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SN/T 4624.15-2016

基本信息

标准号: SN/T 4624.15-2016

中文名称:入境环保用微生物菌剂检测方法第15部分:解淀粉芽孢杆菌

标准类别:商检行业标准(SN)

标准状态:现行

出版语种:简体中文

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相关标签: 入境 环保 微生物 菌剂 检测 方法 淀粉 芽孢 杆菌

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标准简介

SN/T 4624.15-2016.Methods for examination of import microbial blends in the environmental protection-Part 15: Bacillus amyloliquifaciens.
1范围
SN/T 4624.15规定了入境环保用微生物菌剂符合性检验解淀粉芽孢杆菌的形态学鉴定、生化鉴定、分子生物学检测方法。
SN/T 4624.15适用于入境环保用微生物菌剂符合性检验解淀粉芽孢杆菌的检测和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3主要试剂和培养基
3.1 实验用水应符合GB/T 6682中- -级水的规格。
3.2 营养琼脂:见附录A中A.1。
3.3 营养肉汤:见A.2。
3.4 革兰氏染色法相关试剂:见A.3。
3.5 接触酶:见A.4。
3.6 氧化酶:见A.5。
3.7 糖发酵管:见A.6。
3.8 柠檬酸盐:见A.7。
3.9 硝酸盐还原:见A.8。
3.10 淀粉水解:见A.9。
3.11 明胶:见A.10。
3.12 TE缓冲液(pH8.0):见A.11。
4主要仪器和设备
4.1 电子天平(感量0.01g)。
4.2 恒温培养箱:36°C±1 °C、50°C±1 °C。
4.3 恒温振荡培养箱:36 °C±1 °C。
4.4恒温水浴锅。
4.5台 式冷冻离心机(最高转速15 000 r/min)。
4.6 PCR扩增仪。
4.7 生物显微镜:10×~100×(油镜)。
4.8 厌氧培养装置:36°C±1°C。
4.9微量移 液器和灭菌吸头:10μL、20μL、200μL、1000μL。
4.10高压灭菌锅。
4.11 PCR 工作台。

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标准内容

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4624.15—2016
入境环保用微生物菌剂检测方法第15部分:解淀粉芽孢杆菌
Methods for examination of import microbial blends in the environmentalprotection-Part 15:Bacillus amyloliquifaciens2016-08-23发布
中华人民共和国
宝家质量监督检验检疫总局
在质份
2017-03-01实施
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
入境环保用微生物菌剂检测方法第15部分:解淀粉芽孢杆菌
SN/T4624.15—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)68533533
网址spe.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×1230
2017年11月第一版
字数28千字
印张1
2017年11月第一次印刷
印数1—500
书号:155066·2-32280
定价18.00元
SN/T4624《入境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分:第1部分:地衣芽孢杆菌;
第2部分:短小芽孢杆菌;
第3部分:巨大芽孢杆菌;
第4部分:嗜酸氧化亚铁硫杆菌;第5部分:β型溶血性链球菌;
第6部分:金黄色葡萄球菌;
一第7部分:沙门氏菌;
第8部分:志贺氏菌;
第9部分:致泻大肠埃希氏菌;
第10部分:淡紫拟青霉;
第11部分:雅致小克银汉霍;
第12部分:哈茨木霉;
第13部分:黄孢原毛平革菌;
第14部分:焦曲霉;
第15部分:解淀粉芽孢杆菌;
第16部分:类产碱假单胞菌;
第17部分:恶臭假单胞菌。
本部分为SN/T4624的第15部分
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局本部分起草人:贾金生、周健楠、张欣媛、王金玲、张莹、王芳、李妹。SN/T4624.15—2016
1范围
入境环保用微生物菌剂检测方法第15部分:解淀粉芽孢杆菌
SN/T4624的本部分规定了境环保用微化鉴定、分子生物学检测方法。SN/T4624.15—2016
孢杆菌的形态学鉴定、生
本部分适用于入境环保用微生物菌剂符合性检验解淀粉芽孢杆菌的检测和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的,凡是注日期的引用文件,仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修收单)适用于本文GB/T6682分析实验空用水规格和试验方法3主要试剂和培养基
实验用水应符合GB/T6682中一级水的营养琼脂:见附录A中A.1。
营养肉汤:见A.2。
革兰氏染色法相关试剂:见A.3。接触酶:见A.4。
氧化酶:见A.5。
糖发酵管:见A.6。
柠檬酸盐:见A.7。
硝酸盐还原:见A.8。
淀粉水解:见A.9。
明胶:见A.10
TE缓冲液(pH8.0):见A,11。
1%~3%琼脂糖凝胶:见A.12。
25mmol/LEDTA见A.13。
3mol/L酷酸钠:见A.14。
dNTP:dATP、dTTPdGTPdCTP。
TBE见A.15。
Tag DNA聚合酶。
细菌基因组DNA提取试剂盒。
琼脂糖。
溴化乙锭。
DNA分子量标记:100bpDNAladder。-KAONiKAca
SN/T4624.15—2016
4主要仪器和设备
电子天平(感量0.01g)。
恒温培养箱:36℃±1℃、50℃±1℃。恒温振荡培养箱:36℃土1℃。
恒温水浴锅。
台式冷冻离心机(最高转速15000r/min)。4.6
PCR扩增仪。
生物显微镜:10×~-100×(油镜)。厌氧培养装置:36℃士1℃。
微量移液器和灭菌吸头:10L20L、200μ、1000。高压灭菌锅。
PCR工作台。
电泳仪。
核酸/蛋白分析仪。
凝胶成像系统。
无菌培养血:直径90mm。
5样品制备、培养
5.1以无菌操作取1g(ml)样品加入到100mL生理盐水中混匀,移取1环菌连续划线接种5个营养琼脂平板,36℃土1℃培养18h~24h。取样过程中,在样品旁边放置1个营养琼脂平板作为空白对照。
5.2挑取平板上3~5个白色、半透明的菌落进行形态学鉴定。5.3挑取符合形态学特征单菌落转营养琼脂平板纯培养,36℃土1℃条件下培养18h~24h;再从纯培养平板上挑取菌落接种营养肉汤,36℃士1℃条件下180r/min振荡培养18h~24h。6形态学鉴定
6.1培养性状
解淀粉芽孢杆菌在营养琼脂上的菌落白色、半透明到不透明,表面光滑。6.2形态特征
革兰氏染色及芽孢染色:将5.2中平板上的菌落做涂片进行革兰氏染色和芽染色,镜检,解淀粉芽孢杆菌为革兰氏阳性杆菌,细胞直径1m,内生孢子,芽孢不膨大,不形成伴胞晶体。生化鉴定法
取5.3中菌液利用细菌微量生化鉴定管进行生化鉴定,每管100叫L。解淀粉芽孢杆菌生化特征见表1
KAoNrKAca
鉴定项目
接触酶
氧化酶
厌氧生长
葡萄糖
L-阿拉伯糖
甘露醇
利用葡萄糖产气
利用柠檬酸盐
硝酸盐还原
50℃生长
PH5.7生长
7%NaCI生长
淀粉水解
明胶液化
8分子生物学检测
细菌模板DNA的提取
直接提取法
解淀粉芽孢杆菌生化特征
SN/T4624.15—2016
解淀粉芽孢杆菌
取5.3中菌液2mL加到2mL无菌离心管中,10000r/min离心2min,尽量弃净上清,沉淀加人TE100μL、10mg/mL溶菌酶100μL,37℃温育30min,12000r/min离心2min,沉淀加人TE缓冲液600μL重悬,再加入15mg/mL蛋白酶K25μL,55℃温育1h后沸水浴10min,12000r/min离心5min,取上清保存于一20℃保存以待检测。8.1.2
2有机溶剂提取法
取5.3中菌液2mL加到2mL无菌离心管中,10000r/min离心2min,尽量弃净上清,沉淀加人TE缓冲液570μL重悬,然后加人10mg/mL溶菌酶100μL,37℃温育30min,再加入10%SDS30μl,65℃温育10min,加入等体积的酚混匀,12000r/min离心10min,取上清移人一新离心管中,重复一次,两次酚抽提后取上清加等体积的酚/仿(1:1体积比)混匀,12000r/min离心10min,取上清再移人一新离心管中,加等体积的无水乙醇,1/10体积的3mol/L乙酸钠,轻缓颠倒混匀,12000r/min离心10min,弃上清,沉淀用500μL75%乙醇洗两次,离心管开盖室温放置数分钟使乙醇挥发,加人100μL无菌水,一20℃保存以待检测。8.1.3
试剂盒法
使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒,具体提取操作参照说明书进行。选择商业化试剂盒3
TKAONKAca
SN/T4624.15-—2016
的原则是所提取的DNA质量好并且提取率高。8.2DNA质量检测
将提取的DNA用1.0%的琼脂糖凝胶(含溴化乙锭或等效染料)进行完整性检测采用分光光度计法测定DNA的浓度和纯度。DNA浓度计算公式:DNA浓度(ng/μuL)=OD2o×50×核酸稀释倍数若OD26a/ODz在1.8~2.0之间,表明DNA纯度较好,可用于PCR检测。8.3PCR鉴定
引物序列
引物序列及扩增片段长度见表2。表2引物序列及扩增片段长度
解淀粉芽孢杆菌
反应体系
PCR反应体系见表3。
试剂名称
10×PCR缓冲液(含Mg2-)
dNTP(2.5mmol/1.)
TaqDNA聚合酶(5U/μL)
正向引物和反向引物(10μmol/L))DNA模板(50ng~200ng)
双蒸水
引物序列
5TCGGT
CACATCC
CATC-3
5'TTTGTCAGCGTGTC
PCR反应体系
补至25μL
扩增片段大小
1275bp
PCR反应体系
注:反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。8.3.3PCR反应条件
PCR扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s.50℃退火30s.72℃延伸1min,共35个循环;72℃最后延伸10min。
8.3.4空白对照、阴性对照和阳性对照设置阴性对照:非解淀粉芽孢杆菌DNA为模板;阳性对照:已知解淀芽孢杆菌的DNA(参见附录B)或含有待测基因序列的质粒为模板;空白对照:设两个,一是提取DNA时设置的提取空白对照(以等体积水代替样品),二是PCR反应的空白对照(以水代替DNA模板)。4
-iikAoNrKAca
8.3.5PCR扩增产物的电泳检测
SN/T4624.15—2016
用电泳缓冲液(0.5×TBE)制备1%琼脂糖凝胶,取5μLPCR扩增产物,和1L上样缓冲液混合,进行点样,DNAmarker(100bpDNAladder)做参照。3V/cm~5V/cm恒压电泳,电泳50min~60min,电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。8.3.6PCR扩增结果判定
8.3.6.1对照结果
阳性对照:出现1275bp的扩增条带阴性对照:未出现特征条带。
空白对照:未出现特征条带。
8.3.6.2检测结果
对照实验结果正常,待测样品出现1275bp扩增条带.则可判定该样品PCR扩增结果为阳性。对照实验结果正常,待测样品未出现1275bp扩增条带,则可判定该样品PCR扩增结果为阴性。对照实验结果异常,本次待测样品的结果无效,应重新做实验,并排除污染因素。9结果报告
当形态学鉴定、生化鉴定、分子生物学检测结果均符合时,报告检出解淀粉芽孢杆菌。当形态学鉴定、生化鉴定、分子生物学检测结果不符合时,建议重做。仍有不符合时,报告未检出解淀粉芽孢杆菌。
TKAoNIKAca
SN/T4624.15—2016
营养琼脂培养基
A,1.1成分
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
A.1.2制法
附录A
(规范性附录)
培养基和试剂
15g~20g
1000ml
将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内,加入15%氢氧化钠溶液约2mL校正pH至7.2~7.4。加入琼脂,加热煮沸,使琼脂溶化。分装烧瓶,121℃高压灭菌15min。A.2
营养肉汤
A.2.1成分
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
A.2.2制法
1000ml
将各成分溶解于蒸馏水内,加人15%氢氧化钠溶液校正pH至7.2~7.4,加热煮沸,分装烧瓶,121℃高压灭菌15min。
革兰氏染色法
A.3.1结晶紫染色液
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
将结晶紫溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。革兰氏碘液
碘化钾
蒸馏水
SN/T4624.15--2016
将碘与碘化钾先进行混合,加人蒸馅水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。A.3.3沙黄复染液
95%乙醇
蒸馏水
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。A.3.4染色法
A.3.4.1将涂片在火焰上固定,滴加结品紫染色液,染1min,水洗A.3.4.2滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。A.3.4.3
滴加95%乙醇脱色,约30s;或将乙醇滴满整个涂片,立即倾去,再用乙醇滴满整个涂片,脱色105。
A.3.4.4水洗,滴加复染液,复染1min。水洗,待干,镜检。A.3.5结果
革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阴性菌呈红色。A.4接触酶
A.4.1成分
3%过氧化氢溶液
A.4.2制法
挑取固体培养基上菌落一接种环,置于洁净试管内,滴加3%过氧化氢溶液2mL,观察结果。5氧化酶
A.5.1成分
1%盐酸二甲基对苯二胺溶液
1%α-萘酚-乙醇溶液
A.5.2制法
取白色洁净滤纸沾取菌落,加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴,阳性者呈现粉红色,并逐渐加深;再加α-萘酚溶液一滴,阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色,阴性于两分钟内不变色以毛细吸管吸取试剂,直接滴加于菌落上,其显色反应与以上相同。A.6
糖发酵管
A.6.1成分
牛肉膏
SN/T4624.15—2016
蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钠(NagHPO·12H2O)
0.2%滇麝香草酚蓝溶液
蒸馏水
A.6.2制法
1000mL
葡菌糖发酵管按上述成分配好后,按0.5%加人葡萄糖,分装于有一个倒置小管的小试管内,121℃高压灭菌15min。
其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100mL121℃高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液,同时高压灭菌。将5mL糖溶液加人丁100ml.培养基内,以无菌操作分装小试管。
注:蔗糖不纯,加热后会自行水解者,应采用过滤法除菌A.6.3试验方法
从琼脂斜面上挑取小量培养物接种,于36℃土1℃培养,一般观察2d3d。迟缓反应需观察14d~30 d。
柠檬酸盐利用
A.7.1成分
氯化钠
MgSO..7H20
磷酸二氢铵
磷酸氢二钾
柠檬酸钠
蒸馏水
0.2%溴香草酚蓝溶液
A.7.2制法
1000mL
先将盐类溶解于水内,校正pH,再加琼脂,加热溶化。然后加入指示剂,混合均匀后分装试管,121℃高压灭菌15min。放成斜面。A.8
硝酸盐还原
硝酸钾
蛋白陈
蒸馏水
1000ml
A.8.2制法
溶液,校正pH,分装试管,每管约5mL,121℃高压灭菌15min。A.8.3硝酸盐还原试剂
甲液:将对氨基苯磺酸0.8g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。乙液:将甲萘胺0.5g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。A.9淀粉水解
A.9.1成分
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
可溶性淀粉
蒸馏水
A.9.2制法
1000mL
SN/T4624.15-—2016
用少量水先将可溶性淀粉溶解,其他成分济化在蒸馏水中,校正pH。115℃高压灭菌15min。A.9.3试验方法
将细菌划线接种于可溶性淀粉琼脂平板上,在37℃培养24h。取出平板,在菌落处滴加碘液少许,能水解淀粉的细菌其菌落周围有透明的环观察。培养基呈深蓝色,说明淀粉未被水解,即淀粉酶阴性。(即淀粉酶阳性)。
牛肉浸膏
蛋白藤
蒸馏水bzxZ.net
2制法
1000ml
将前两种成分加热溶化到蒸馏水中,校正pH。在50℃~55℃缓慢加入明胶,边加边搅动,分装试管,每管5mL,115℃高压灭菌15min,制成高层。A.10.3
试验方法
挑取18h~24h待试菌培养物,大量穿刺接种明胶高层,36℃培养7d~14d,每天观察结果,看是9
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