SN/T 4624.10-2016.Methods for examination of import microbial blends in the environmental protection-Part 10: Paecilom yces lilacinus.
1范围
SN/T 4624.10规定了人境环保用微生物菌剂符合性检验淡紫拟青霉的形态学鉴定、实时荧光PCR检测方法。
SN/T 4624.10适用于人境环保用微生物菌剂符合性检验淡紫拟青霉检测和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3主要试剂和培养基
3.1实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。
3.2查氏琼脂:见附录 A中A.1。
3.3查氏 液体培养基:见A.2。
3.4 CTAB缓冲液:见A.3。
3.5 蛋白酶K。
3.6 Tris 饱和酚。
3.7 三氯甲烷。
3.8 异戊醇。
3.9 异丙醇。
3.10 TE缓冲液(pH 8.0):见A.4。
3.11 70%乙醇。
3.12溴化乙锭。
3.13 DNA分子量标记:1 000 bp DNA ladder。
3.14琼脂糖

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4624.10—2016
入境环保用微生物菌剂检测方法第10部分：淡紫拟青霉
Methods for examination of import microbial blends in the environmentalprotection-Part10:Paecilomyces lilacinus2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
入境环保用微生物菌剂检测方法第10部分：淡紫拟青霉
SN/T4624.102016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010)68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
2017年11月第一版
印张0.75
字数18千字
2017年11月第一次印刷
印数1-500
书号：155066：232294
定价16.00元
SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分：第1部分：地衣芽孢杆菌；
第2部分：短小芽孢杆菌；
第3部分：巨大芽孢杆菌；
第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌；第5部分：β型溶血性链球菌；
第6部分：金黄色葡萄球菌；
第7部分：沙门氏菌；
第8部分：志贺氏菌；
第9部分：致泻大肠埃希氏菌；
第10部分：淡紫拟青霉；
第11部分：雅致小克银汉霉；
第12部分：哈茨木霉；
第13部分：黄孢原毛平革菌；
第14部分：焦曲霉；
第15部分：解淀粉芽孢杆菌；
第16部分：类产碱假单胞菌；
第17部分：恶臭假单胞菌。
本部分为SN/T4624的第10部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4624.102016
本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、辽宁省农业科学院，本部分主要起草人：张莹、赵颖、张明、李靓、李瑶、陈芳、王芳。1范围
入境环保用微生物菌剂检测方法第10部分：淡紫拟青霉
SN/T4624.10—2016
SN/T4624的本部分规定了人境环保用微生物菌剂符合性检验淡紫拟青霉的形态学鉴定、实时荧光PCR检测方法。
本部分适用于人境环保用微生物菌剂符合性检验淡紫拟青霾检测和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3主要试剂和培养基
实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格S
查氏琼脂：见附录A中A,1。
查氏液体培养基：见A.2。
CTAB缓冲液：见A.3。
蛋白酶K。
Tris饱和酚。
三氯甲烷。
异戊醇。
异丙醇。
TE缓冲液（pH8.0）：见A.4。
70%乙醇。
漠化乙锭。
DNA分子量标记：1000bpDNAladder。琼脂糖。
50XTAE缓冲液（pH8.5）：见A.5RealMasterMix(2.5X，含ROX内参染料）。20×ProbeEnhancerSolution。
液氮。
4主要设备和材料
电子天平（感量0.01g）。
KAONIKAca
SN/T4624.10—2016
恒温培养箱：25℃±1℃。
4.3恒温振荡箱：25℃士1℃。
恒温水浴锅。
台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。4.6PCR超净工作台。
实时荧光PCR仪
微量移液器和灭菌吸头：10μ、20μl、200μL、1000。高压灭菌锅。
电泳仪装置。
核酸/蛋白分析仪。
凝胶成像系统。
陶瓷研钵。
无菌培养血：直径90mm。
灭菌三角烧瓶：500mL、250mL
接种棒、镍铬丝。
Eppendorf管和PCR反应管。
显微镜：物镜10×～100×。
5样品制备
5.1以无菌操作取1g（mL）样品加人到100mL无菌水中混勾，移取1环菌液连续划线接种5个查氏琼脂平板，25℃土1℃条件下培养5d～10d，观察琼脂平板上的菌落特征。取样过程中，在样品旁边放置1个查氏琼脂平板作为空白对照。5.2挑取单菌落划线接种在查氏琼脂平板上，25℃士1℃条件下培养5d～10d，得到纯化的菌株，进行形态学鉴定。
5.3挑取符合形态学特征单菌落转接查氏液体培养基中，25℃+1℃条件下180r/min振荡培养5d~10d,获得菌丝体。
6形态学鉴定
6.1培养性状
淡紫拟青霉在查氏琼脂平板上菌落平铺，质地絮状，白色，25℃土1℃条件下培养14d的菌落直径为5cm5.5cm；粉絮状的淡紫色菌落，背面浅褐色，无水溶色素。6.2形态特征
菌丝无色光滑，宽2.0um~3.5um分生抱子梗特化不明显，粗糙，（200um500±m）×（2.0um~2.5um)产孢瓶梗单生或簇生于分生孢子梗或其分枝上，在分生孢子梗上可着生1个～3个轮瓶梗簇，瓶梗烧瓶状，多数5um~12μm长，近基部膨大，宽1.6um~2.5μm，颈部细长。分生孢子近球形或宽梭形，无色，壁光滑，（2.1um~3.5μm）×（1.4um~2.4um）。无厚坦孢子。2
KAoNIKAca
7分子生物学检测
7.1模板DNA的提取
直接提取法
SN/T4624.10—2016
取5.3中菌液过滤抽干收集菌丝，取0.1g菌丝于液氮中研磨至粉未状，收集粉未于1.5mL离心管中，加500μLCTAB缓冲液（其中含0.1g蛋白酶K）混匀，65℃水浴1h；13000r/min离心5min~10min，保留上清液：加500LTris饱和酚：三氯甲烷：异戊醇（体积为25：24：1）混勺，13000r/min离心5min10min，保留上清液；加500μL三氯甲烷：异戊醇（体积为24：1）混匀，13000r/min离心5min~10min，保留上清液：加入1mL异丙醇混匀，一70℃下放置1h，或-20℃过夜；13000r/min离心30min，可见DNA沉淀；70%乙醇冲洗DNA沉淀，室温干燥用50μL～100pLTE溶解DNA，置于一20℃下保存备用。
7.1.2试剂盒法
使用商品化的真菌基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。选择商品化试剂盒的原则是所提取的DNA质量好并且提取率高。7.1.3DNA质量检测
将提取的DNA用1.0%的琼脂糖凝胶（含溴化乙锭或等效染料）进行完整性检测。采用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。DNA浓度计算公式：DNA浓度（ng/μL）=ODz。×50X核酸稀释倍数若OD260/ODza在1.8~2.0之间，表明DNA纯度较好，可用于实时荧光PCR检测。7.2实时荧光PCR鉴定
引物和探针序列
引物和探针序列见表1。其中探针的5'端标记FAM,3端标记TAMRA。表1引物和探针序列
淡紫拟
引物序列
5'-GACCCAAAACTCTTTTTGCATTACG-35'-AGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTG3实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表2。
探针序列
5'FAM-CCGGCGGAATTTCT
TCTCTGAGTTGC-TAMRA3
KAoNrKAca
SN/T4624.10—2016
试剂名称
2.5XReal Master Mix
正向引物（25pmol/pL）
反向引物（25pmol/μL）
探针（5pmol/μL）
20X Probe Enhancer solution
DNA模板
实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系
补充至25μL
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。7.2.3
实时荧光PCR反应参数
实时荧光PCR反应参数见表3.
表3实时荧光PCR反应参
注：使用不同实时荧光PCR仪，可对参数作适当调整。7.2.4空自对照、阴性对照和阳性对照设置阴性对照：非淡紫拟青霉DNA为模板：时间
起始模板变性
PCR循环中模板变性
阳性对照：已知淡紫拟青需的DNA（参见附录B)或含有待测基因序列的质粒为模板：空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是实时荧光PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。7.2.5实时荧光PCR扩增结果判定7.2.5.1
对照结果
阴性对照、阳性对照、空白对照结果应满足下列要求：阴性对照：无扩增曲线，Cl值40.0；阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct值应<30.0：空白对照：无扩增曲线，Ct值40.0。否则，检测视为无效。
TKAONTKAca
7.2.5.2结果判定
在阴性对照、阳性对照、空白对照均正常的情况下：Ct值≥40.0，可判定该样品实时荧光PCR结果为阴性：Ct值≤35.0，可判定该样品实时荧光PCR结果为阳性：SN/T4624.10—2016
35.0Ct值<40.0.建议重做。再次扩增后的目标基因Ct值仍小于40.0，且曲线有明显的对数增长期，并且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定为阳性：再次扩增后自标基因Ct值大于或等于40.0，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，可判定为阴性。结果报告
当形态学试验，实时荧光PCR检测试验结果均符合时，报告检出淡紫拟青霉。当形态学试验、实时荧光PCR检测试验出现不符合结果时，建议重做。仍不符合时，报告未检出淡紫拟青霉。
TTKAONIKAca
SN/T4624.10--2016
查氏琼脂
A.1.1成分
蔗糖（CH22On）
磷酸氢二钾（K,HPO,）
硫酸镁（MgSO4·7H,O)
氯化钾（KCI)
硫酸亚铁（FeSO，·4HO)
蒸馏水
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
1000ml
将以上成分混合加热溶化，调节pH至6.0~6.5，121℃高压灭菌15min。A.2
查氏液体培养基
燕糖（Cl,H22O）
磷酸氢二钾（K,HPO,）
硫酸镁（MgS0，·7H,0）
氯化钾(KCI)
硫酸亚铁（FeSO。·4HzO）
蒸馏水
2制法
1000mL
将以上成分混合加热溶化，调节pH至6.0～6.5，121高压灭菌15min。A.3CTAB缓冲液
A.3.1成分
氯化钠（NaCI）
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)
1mol/LTris-HCl(pH8.0)
0.5mol/L EDTA(pH8.0)
去离子水
SN/T4624.10—2016bzxZ.net
将以上成分混合溶化，用去离子水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min。A.4TE缓冲液
Tris碱
NaEDTA·2H,O
去离子水
A.4.2制法
1000mL
在800mL去离子水中，依次加入以上成分，调节pH至8.0，用去离子水定容到1L，分装后121℃高压灭菌15min。
50×TAE缓冲液
冰醋酸
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
去离子水
2制法
将以上成分混合溶化，用去离子水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min。SN/T4624.10—2016
（资料性附录）
淡紫拟青霉基因序列（GenBankAF368804）I gittccgtag gtgaacctgc ggagggatca ttaccgagtt atacaactcc caaacccact6l gtgaacctta cctcagttgc ctcggcggga acgccccggc cgccggcctc cgcgccggcg121 ccggacccag gcgcccgccg cagggaccca aaactcttt gcattacgcc cgccggcgga18l atttcttctc tgagttgcac aagcaaaaca aatgaatcaa aactttcaac aacggatctc24l ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat30l tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgcccgc cagcattctg gcgggcatgc36l ctgttcgagc gtcatttcaa ccctcgagcc cccccggggg cctcggtgttgggggacggc421acaccagccg cccccgaaat gcagtggcga ccccgccgca gcctcccctg cgtagtagca48l cacacctcgc accggagcgc ggaggcggtc acgccgtgaa acgcccaact ttettagagt54l tgacctcgga tcaggtagga atacccgcig aacttaagca tatSN/T4624.10-2016
书号：155066·2-32294
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