SN/T 4782-2017.Detection of Pa paver in export food and condiment-Real time PCR method.
1范围
SN/T 4782规定了食品及调味品中罌粟成分检测的实时荧光PCR方法。
SN/T 4782适用于食品及调味品中罌粟成分定性检测。本标准所规定方法的最低检出限(LOD)为0.01%(质量分数)。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 27403实验室 质量控制规范食品分 子生物学检测
SN/T 1193基因分 析检测实验室技术要求
3术语和定义
下列术语及定义适用于本文件。
3.1罂粟Papaver somniferum L.
按《中国植物志》,特指鸦片罌粟,为一种直立的一年生罂粟属草本植物。
4方法提要
本标准采用实时荧光PCR特异性检测食品及调味品中罌粟成分。设计了针对罌粟小檗碱桥酶基因的特异性引物探针,采用Taqman实时荧光方法进行检测。
5试剂和材料
5.1引物 及探针(罌粟小櫱碱桥酶基因Pa paver som niferum berberine bridge enzyme bbel):
——上游引物:5'-GTTCTTAGGCTTACACTTGGGACG-3';
——下游引物:5'-ACCGGGCTGTTCTGATAACATCT-3';
——探针:FAM-TTTCAAGAAATGAGTTGGGGTGAATCC-BHQ1。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4782—2017
出口食品及调味品中罂栗成分检测方法实时荧光PCR法
Detection of Papaverin export food and condiment-RealtimePCRmethod
2017-05-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-12-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4782—2017
本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国安徽出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、上海市质量监督检验技术研究院本标准起草人：杨捷琳、高琴、宗凯、刘洋、刘月明、吕蓉、李想、潘良文、何宇平。1
1范围
出口食品及调味品中罂栗成分检测方法实时荧光PCR法
本标准规定了食品及调味品中罂粟成分检测的实时荧光PCR方法。SN/T 4782-—2017
本标准适用于食品及调味品中罂粟成分定性检测。本标准所规定方法的最低检出限（LOD）为0.01%（质量分数）。
2规范性引用文件Www.bzxZ.net
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T1193基因分析检测实验室技术要求3术语和定义
下列术语及定义适用于本文件。3.1
婴栗Papaver somniferumL.
按《中国植物志》，特指鸦片馨粟，为一种直立的一年生栗属草本植物。4方法提要
本标准采用实时荧光PCR特异性检测食品及调味品中罂粟成分。设计了针对翼栗小檗碱桥酶基因的特异性引物探针，采用Taqman实时荧光方法进行检测。5试剂和材料
5.1引物及探针（罂栗小檗碱桥酶基因Papaversomniferumberberinebridgeengymebbel)：上游引物：5-GTTCTTAGGCTTACACTTGGGACG-3'；下游引物：5'-ACCGGGCTGTTCTGATAACATCT-3'；探针:FAM-TTTCAAGAAATGAGTTGGGGTGAATCC-BHQ1。5.2石油醚。
5.3CTAB提取缓冲液：20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl.0.1mol/L.Tris-HCl,0.02mol/LNa?EDTA，pH8.0。
5.4蛋白酶K(20mg/mL）。
三氯甲烷（氯仿）。
CTAB沉淀液5g/LCTAB,40mmol/LNaCl。5.6
SN/T4782—2017
5.71.2mol/LNaCl溶液。
5.8异丙醇。
5.970%乙醇。
5.10质控物质：翼粟阳性物质。6
仪器和设备
6.1实时荧光PCR仪。
6.2恒温水浴锅。
6.3均质器。
涡旋震荡器。
6.5离心机：最大转速16.000g。6.6移液器2.5μL、20μL、200、1000L。6.7
核酸浓度测定仪。
3大体积浓缩仪。
检验步骤
样品前处理
7.1.1一般样品
取25g样品，研磨均质，称取200mg样品至2mL离心管中，按照步骤7.2提取DNA。7.1.2高油脂含量样品
称取250g样品（预包装产品可加热溶解），倒人500mL烧杯中，静置1h~2h，样品可分为3层，上层是油脂，中间是水相，下层是固体残渣。去除上层油脂，吸取水相到分液漏斗中，加入100mL石油醚（5.2），震荡5min后静置，收集下层水相。采用大体积浓缩仪，40℃～60℃抽真空及低速离心条件下，将水相浓缩至1mL~5mL。取浓缩后水相与固体残渣混合，转移到100mL烧杯中，研磨均质，取200mg到2mL离心管中，采用7.2方法提取DNA。7.2DNA提取
按照下述CTAB法提取DNA，也可采用等效的DNA提取试剂盒。在样品中加人1mLCTAB提取缓冲液（5.3）和20uL蛋白酶K（5.4）溶液：混匀，65℃水浴1h。10000g离心10min，取上清转移至2ml离心管中，加人700uL氯仿（5.5），涡旋震荡30s混匀。10000g离心10min，收集上清至新的2mL离心管中，加人2倍体积的CTAB沉淀液（5.6），室温放置60min。10000g离心10min，弃上清。沉淀溶于350叫L1.2mol/LNaCl溶液（5.7），涡旋震荡30s溶解沉淀。加人350uL氯仿，涡旋震荡30s混匀，10000g离心10min。将上清转移至新的离心管中，加人0.8倍体积的异丙醇（5.8），室温放置25min。10000g离心10min弃上清，加人500μL70%乙醇（5.9）洗涤沉淀。涡旋震荡30s，10000g离心10min，弃上清，室温T燥10min，加入50μL~80μl无菌水溶解DNA。
提取的DNA用核酸浓度测定仪测定浓度后，调整DNA浓度至20ng/μL～100ng/mL之问。2
-TTKAONiKAca
3实时荧光PCR检测
反应体系
SN/T4782—2017
总体积为25μL，其中含：2×PCR缓冲液（含TagDNA聚合酶）12.5uL、引物对（10μmol/L）各1μL、探针（10umol/L)1μL、模板DNA5μL（模板量控制在20ng/μL～100ng/μuL)，体积用水补足7.3.2反应条件
50℃2min；95℃10min；扩增：95℃10s，58℃45s，58℃时收集荧光，扩增步骤共进行45个循环。
7.4质量控制
检测过程中分别设阳性对照、提取对照、空白对照。阳性对照（5.10）为署栗阳性物质DNA，空白7.4.1
对照为无菌水，提取对照为采用无菌水作为提取起始物得到的DNA，用于监测DNA提取过程中有无污染。
阳性对照Ct值35，且有典型指数型扩增曲线。7.4.3空白对照无扩增。
结果与报告
7.5.1在符合7.4质量控制要求情况下，检测样本Ct值小于或等于40.0时，报告检出罄成分7.5.2检测样本Ct值大于40.0且小于45.0时，重复一次，如果Ct值仍小于45.0，且有典型指数型扩增曲线，可报告检出罂栗成分，否则报告未检出罄粟成分。7.5.3检测样本无明显扩增曲线时，报告未检出粟成分7.6检测过程中防止交叉污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403和SN/T1193的规定执行。TTKAONT KAca
SN/T4782-2017
中华人民共和国出人境检验检疫行业标
出口食品及调味品中罂栗成分检测方法实时荧光PCR法
SN/T47822017
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010)68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷广印刷*
开本880×12301/16
印张0.5字数8千字
2018年3月第版2018年3月第次印刷印数1-—500
书号：155066：2-32785
定价14.00元
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。