SN/T 4737-2016
基本信息
标准号： SN/T 4737-2016
中文名称：猪及其产品中特定转基因成分实时定量PCR检测方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：2960507
相关标签： 产品 特定 转基因 成分 实时 定量 PCR 检测 方法
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4737-2016.Protocol of the real-time PCR for detecting genetically modified component in pigs and their derived products.
1范围
SN/T 4737规定了猪及其产品中特定转基因成分的实时定量PCR检测方法。
SN/T 4737适用于转脂肪酸去饱和酶基因、转植酸酶基因、肌肉生长抑制素基因敲除猪及其产品的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.2转基因产品检测实验室技术要求
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
APPA:植酸酶( Phytase)
MSTN:肌肉生长抑制素(Myostain)
PCR:聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)
sFat-1:w-3脂肪酸去饱和酶基因(omega-3 faty acid desaturase)
TE: Tris-HCl.EDTA缓冲液
4防污染措施
猪及其产品中特定转基因成分实时定量PCR检测过程的防污染措施应符合GB/T 19495.2 的规定。
5实时定量PCR试验
5.1 主要仪器
5.1.1实时荧光定量 PCR仪。
5.1.2 超净工作台。
5.1.3 消毒灭菌锅。
1范围
SN/T 4737规定了猪及其产品中特定转基因成分的实时定量PCR检测方法。
SN/T 4737适用于转脂肪酸去饱和酶基因、转植酸酶基因、肌肉生长抑制素基因敲除猪及其产品的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.2转基因产品检测实验室技术要求
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
APPA:植酸酶( Phytase)
MSTN:肌肉生长抑制素(Myostain)
PCR:聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)
sFat-1:w-3脂肪酸去饱和酶基因(omega-3 faty acid desaturase)
TE: Tris-HCl.EDTA缓冲液
4防污染措施
猪及其产品中特定转基因成分实时定量PCR检测过程的防污染措施应符合GB/T 19495.2 的规定。
5实时定量PCR试验
5.1 主要仪器
5.1.1实时荧光定量 PCR仪。
5.1.2 超净工作台。
5.1.3 消毒灭菌锅。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4737—2016
猪及其产品中特定转基因成分
实时定量PCR检测方法
Protocol of the real-time PCR for detecting genetically modified component inpigs and their derived products2016-12-12发布
中华人民共和国
玉家质量监督检验检疫总局
2017-07-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4737-—2016
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国农业科学研究院北京畜牧兽医研究所、中华人民共和国山东出入境检验检疫局
本标准主要起草人：林祥梅、王勤、李晓琳、朱振营、刘建、李奎、潘登科、孙敏、付伟、刘晓飞、梅琳、刘丹丹、仇松寅。
1范围
猪及其产品中特定转基因成分
实时定量PCR检测方法
本标准规定了猪及其产品中特定转基因成分的实时定量PCR检测方法。SN/T47372016
本标准适用于转脂肪酸去饱和酶基因转植酸酶基因、肌肉生长抑制素基因敲除猪及其产品的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修尊单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
APPA：植酸酶（Phytase）
实验室技术要求
MSTN：肌肉生长抑制素（Myostatin）PCR：聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction)
sFat-l：w-3脂肪酸去饱和酶基因（omeg）ta-3fattyaciddesaturase
TE：Tris-HCI、EDTA缓冲液
4防污染措施
猪及其产品中特定转基因成分实时定量PCR检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。
5实时定量PCR试验
5.1主要仪器
实时荧光定量PCR仪。
超净工作台。
消毒灭菌锅。
核酸蛋白分析仪。
高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机。低温冰箱，冷藏冷冻冰箱。
SN/T4737-—2016
纯水器，双蒸水器。
漩涡震荡器。
微量进样器：2.5L、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL。5.2主要试剂
实验用水：符合GB/T6682中一级水的规格。5.2.2
！TaqDNA聚合酶，三氯甲烷，异丙醇，异戊醇，70%乙醇，TE缓冲液，50倍TAE电泳浓缩缓冲液，细胞裂解缓冲液，蛋白酶K，醋酸钠（NaAc）。药品及试剂配制方法见附录A。5.3引物和探针
按照表1中提供的引物和探针序列合成引物及探针，配制成10pmol/μL用于PCR检测，扩增序列参见附录B。
表1检测转基因猪内外基因所需的引物序列被检测基因
Susβ2M
sFat-1
基因来源
猪内源
5.4试验步骤
5.4.1样品采集
引物序列
S'GAAGGTTCAGGTTTACTCACG3
STCAGCAAATCAATTTCAATCTG3
探针序列
5'CCCAGCGGAAAACGG
AAAGCCAA3
G'AGGGTAGGAAAGTGATTCAGGATCT35'TGCAGGTCAATTCT'CAGACTGCCTTGGGAAAAGC3
5'TGTTCGTTGGCAGGTTTTAC3\
5'AGATGGCTGGCAACTAGAAG3
STGTACGAGGCTGATGAATGG3'
5'TGTCCGTCTGTGATATGGTG3
5'TGAATGAAGCACGCA
TACCGGC3
5'TGTGTCCAATCCGAGT
CCATAGTAACGA3
采集动物的组织块作为检测样品，将其放入无菌Eppendorf管中，编号备用。采集过程中样品不得交叉污染，采集及样品前处理过程中应戴一次性手套。5.4.2样品存放
对于采集的样品放置在一70℃冰箱或液氮中，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。5.4.3样品核酸的提取
内参照
MSTN基因
敲除猪检测
转植酸酶
基因猪检测
转W-3脂
肪酸去饱和酶
基因检测
5.4.3.1取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加人1mL的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转人1.5mL离心管中，加人蛋白酶K（20mg/mL）和胰RNA酶（20mg/mL）各5uL，混勾。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转人37℃水浴12h24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000r/min离心5min，取上清液转人另一离心管中。5.4.3.2加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100uL吸头挑出，晾干，用200LTE重新溶解（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）5.4.3.3加等量的酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）至上清液中，振荡混勾，离心12000r/min，2
-irKAoNiKAca
5min。
SN/T4737—2016
取上层溶液至另一管，加人等体积的三氯甲烷，异戊醇（24：1)，振荡混勾，离心12000r/min，5.4.3.4
5min。
取上层溶液至另一管，加人1/10体积的3mol/LNaAc（pH5.2），加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min，离心12000r/min，10min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。5.4.3.6
用1mL70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000r/min，5min。5.4.3.7
小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。加100uLTE重新溶解沉淀物。
5.4.3.10也可采用其他等效的商业化试剂盒。5.4.4阴性对照、阳性对照和空自对照的设置阴性对照：非转基因猪及其加工产品。阳性对照：阳性转基因猪及其加工产品。空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以水代替样品），二是PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。
5.4.5实时定量PCR反应体系
实时定量PCR反应体系见表2，每个样品各做两个平行管。加样时应使样品DNA落液完全落入反应液中，离心机离心使溶液落于反应管底部。表2实时定量PCR反应体系
试剂名称
TaqMan探针法预混液
引物（上游）
引物（下游）
DNA模板
补水至
使用浓度
10pmol/μL
10pmol/μl
10pmol/μL
(20 ng/μL~30ng/μL)
注：表中DNA模板为原料的模板量，加工产品可视加工程度适当增加模板量5.4.6实时定量PCR反应参数
25μl反应体系加样体积/μl
1μ~2μ
预变性95℃.3min；95℃，5s.59℃，15s，72℃，15s，40个循环。不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。
5.4.7仪器检测通道的选择
PCR反应管荧光信号收集的设置，应与探针所标记的报告基团（可自由选择报告基团或者淬灭基团）一致，报告基团为FAM时，荧光信号收集应设在FAM通道；报告基团为HEX时，荧光信号收集应设在HEX通道：余类推，率灭基团为TAMRA。具体设置方法因仪器而异，可参照仪器使用说明书KAONKAca
SN/T4737-2016
5.4.8实时定量PCR反应运行
按预先设定的样品摆放顺序将PCR反应管依次摆放（上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器），开始运行仪器进行实时荧光定量PCR反应。5.5结果分析
5.5.1结果分析条件设定
阅值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阅值线刚好超过阴性对照样品扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线的指数增长期为准。5.5.2实时定量PCR检验的质量控制空白对照：内参照基因检测Ct值大于或等于40.并且无特定扩增曲线。阴性对照：内参照基因检测Ct值小于30，外源基因检测Cz值大于或等于40，并且无特定扩增曲线。
阳性对照：内参照基因检测Ct值<30.外源基因检测C值小于或等于34，并且出现特定扩增曲线。
上述指标有一项不符合者，应重做5.5.3结果描述与判定
在空白对照、阴性对照和阳性对照日阴性：待测样品外源基因检测Ct值大于或等于40，阳性：待测样品外源基因检测Ct值小于或等于
可疑：待测样品外源基因检测Ct值在3定核样晶不含有相应基因。
36.判定该样品含有相应基因。
~40之闻，判为可疑：可疑样品应重做，重做结果Ct值大于40为该样品不含有相应基因，否则判定该样品含有相应基因-TTKAoNiKAca
A.11mol/LTris-HCI缓冲液（pH8.0）附录A
（规范性附录）
药品及试剂配制方法
SN/T4737—2016
称取121.1gTris，溶于800mL双蒸水中，加人浓盐酸（浓度为138%的盐酸溶液）42mL，冷却至室温，用浓度为10%的盐酸溶液准确调节PH至8.0.加双蒸水定容至A.2500mmol/LEDTA(pH8.0
L，分装后高压灭菌备用。
在800mL水中加人186.1gEDTA-Na:2HIO.用磁力搅拌器剧烈搅拌至完全溶解，用氢氧化钠调节溶液pH至8.0（约需20g氢氧化钠颗粒），然后加双蒸水定容至1L，分装后高压灭菌备用。A.3TE缓冲液
量取1mol/LTris-HCl缓冲液下载标准就来标准下载网
mot/LEDTA(pH8.0)1mL500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水均勾混合，将溶液定容到500mL后，高温高压灭菌，空温保存。A.4酚：三氯甲烷：异戊醇（25
将Tris-HCl平衡苯酚与等体积的三氯甲烷/异戊醇（24
1)混合均勾后，移入棕色玻璃瓶中4℃保存。
A.550倍TAE电泳浓缩缓冲液
配制方法为取Tris242g冰醋酸57.1mL、0.5mol/LEDTA10mL，用5mol/L的HCl调制pH8.0，定容至1000mL。用前用双蒸水50倍稀释即可。A.63mol/L(NaAc)溶液
称40.8g的NaAc·3H,0加40mL去离子水溶解，用冰醋酸调节pH至5.2，最后定容至100mL。A.710%SDS
称取100gSDS加入900mL灭菌双蒸水中，68℃助溶，用浓HCI调节pH至7.2，定容至1L。A.85mol/LNaCI
称取58.4gNaCl溶于150mL灭菌双蒸水中，加水定容至200mL，高压灭菌，室温保存。5
rrKAoNiKAca
SN/T4737-2016
动物组织裂解缓冲液
量取1mol/LTris-HCl缓冲液（pH8.0)10mL,500mmol/LEDTA(pH8.0)10mL5mol/LNaCl30mL，10%SDS100mL~800mL（pH8.0）灭菌双蒸水中用5mol/L的HCl调制pH8.0，定容至1000mL
蛋白酶K
称取20mg蛋白酶K溶于1mL灭菌的双蒸水中，-20℃备用。A.11
胰RNA酶
称取20mg胰RNA酶溶于1mL灭菌的双蒸水中，-20℃备用。iiKAoNiKAca
附录B
（资料性附录）
实时定量PCR扩增的DNA序列
B.1猪β2M基因序列（GenBank：AF452448.1.3790-4006），SN/T4737—2016
GAAGGTTCAGGTTTACTCACGCCACCCAGCGGAAAACGGAAAGCCAAATTACCTGAACTGCTATGTATCTGGGTTCCATCCGCCCCAGATTGAAATTGATTTGCTGAB.2
转植酸酶基因猪实时定量PCR扩增的DNA序列TGTTCGTTGGCAGGTTTTACGCAAATCGTGAATGAAGCACGCATACCCGCTTGCAGTTTGTAAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTB.3转0-3脂肪酸去饱和酶基因猪实时定量PCR扩增的DNA序列TGTACGAGGCTGATGAATGGAGCTTCGTCCGTGGACAAACCCAAACCATCGATCGTTACTATGGACTCGGATTGGACACAACGATGCGCACCATATCACAGACGGACAB.4
肌肉生长抑制素基因敲除猪实时定量PCR扩增的DNA序列AGGGTAGGAAAGTGATTCAGGATCTATTGCTCGAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGTCGAGGGCCCCTGCAGGTCAATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTG
SN/T4737-2016
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
猪及其产品中特定转基因成分
实时定量PCR检测方法
SN/T4737-—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：(010)68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
印张0.75
字数16千字
2017年12月第一版
2017年12月第次印刷
印数1—500
书号：155066·2-32380
定价16.00元
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猪及其产品中特定转基因成分
实时定量PCR检测方法
Protocol of the real-time PCR for detecting genetically modified component inpigs and their derived products2016-12-12发布
中华人民共和国
玉家质量监督检验检疫总局
2017-07-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4737-—2016
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国农业科学研究院北京畜牧兽医研究所、中华人民共和国山东出入境检验检疫局
本标准主要起草人：林祥梅、王勤、李晓琳、朱振营、刘建、李奎、潘登科、孙敏、付伟、刘晓飞、梅琳、刘丹丹、仇松寅。
1范围
猪及其产品中特定转基因成分
实时定量PCR检测方法
本标准规定了猪及其产品中特定转基因成分的实时定量PCR检测方法。SN/T47372016
本标准适用于转脂肪酸去饱和酶基因转植酸酶基因、肌肉生长抑制素基因敲除猪及其产品的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修尊单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
APPA：植酸酶（Phytase）
实验室技术要求
MSTN：肌肉生长抑制素（Myostatin）PCR：聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction)
sFat-l：w-3脂肪酸去饱和酶基因（omeg）ta-3fattyaciddesaturase
TE：Tris-HCI、EDTA缓冲液
4防污染措施
猪及其产品中特定转基因成分实时定量PCR检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。
5实时定量PCR试验
5.1主要仪器
实时荧光定量PCR仪。
超净工作台。
消毒灭菌锅。
核酸蛋白分析仪。
高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机。低温冰箱，冷藏冷冻冰箱。
SN/T4737-—2016
纯水器，双蒸水器。
漩涡震荡器。
微量进样器：2.5L、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL。5.2主要试剂
实验用水：符合GB/T6682中一级水的规格。5.2.2
！TaqDNA聚合酶，三氯甲烷，异丙醇，异戊醇，70%乙醇，TE缓冲液，50倍TAE电泳浓缩缓冲液，细胞裂解缓冲液，蛋白酶K，醋酸钠（NaAc）。药品及试剂配制方法见附录A。5.3引物和探针
按照表1中提供的引物和探针序列合成引物及探针，配制成10pmol/μL用于PCR检测，扩增序列参见附录B。
表1检测转基因猪内外基因所需的引物序列被检测基因
Susβ2M
sFat-1
基因来源
猪内源
5.4试验步骤
5.4.1样品采集
引物序列
S'GAAGGTTCAGGTTTACTCACG3
STCAGCAAATCAATTTCAATCTG3
探针序列
5'CCCAGCGGAAAACGG
AAAGCCAA3
G'AGGGTAGGAAAGTGATTCAGGATCT35'TGCAGGTCAATTCT'CAGACTGCCTTGGGAAAAGC3
5'TGTTCGTTGGCAGGTTTTAC3\
5'AGATGGCTGGCAACTAGAAG3
STGTACGAGGCTGATGAATGG3'
5'TGTCCGTCTGTGATATGGTG3
5'TGAATGAAGCACGCA
TACCGGC3
5'TGTGTCCAATCCGAGT
CCATAGTAACGA3
采集动物的组织块作为检测样品，将其放入无菌Eppendorf管中，编号备用。采集过程中样品不得交叉污染，采集及样品前处理过程中应戴一次性手套。5.4.2样品存放
对于采集的样品放置在一70℃冰箱或液氮中，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。5.4.3样品核酸的提取
内参照
MSTN基因
敲除猪检测
转植酸酶
基因猪检测
转W-3脂
肪酸去饱和酶
基因检测
5.4.3.1取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加人1mL的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转人1.5mL离心管中，加人蛋白酶K（20mg/mL）和胰RNA酶（20mg/mL）各5uL，混勾。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转人37℃水浴12h24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000r/min离心5min，取上清液转人另一离心管中。5.4.3.2加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100uL吸头挑出，晾干，用200LTE重新溶解（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）5.4.3.3加等量的酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）至上清液中，振荡混勾，离心12000r/min，2
-irKAoNiKAca
5min。
SN/T4737—2016
取上层溶液至另一管，加人等体积的三氯甲烷，异戊醇（24：1)，振荡混勾，离心12000r/min，5.4.3.4
5min。
取上层溶液至另一管，加人1/10体积的3mol/LNaAc（pH5.2），加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min，离心12000r/min，10min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。5.4.3.6
用1mL70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000r/min，5min。5.4.3.7
小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。加100uLTE重新溶解沉淀物。
5.4.3.10也可采用其他等效的商业化试剂盒。5.4.4阴性对照、阳性对照和空自对照的设置阴性对照：非转基因猪及其加工产品。阳性对照：阳性转基因猪及其加工产品。空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以水代替样品），二是PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。
5.4.5实时定量PCR反应体系
实时定量PCR反应体系见表2，每个样品各做两个平行管。加样时应使样品DNA落液完全落入反应液中，离心机离心使溶液落于反应管底部。表2实时定量PCR反应体系
试剂名称
TaqMan探针法预混液
引物（上游）
引物（下游）
DNA模板
补水至
使用浓度
10pmol/μL
10pmol/μl
10pmol/μL
(20 ng/μL~30ng/μL)
注：表中DNA模板为原料的模板量，加工产品可视加工程度适当增加模板量5.4.6实时定量PCR反应参数
25μl反应体系加样体积/μl
1μ~2μ
预变性95℃.3min；95℃，5s.59℃，15s，72℃，15s，40个循环。不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。
5.4.7仪器检测通道的选择
PCR反应管荧光信号收集的设置，应与探针所标记的报告基团（可自由选择报告基团或者淬灭基团）一致，报告基团为FAM时，荧光信号收集应设在FAM通道；报告基团为HEX时，荧光信号收集应设在HEX通道：余类推，率灭基团为TAMRA。具体设置方法因仪器而异，可参照仪器使用说明书KAONKAca
SN/T4737-2016
5.4.8实时定量PCR反应运行
按预先设定的样品摆放顺序将PCR反应管依次摆放（上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器），开始运行仪器进行实时荧光定量PCR反应。5.5结果分析
5.5.1结果分析条件设定
阅值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阅值线刚好超过阴性对照样品扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线的指数增长期为准。5.5.2实时定量PCR检验的质量控制空白对照：内参照基因检测Ct值大于或等于40.并且无特定扩增曲线。阴性对照：内参照基因检测Ct值小于30，外源基因检测Cz值大于或等于40，并且无特定扩增曲线。
阳性对照：内参照基因检测Ct值<30.外源基因检测C值小于或等于34，并且出现特定扩增曲线。
上述指标有一项不符合者，应重做5.5.3结果描述与判定
在空白对照、阴性对照和阳性对照日阴性：待测样品外源基因检测Ct值大于或等于40，阳性：待测样品外源基因检测Ct值小于或等于
可疑：待测样品外源基因检测Ct值在3定核样晶不含有相应基因。
36.判定该样品含有相应基因。
~40之闻，判为可疑：可疑样品应重做，重做结果Ct值大于40为该样品不含有相应基因，否则判定该样品含有相应基因-TTKAoNiKAca
A.11mol/LTris-HCI缓冲液（pH8.0）附录A
（规范性附录）
药品及试剂配制方法
SN/T4737—2016
称取121.1gTris，溶于800mL双蒸水中，加人浓盐酸（浓度为138%的盐酸溶液）42mL，冷却至室温，用浓度为10%的盐酸溶液准确调节PH至8.0.加双蒸水定容至A.2500mmol/LEDTA(pH8.0
L，分装后高压灭菌备用。
在800mL水中加人186.1gEDTA-Na:2HIO.用磁力搅拌器剧烈搅拌至完全溶解，用氢氧化钠调节溶液pH至8.0（约需20g氢氧化钠颗粒），然后加双蒸水定容至1L，分装后高压灭菌备用。A.3TE缓冲液
量取1mol/LTris-HCl缓冲液下载标准就来标准下载网
mot/LEDTA(pH8.0)1mL500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水均勾混合，将溶液定容到500mL后，高温高压灭菌，空温保存。A.4酚：三氯甲烷：异戊醇（25
将Tris-HCl平衡苯酚与等体积的三氯甲烷/异戊醇（24
1)混合均勾后，移入棕色玻璃瓶中4℃保存。
A.550倍TAE电泳浓缩缓冲液
配制方法为取Tris242g冰醋酸57.1mL、0.5mol/LEDTA10mL，用5mol/L的HCl调制pH8.0，定容至1000mL。用前用双蒸水50倍稀释即可。A.63mol/L(NaAc)溶液
称40.8g的NaAc·3H,0加40mL去离子水溶解，用冰醋酸调节pH至5.2，最后定容至100mL。A.710%SDS
称取100gSDS加入900mL灭菌双蒸水中，68℃助溶，用浓HCI调节pH至7.2，定容至1L。A.85mol/LNaCI
称取58.4gNaCl溶于150mL灭菌双蒸水中，加水定容至200mL，高压灭菌，室温保存。5
rrKAoNiKAca
SN/T4737-2016
动物组织裂解缓冲液
量取1mol/LTris-HCl缓冲液（pH8.0)10mL,500mmol/LEDTA(pH8.0)10mL5mol/LNaCl30mL，10%SDS100mL~800mL（pH8.0）灭菌双蒸水中用5mol/L的HCl调制pH8.0，定容至1000mL
蛋白酶K
称取20mg蛋白酶K溶于1mL灭菌的双蒸水中，-20℃备用。A.11
胰RNA酶
称取20mg胰RNA酶溶于1mL灭菌的双蒸水中，-20℃备用。iiKAoNiKAca
附录B
（资料性附录）
实时定量PCR扩增的DNA序列
B.1猪β2M基因序列（GenBank：AF452448.1.3790-4006），SN/T4737—2016
GAAGGTTCAGGTTTACTCACGCCACCCAGCGGAAAACGGAAAGCCAAATTACCTGAACTGCTATGTATCTGGGTTCCATCCGCCCCAGATTGAAATTGATTTGCTGAB.2
转植酸酶基因猪实时定量PCR扩增的DNA序列TGTTCGTTGGCAGGTTTTACGCAAATCGTGAATGAAGCACGCATACCCGCTTGCAGTTTGTAAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTB.3转0-3脂肪酸去饱和酶基因猪实时定量PCR扩增的DNA序列TGTACGAGGCTGATGAATGGAGCTTCGTCCGTGGACAAACCCAAACCATCGATCGTTACTATGGACTCGGATTGGACACAACGATGCGCACCATATCACAGACGGACAB.4
肌肉生长抑制素基因敲除猪实时定量PCR扩增的DNA序列AGGGTAGGAAAGTGATTCAGGATCTATTGCTCGAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGTCGAGGGCCCCTGCAGGTCAATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTG
SN/T4737-2016
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
猪及其产品中特定转基因成分
实时定量PCR检测方法
SN/T4737-—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：(010)68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
印张0.75
字数16千字
2017年12月第一版
2017年12月第次印刷
印数1—500
书号：155066·2-32380
定价16.00元
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