。特异性下游引物CPSMV-R(20μmol/L)0.5μL、RNA模板1μL、无RNA酶ddH,O7.5μL，在PCR仪上65℃处理5min，迅速冷却后再向PCR管中加入下列试剂：MMLVRT(200U/μL)0.5μL.5XRT缓冲液2.5μL,dNTP(10mmol/L)0.5μL、RNasin(40U/μL)0.5μL
反应参数：42℃60min，95℃10min。5实时荧光RT-PCR反应
实时荧光PCR反应体系见表D.1。9
SN/T2055—2016
试剂名称
实时荧光PCR反应体系
RealtimePCRMasterMix(2X)
CPSMV-F(20μmol/L)
CPSMV-R(20μmol/L)
CPSMV-Probe(20μmol/L)
DEPC处理水
设置阳性对照、阴性对照及空白对照反应程序：94℃3min；94℃15s.60℃60sD.6结果判定
45个循环
加样量/uL
足反应总体积至20l
检测样品的Ct值大于或等于40时，则判定豇豆重花叶病毒阴性检测样品的Ct值小于或等于35时，则判定豇豆重花叶病导阳性检测样品的C值小于40而大于35时，应重新进行测试，如果重新测试的Ct值大于或等于40时，则判定虹豆重花叶病毒阴性；如果重新测试的Ct值小于40，则判定虹豆重花叶病毒阳性。S
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。