SN/T 1135.12-2015
基本信息
标准号： SN/T 1135.12-2015
中文名称：马铃薯M病毒检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 1135.12-2015.Detection and identification of Potato virus M.
1范围
SN/T 1135.12规定了马铃薯M病毒(PotatovirusM，PVM)的检疫鉴定方法。
SN/T 1135.12适用于可能带有PVM的马铃薯植株和繁殖材料的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3马铃薯M病毒基本信息
学名:Potato virus M
缩写:PVM
异名: Kartoffel- Rollmosaik virus, Ksrtoffel- K-virus, Potato interveinal mosaic virus, Potato leaf rolling mosaic virus，potato paracrinkle virus, Potato virus E, Solanum virus 11 ,Solanum virus 7。
分类地位:乙型线形病毒科( Beta flexiviridae),麝香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)。
传播途径:该病毒可通过汁液接触和蚜虫的非持久性传播。也可通过种薯、商品薯、组培苗等繁殖材料远距离传播。
马铃薯M病毒的其他信息参见附录A。
4方法原理
PVM的免疫原性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。依据PVM的免疫原性建立酶联免疫吸附(ELISA)方法;依据PVM的基因组特征建立RT-PCR。
5仪器设备、用具及试剂
5.1 仪器设备
酶标仪、PCR仪、电泳仪、生物安全柜、小型离心机、台式冷冻离心机、恒温水浴锅、凝胶成像系统、制冰机、常规冰箱、超低温冰箱、电子天平(1/1000g)、涡旋振荡器、恒温培养箱等。
1范围
SN/T 1135.12规定了马铃薯M病毒(PotatovirusM，PVM)的检疫鉴定方法。
SN/T 1135.12适用于可能带有PVM的马铃薯植株和繁殖材料的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3马铃薯M病毒基本信息
学名:Potato virus M
缩写:PVM
异名: Kartoffel- Rollmosaik virus, Ksrtoffel- K-virus, Potato interveinal mosaic virus, Potato leaf rolling mosaic virus，potato paracrinkle virus, Potato virus E, Solanum virus 11 ,Solanum virus 7。
分类地位:乙型线形病毒科( Beta flexiviridae),麝香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)。
传播途径:该病毒可通过汁液接触和蚜虫的非持久性传播。也可通过种薯、商品薯、组培苗等繁殖材料远距离传播。
马铃薯M病毒的其他信息参见附录A。
4方法原理
PVM的免疫原性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。依据PVM的免疫原性建立酶联免疫吸附(ELISA)方法;依据PVM的基因组特征建立RT-PCR。
5仪器设备、用具及试剂
5.1 仪器设备
酶标仪、PCR仪、电泳仪、生物安全柜、小型离心机、台式冷冻离心机、恒温水浴锅、凝胶成像系统、制冰机、常规冰箱、超低温冰箱、电子天平(1/1000g)、涡旋振荡器、恒温培养箱等。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1135.12—2015
马铃薯M病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of Potato virus M2015-12-04发布
中华人民共和国
宝家质量监督检验检疫总局
2016-07-01实施
SN/T1135共分为13部分：
第1部分：马铃薯癌肿病检疫鉴定方法；第2部分：马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法；第3部分：马铃薯带顶病毒检疫鉴定方法：第4部分：马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法；第5部分：马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法；第6部分：马铃薯维腐病菌检疫鉴定方法；第7部分：马铃薯A病毒检疫鉴定方法；第8部分：马铃薯坏疽病菌检疫鉴定方法；第9部分：马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法；第10部分：马铃薯V病毒检疫鉴定方法；第11部分：马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法；第12部分：马铃薯M病毒检疫鉴定方法；第13部分：马铃薯Y病毒检疫鉴定方法。本部分为SN/T1135的第12部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T1135.12—2015
本部分起草单位：中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、河南省农业科学院农业经济与信息研究所。本部分主要起草人：刘忠梅、刘洪义、徐义刚、马微、张永江、燕照玲、马云霞、吴渺渺、李明福、周志强、张洪祥、杨立群。
1范围
马铃薯M病毒检疫鉴定方法
SN/T1135.12—2015
SN/T1135的本部分规定了马铃薯M病毒（PotatovirusM,PVM)的检疫鉴定方法。本部分适用于可能带有PVM的马铃薯植株和繁殖材料的检疫鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3马铃薯M病毒基本信息
学名：Potatovirus M
缩写：PVM
异名：Kartoffel-Rollnosaik virus,KsrtoffelK-virus,Potato interveinalmosaic virus,Potato leafrolling mosaic virus,potato paracrinkle virus,Potato virus E,Solanum virus ll,Solanum virus 7。分类地位：乙型线形病毒科（Betafleriviridae），麝香石竹潜隐病毒属（Carlavirus），传播途径：该病毒可通过汁液接触和蚜虫的非持久性传播。也可通过种薯、商品薯、组培苗等繁殖材料远距离传播。
马铃薯M病毒的其他信息参见附录A，4方法原理
PVM的免疫原性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。依据PVM的免疫原性建立酶联免疫吸附（ELISA）方法：依据PVM的基因组特征建立RT-PCR。5仪器设备，用具及试剂
5.1仪器设备
酶标仪、PCR仪、电泳仪、生物安全柜、小型离心机、台式冷冻离心机、恒温水浴锅、凝胶成像系统、制冰机、常规冰箱、超低温冰箱、电子天平（1/1000g）、涡旋振荡器、恒温培养箱等。5.2用具
可调移液器（0.1~2.5μ，2μL~20μL，10μ100，20μ~200μ，100μl~1000u）和可调移液器头，离心管，研钵，微型磨杆。5.3试剂
酶联免疫吸附测定试剂见附录B,RT-PCR检测试剂见附录C1
SN/T 1135.12-—2015
6抽样与样品制备
6.1现场检疫
抽样方法参照SN/T2122中规定的方法进行。6.2薯块样品制备
将种薯或商品薯（重点挑取畸形、不成熟的薯块）播于灭菌土中，于25℃左右生长并进行症状观察。待长出3片～4片真叶后将表现症状的植株编号，末表现症状的植株分组（10株为一组）并编号。采集叶片用于酶联免疫测定、RT-PCR检测6.3组培苗样品制备
将组培苗种植于隔离温室中，干25-左右生长并进行症状观察症状的分组检测，分组方法和检测方法同6.2。7检疫鉴定方法
7.1双抗夹心酶联免疫吸附检测（DAS-ELISA）有症状的组培苗单独检测。没有双抗体夹心法见附录B。如果使用试剂盒，应按照说明书进行操作。7.2RT-PCR检测
具体操作步骤见附录C。
8结果判定
8.1无可疑症状的样品，样品终DASELISA或RT-PCR检测为阴性
判断样品不携带PVM。有可疑
R后，两项结果均为阴性时则判断样品不带有PVM。症状的样品，经DAS-ELISA和RTPC8.2样品经DAS-ELISA检测为阳性品携带PVM
9样品保存
9.1结果记录与资料保存
列测定分析为目的序列，可判定样RT-PCR结果阳性，且序
完整的实验记录要包括：样品的来源、种类、时间、实验检测时间、地点、方法和结果，并有实验人员的签字；酶联测定需有酶联反应的原始数据，RT-PCR检测电泳结果图片，RTPCR检测结果为阳性的序列测定分析结果。
9.2样品保存
阳性样品直接放于一80℃冰箱或冷冻干燥后放于一80℃冰箱保存1年，保存的样品要做好标记和登记工作。以备复验、谈判和仲裁。保存期满后，需经灭活处理。2
-iKAoNikAca
A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
马铃薯M病毒其他信息
SN/T1135.12—2015
马铃薯的自然寄主范围较窄，主要为茄科。已知的植物有马铃薯（Solanumtuberosum），德伯尼烟（Nicotianadebneyi），千日红（Gomphrenaglobosa），番茄（Lycopersiconesculentum），洋金花（又名白花曼陀罗）（Daturametel）、黄花刺茄（又名刺萼龙葵）（Solanumrostratum）、菜豆（又名红芸豆）Phaseolusvulgaris），人参果（Solanummuricatum）。A.2地理分布
美国、英国、德国、法国、荷兰、加拿大、墨西哥、埃及、马拉维、阿根廷、巴西、智利、爱沙尼亚、奥地利白俄罗斯、保加利亚、波兰、丹麦、俄罗斯、芬兰、荷兰、捷克、斯洛伐克、拉脱维亚、罗马尼亚、前南斯拉夫、瑞典、牙利、意大利、巴基斯坦、哈萨克斯坦、韩国、日木、塞浦路斯、印度、印度尼西亚、中国及大洋洲。
A.3危害症状
依PVM株系和品种不同，感病症状有一定差异。其强株系侵染后，马铃薯幼苗期小叶表面带有油脂状光泽，同时小叶迅速开始向下卷曲，叶背出现条斑坏死，随着马铃薯生长发育，下部叶片出现不规则的坏死斑点，并很快黄化至干枯，枯叶下垂现象似马铃薯Y病毒（PVY）的重垂叶坏死症，病株严重萎缩和矮化，其株高只相当于健株的1/3高度，叶背向卷曲似马铃薯卷叶病毒（PLRV）。PVM的弱毒株系侵染马铃薯后，常引起病株小叶脉间花叶，小叶尖端稍扭曲，叶缘呈波状，病株顶叶有些卷叶或叶面表现无光泽。图A.1为PVM侵染马铃薯植株的症状注：引自http://eestikartul.ee/kasvatus/kartulihaigused图A.1PVM侵染马铃薯植株的症状3
iiKAoNiKAca
SN/T1135.122015
A.4基因组
病毒粒体为病毒粒体微曲线状，大小约650nm×12n.单链正义RNA，全长8526bp，含6个开放阅读框（ORF），分别编码复制酶蛋白、运动蛋白三基因框、外壳蛋白及富含半胱氨酸的蛋白。目前GenBank已登录有PVM全基因组序列。4
-KAoNKAca
B.1试材
酶联板
附录B
（规范性附录）
双抗体夹心酶联免疫吸附测定
使用质量有保证厂商生产的酶联板。B.1.2
包被抗体
特异性的PVM抗体。
酶标抗体
碱性磷酸酯酶标记的PVM抗体
B.1.4底物
对硝基苯磷酸二钠（pNPP)。
B.1.5PBST缓冲液（洗涤缓冲液pH7.4）NacI
Na,HPO
吐温-20（Tween-20)
蒸馆水定容至1L，
样品抽提缓冲液（pH7.4）
PVP(MW24000~40000)
4℃储存。
B.1.7包被缓冲液（pH9.6）
NazcOg
蒸馏水定容至1L，4℃储存。
SN/T1135.12—2015
-TTKAONKAca
SN/T1135.12—2015
B.1.8酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4)PBST
BSA(牛血清白蛋白）或脱脂奶粉2.0g
PVP(MW2400040000)Www.bzxZ.net
4℃储存。
B.1.9底物（pNPP）缓冲液（pH9.8）NaN
二乙醇胺
1I调pH值至9.8.蒸馅水定容至1L，4℃储存。溶于800ml.蒸馏水中，用H
B.2操作步骤
B.2.1包被抗体
用包被缓冲液将抗体按说明稀释.加人酶联板的孔中100L孔礼，酶联板加盖或用保鲜膜包好，37℃孵育2h或4℃冰箱孵育过夜清空孔中溶液，PBST洗涤3次每次3min。B.2.2样品制备
待测样品按1：10（质量：体积）加抽提缓冲液·用研钵研磨成浆，4000g离心10min，上清液即作相应的处理或按照说明书进行。为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照
B.2.3加样
加人制备好的检测样品、阴性对照阳性对
十照100
红/孔，
样品设2个重复，加盖后于37℃孵联板孔中溶液控干，用PBST洗涤3次，每次3min。育2h4h或4℃冰箱孵育过夜，将酶B.2.4加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作液度，并加入到酶联板中，100uI孔，加盖37℃孵育4h，将酶联板孔中溶液控干，PBST洗涤3次，每次3min。B.2.5加底物
将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/ml（现配现用），按10ouL/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育约0.5h2h，直至阳性对照出现明显的颜色反应，而阴性对照和空白对照无颜色变化。
B.2.6读数
在不同的时间内如30min，1h、2h或更长时间.用酶联仪在405nm处读OD值并记录。B.3结果判断
B.3.1对照孔的OD465值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：6
-iiKAoNiiKAca
SN/T1135.12—2015
缓冲液孔和阴性对照孔的OD40s值0.15，当阴性对照孔的OD4os值0.05时，按0.05计算：阳性对照OD405值/阴性对照OD40s值>5并且<10；同一样品的重复性基本一致。B.3.2在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上可判断如下：样品ODA0s值/阴性对照OD10s值>2，判为阳性；样品OD405值/阴性对照OD4e5值在阈值附近，判为可疑样品，应重新做一次，或用其他方法加以验证：样品OD405值/阴性对照OD405值<2，判为阴性B.3.3若满足不了B.3.1质量要求，则不能进行结果判断。SN/T1135.12—2015
C.1试剂
商业化试剂
附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测
核酸提取试剂为Trizol试剂.M-MLV反转录酶和RNA酶抑制剂.PCR试剂C.1.2TAE缓冲液
Tris-HAe
EDTA(pH8.0)
6×加样缓冲液
溴酚蓝
熊糖水溶液
实验步骤
总RNA提取
40mmol/L
1mmol/L
取o.1g待测样品组织，用液氮研磨成粉末状，加入1mLTrizol.待溶解后继续研磨至混勾，移人1.5mL离心管中，室温静置5min：4℃，12000g离心10min以除去不溶成分，将上清液转人一新的1.5ml离心管中；加人200μL三氯中烷，剧烈振荡15s.室温静置2min：4℃，12000g离心10min，小心吸取上层水相到新离心管中；加人等体积异丙醇，颠倒混·室温放置10min；4℃，12000g离心20min，弃上清液；加人1mL75%冷乙醇洗涤沉淀，4℃12000g离心1min，弃乙醇，充分T燥沉淀：加人20LDEPC处理的超纯水（DEPC-H，O），溶解沉淀，存丁一80℃备用。也可按照商品RNA提取试剂盒进行操作。C.2.2
引物序列
正向引物PVM-F.5-CGCATATATGTGAACCTGGA-3*反向引物PVM-R：5-TCTTTGTGCGTATTGTGAGC-3扩增片断长度约416bp。
C.2.3反转录合成cDNA
反转录体系见表C.1
20umol/L反向引物
5×反转录反应缓冲液
10mmal/L dNTPs
试剂名称
反转录体系
SN/T 1135.12—2015
加样体积/l
在70℃温育5min，然后立即置于冰上，放置5min4
40U/uL.RNA抑制剂
200U/μLM-MLV反转录酶
补DEPC-H,0至
反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。反应参数：42℃，45min；95℃，10min，合成的cDNA置于一20℃保存备用。C.2.4PCR扩增
PCR反应以cDNA为模板进行扩增，每个样品设2个平行处理。以健康植物材料为阴性对照，以ddHO为空白对照。PCR反应体系见表C.2。也可采用RT-PCR一步法试剂盒，操作步骤按使用说明进行。
试剂名称
10XPCR反应缓冲液
25mmol/LMgCl（反应缓冲液中已含有的可不加人）5mmol/LdNTPs
20μmol/L正向引物
20umol/L反向引物
5U/μLTagDNA聚合酶
CDNA模板
补H.O至
PCR反应体系
加样体积/μL
PCR反应条件：94℃3min：94℃30s.57℃30s.72℃40s，35个循环：72℃10min延伸。C.2.5琼脂糖凝胶电泳检测
将制胶板同制好的琼脂糖凝胶一并放入水平电泳槽，取5uL扩增反应物加1μL的6×溴酚蓝上样缓冲液混匀·以及2uL100bPDNA分子量标准物分别点人样孔内，电泳缓冲液1XTAE适量，100V,电泳30min。
结果观察
电泳结束后，将整个凝胶置于凝胶成像系统上拍照，记录结果9
SN/T1135.12—2015
结果判定
如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期416bp的条带，样品未出现预期大小C.3.1
的条带，则可判定样品为PVM阴性。如果阴性对照和空白对照未出现条带.阳性对照出现预期416bp的条带，样品出现相同大小的C.3.2
条带，可通过对PCR产物序列的测定和BLAST分析进一步确认。如果PCR产物序列与PVM的序列同源，则可判定样品为PVM阳性，若序列不同源，则可判定样品为PVM阴性。10
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马铃薯M病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of Potato virus M2015-12-04发布
中华人民共和国
宝家质量监督检验检疫总局
2016-07-01实施
SN/T1135共分为13部分：
第1部分：马铃薯癌肿病检疫鉴定方法；第2部分：马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法；第3部分：马铃薯带顶病毒检疫鉴定方法：第4部分：马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法；第5部分：马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法；第6部分：马铃薯维腐病菌检疫鉴定方法；第7部分：马铃薯A病毒检疫鉴定方法；第8部分：马铃薯坏疽病菌检疫鉴定方法；第9部分：马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法；第10部分：马铃薯V病毒检疫鉴定方法；第11部分：马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法；第12部分：马铃薯M病毒检疫鉴定方法；第13部分：马铃薯Y病毒检疫鉴定方法。本部分为SN/T1135的第12部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T1135.12—2015
本部分起草单位：中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、河南省农业科学院农业经济与信息研究所。本部分主要起草人：刘忠梅、刘洪义、徐义刚、马微、张永江、燕照玲、马云霞、吴渺渺、李明福、周志强、张洪祥、杨立群。
1范围
马铃薯M病毒检疫鉴定方法
SN/T1135.12—2015
SN/T1135的本部分规定了马铃薯M病毒（PotatovirusM,PVM)的检疫鉴定方法。本部分适用于可能带有PVM的马铃薯植株和繁殖材料的检疫鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3马铃薯M病毒基本信息
学名：Potatovirus M
缩写：PVM
异名：Kartoffel-Rollnosaik virus,KsrtoffelK-virus,Potato interveinalmosaic virus,Potato leafrolling mosaic virus,potato paracrinkle virus,Potato virus E,Solanum virus ll,Solanum virus 7。分类地位：乙型线形病毒科（Betafleriviridae），麝香石竹潜隐病毒属（Carlavirus），传播途径：该病毒可通过汁液接触和蚜虫的非持久性传播。也可通过种薯、商品薯、组培苗等繁殖材料远距离传播。
马铃薯M病毒的其他信息参见附录A，4方法原理
PVM的免疫原性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。依据PVM的免疫原性建立酶联免疫吸附（ELISA）方法：依据PVM的基因组特征建立RT-PCR。5仪器设备，用具及试剂
5.1仪器设备
酶标仪、PCR仪、电泳仪、生物安全柜、小型离心机、台式冷冻离心机、恒温水浴锅、凝胶成像系统、制冰机、常规冰箱、超低温冰箱、电子天平（1/1000g）、涡旋振荡器、恒温培养箱等。5.2用具
可调移液器（0.1~2.5μ，2μL~20μL，10μ100，20μ~200μ，100μl~1000u）和可调移液器头，离心管，研钵，微型磨杆。5.3试剂
酶联免疫吸附测定试剂见附录B,RT-PCR检测试剂见附录C1
SN/T 1135.12-—2015
6抽样与样品制备
6.1现场检疫
抽样方法参照SN/T2122中规定的方法进行。6.2薯块样品制备
将种薯或商品薯（重点挑取畸形、不成熟的薯块）播于灭菌土中，于25℃左右生长并进行症状观察。待长出3片～4片真叶后将表现症状的植株编号，末表现症状的植株分组（10株为一组）并编号。采集叶片用于酶联免疫测定、RT-PCR检测6.3组培苗样品制备
将组培苗种植于隔离温室中，干25-左右生长并进行症状观察症状的分组检测，分组方法和检测方法同6.2。7检疫鉴定方法
7.1双抗夹心酶联免疫吸附检测（DAS-ELISA）有症状的组培苗单独检测。没有双抗体夹心法见附录B。如果使用试剂盒，应按照说明书进行操作。7.2RT-PCR检测
具体操作步骤见附录C。
8结果判定
8.1无可疑症状的样品，样品终DASELISA或RT-PCR检测为阴性
判断样品不携带PVM。有可疑
R后，两项结果均为阴性时则判断样品不带有PVM。症状的样品，经DAS-ELISA和RTPC8.2样品经DAS-ELISA检测为阳性品携带PVM
9样品保存
9.1结果记录与资料保存
列测定分析为目的序列，可判定样RT-PCR结果阳性，且序
完整的实验记录要包括：样品的来源、种类、时间、实验检测时间、地点、方法和结果，并有实验人员的签字；酶联测定需有酶联反应的原始数据，RT-PCR检测电泳结果图片，RTPCR检测结果为阳性的序列测定分析结果。
9.2样品保存
阳性样品直接放于一80℃冰箱或冷冻干燥后放于一80℃冰箱保存1年，保存的样品要做好标记和登记工作。以备复验、谈判和仲裁。保存期满后，需经灭活处理。2
-iKAoNikAca
A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
马铃薯M病毒其他信息
SN/T1135.12—2015
马铃薯的自然寄主范围较窄，主要为茄科。已知的植物有马铃薯（Solanumtuberosum），德伯尼烟（Nicotianadebneyi），千日红（Gomphrenaglobosa），番茄（Lycopersiconesculentum），洋金花（又名白花曼陀罗）（Daturametel）、黄花刺茄（又名刺萼龙葵）（Solanumrostratum）、菜豆（又名红芸豆）Phaseolusvulgaris），人参果（Solanummuricatum）。A.2地理分布
美国、英国、德国、法国、荷兰、加拿大、墨西哥、埃及、马拉维、阿根廷、巴西、智利、爱沙尼亚、奥地利白俄罗斯、保加利亚、波兰、丹麦、俄罗斯、芬兰、荷兰、捷克、斯洛伐克、拉脱维亚、罗马尼亚、前南斯拉夫、瑞典、牙利、意大利、巴基斯坦、哈萨克斯坦、韩国、日木、塞浦路斯、印度、印度尼西亚、中国及大洋洲。
A.3危害症状
依PVM株系和品种不同，感病症状有一定差异。其强株系侵染后，马铃薯幼苗期小叶表面带有油脂状光泽，同时小叶迅速开始向下卷曲，叶背出现条斑坏死，随着马铃薯生长发育，下部叶片出现不规则的坏死斑点，并很快黄化至干枯，枯叶下垂现象似马铃薯Y病毒（PVY）的重垂叶坏死症，病株严重萎缩和矮化，其株高只相当于健株的1/3高度，叶背向卷曲似马铃薯卷叶病毒（PLRV）。PVM的弱毒株系侵染马铃薯后，常引起病株小叶脉间花叶，小叶尖端稍扭曲，叶缘呈波状，病株顶叶有些卷叶或叶面表现无光泽。图A.1为PVM侵染马铃薯植株的症状注：引自http://eestikartul.ee/kasvatus/kartulihaigused图A.1PVM侵染马铃薯植株的症状3
iiKAoNiKAca
SN/T1135.122015
A.4基因组
病毒粒体为病毒粒体微曲线状，大小约650nm×12n.单链正义RNA，全长8526bp，含6个开放阅读框（ORF），分别编码复制酶蛋白、运动蛋白三基因框、外壳蛋白及富含半胱氨酸的蛋白。目前GenBank已登录有PVM全基因组序列。4
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B.1试材
酶联板
附录B
（规范性附录）
双抗体夹心酶联免疫吸附测定
使用质量有保证厂商生产的酶联板。B.1.2
包被抗体
特异性的PVM抗体。
酶标抗体
碱性磷酸酯酶标记的PVM抗体
B.1.4底物
对硝基苯磷酸二钠（pNPP)。
B.1.5PBST缓冲液（洗涤缓冲液pH7.4）NacI
Na,HPO
吐温-20（Tween-20)
蒸馆水定容至1L，
样品抽提缓冲液（pH7.4）
PVP(MW24000~40000)
4℃储存。
B.1.7包被缓冲液（pH9.6）
NazcOg
蒸馏水定容至1L，4℃储存。
SN/T1135.12—2015
-TTKAONKAca
SN/T1135.12—2015
B.1.8酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4)PBST
BSA(牛血清白蛋白）或脱脂奶粉2.0g
PVP(MW2400040000)Www.bzxZ.net
4℃储存。
B.1.9底物（pNPP）缓冲液（pH9.8）NaN
二乙醇胺
1I调pH值至9.8.蒸馅水定容至1L，4℃储存。溶于800ml.蒸馏水中，用H
B.2操作步骤
B.2.1包被抗体
用包被缓冲液将抗体按说明稀释.加人酶联板的孔中100L孔礼，酶联板加盖或用保鲜膜包好，37℃孵育2h或4℃冰箱孵育过夜清空孔中溶液，PBST洗涤3次每次3min。B.2.2样品制备
待测样品按1：10（质量：体积）加抽提缓冲液·用研钵研磨成浆，4000g离心10min，上清液即作相应的处理或按照说明书进行。为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照
B.2.3加样
加人制备好的检测样品、阴性对照阳性对
十照100
红/孔，
样品设2个重复，加盖后于37℃孵联板孔中溶液控干，用PBST洗涤3次，每次3min。育2h4h或4℃冰箱孵育过夜，将酶B.2.4加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作液度，并加入到酶联板中，100uI孔，加盖37℃孵育4h，将酶联板孔中溶液控干，PBST洗涤3次，每次3min。B.2.5加底物
将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/ml（现配现用），按10ouL/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育约0.5h2h，直至阳性对照出现明显的颜色反应，而阴性对照和空白对照无颜色变化。
B.2.6读数
在不同的时间内如30min，1h、2h或更长时间.用酶联仪在405nm处读OD值并记录。B.3结果判断
B.3.1对照孔的OD465值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：6
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SN/T1135.12—2015
缓冲液孔和阴性对照孔的OD40s值0.15，当阴性对照孔的OD4os值0.05时，按0.05计算：阳性对照OD405值/阴性对照OD40s值>5并且<10；同一样品的重复性基本一致。B.3.2在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上可判断如下：样品ODA0s值/阴性对照OD10s值>2，判为阳性；样品OD405值/阴性对照OD4e5值在阈值附近，判为可疑样品，应重新做一次，或用其他方法加以验证：样品OD405值/阴性对照OD405值<2，判为阴性B.3.3若满足不了B.3.1质量要求，则不能进行结果判断。SN/T1135.12—2015
C.1试剂
商业化试剂
附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测
核酸提取试剂为Trizol试剂.M-MLV反转录酶和RNA酶抑制剂.PCR试剂C.1.2TAE缓冲液
Tris-HAe
EDTA(pH8.0)
6×加样缓冲液
溴酚蓝
熊糖水溶液
实验步骤
总RNA提取
40mmol/L
1mmol/L
取o.1g待测样品组织，用液氮研磨成粉末状，加入1mLTrizol.待溶解后继续研磨至混勾，移人1.5mL离心管中，室温静置5min：4℃，12000g离心10min以除去不溶成分，将上清液转人一新的1.5ml离心管中；加人200μL三氯中烷，剧烈振荡15s.室温静置2min：4℃，12000g离心10min，小心吸取上层水相到新离心管中；加人等体积异丙醇，颠倒混·室温放置10min；4℃，12000g离心20min，弃上清液；加人1mL75%冷乙醇洗涤沉淀，4℃12000g离心1min，弃乙醇，充分T燥沉淀：加人20LDEPC处理的超纯水（DEPC-H，O），溶解沉淀，存丁一80℃备用。也可按照商品RNA提取试剂盒进行操作。C.2.2
引物序列
正向引物PVM-F.5-CGCATATATGTGAACCTGGA-3*反向引物PVM-R：5-TCTTTGTGCGTATTGTGAGC-3扩增片断长度约416bp。
C.2.3反转录合成cDNA
反转录体系见表C.1
20umol/L反向引物
5×反转录反应缓冲液
10mmal/L dNTPs
试剂名称
反转录体系
SN/T 1135.12—2015
加样体积/l
在70℃温育5min，然后立即置于冰上，放置5min4
40U/uL.RNA抑制剂
200U/μLM-MLV反转录酶
补DEPC-H,0至
反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。反应参数：42℃，45min；95℃，10min，合成的cDNA置于一20℃保存备用。C.2.4PCR扩增
PCR反应以cDNA为模板进行扩增，每个样品设2个平行处理。以健康植物材料为阴性对照，以ddHO为空白对照。PCR反应体系见表C.2。也可采用RT-PCR一步法试剂盒，操作步骤按使用说明进行。
试剂名称
10XPCR反应缓冲液
25mmol/LMgCl（反应缓冲液中已含有的可不加人）5mmol/LdNTPs
20μmol/L正向引物
20umol/L反向引物
5U/μLTagDNA聚合酶
CDNA模板
补H.O至
PCR反应体系
加样体积/μL
PCR反应条件：94℃3min：94℃30s.57℃30s.72℃40s，35个循环：72℃10min延伸。C.2.5琼脂糖凝胶电泳检测
将制胶板同制好的琼脂糖凝胶一并放入水平电泳槽，取5uL扩增反应物加1μL的6×溴酚蓝上样缓冲液混匀·以及2uL100bPDNA分子量标准物分别点人样孔内，电泳缓冲液1XTAE适量，100V,电泳30min。
结果观察
电泳结束后，将整个凝胶置于凝胶成像系统上拍照，记录结果9
SN/T1135.12—2015
结果判定
如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期416bp的条带，样品未出现预期大小C.3.1
的条带，则可判定样品为PVM阴性。如果阴性对照和空白对照未出现条带.阳性对照出现预期416bp的条带，样品出现相同大小的C.3.2
条带，可通过对PCR产物序列的测定和BLAST分析进一步确认。如果PCR产物序列与PVM的序列同源，则可判定样品为PVM阳性，若序列不同源，则可判定样品为PVM阴性。10
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