SN/T 2374-2009.Protocol of inspection for biopesticides of Metarhizium and Beauveria.
1范围
SN/T 2374规定了进出口绿僵菌(Metarhizium)和白僵菌(Beauveria)生物农药的抽样和品质检验方法。
SN/T 2374适用于绿僵菌(Metarhizium)和白僵菌(Beauveria)生物农药的母药、油悬浮剂、可湿性粉剂等生物农药产品的抽样与检验。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用本标准。然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。
GB/T 1601农药 pH值的测定方法
GB/T 1605商 品农药采样方法
GB/T5451农药可湿性粉剂润湿性测定方法
GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定
GB/T 14825农药悬浮率测定 方法
GB/T 16150农药粉剂、 可湿性粉剂细度测定方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1分生孢子conidium
真菌无性繁殖从分生孢子梗顶端或侧面产生并且成熟时脱落的单细胞或多细胞的孢子。
3.2含孢量quantity of conidium
每毫升油悬浮剂或每克粉剂所含真菌孢子的数量,用于表示真菌的有效成分。
3.3活孢率percentage of living conidium
即孢子萌发率,指在一定培养条件下萌发的真菌孢子数占总孢子数的百分率。
3.4杂菌率percentage of untarget microorganism
被测真菌生物农药中除了活性组分真菌外其他真菌量占总菌量的含量。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2374—-2009
绿僵菌、自僵菌生物农药检验操作规程Protocol of inspection for biopesticides of Metarhizium and Beauveria2009-09-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2010-03-16实施
SN/T2374--2009
本标准的附录 B 为规范性附录,附录 A、附录 C、附录 D、附录 E及附录 F均为资料性附录。本标推由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国重庆出人境检验检疫局和重庆大学生物工程学院负贵起草。本标准主要起草人：王国民、李应国、周启明、李贤良、王中康、殷幼平、李正国，孔德英。本标准为首砍发布的出人境检验检疫行业标准。1范围
绿僵菌、白僵菌生物农药检验操作规程SN/T 2374—2009
木标准规定了进山口绿僵菌（Metarhtzizm）和白僵菌（Reueriu）生物农的抽样和品质检验方法。
本标准适用下绿僵菌（Meturhizium)和白僵菌（Be(uveriu)生物农药的母药，油悬浮剂、可湿性粉剂等生物农药产品的抽样与检验，2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡足注H期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用本标推。然而·鼓励根据本标推达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注H期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T1601农药pH值的测定方法
GB/T 1605
商品农药采样方法
农药可湿性粉剂润湿性测定方法GB/T 5451
数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T 8170
GB/T14825农药悬浮率测定方法
GB/T 16150农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法3术语和定义
下列术讲和定义适用于本标准。3.1
分生孢子 conidium
真菌无性繁殖从分生孢子梗顶端或侧面产生并且成熟时脱落的单细胞或多细胞的孢子3.2
含孢量 quantity nf cnnidium
每毫升油悬浮剂或每克粉剂所含真菌孢子的数量，用于表尔真菌的有效成分。3.3
活孢率 percentage of living conidium即孢子萌发率，指在一定培养条件下崩发的真菌孢子数占总孢子数的而分率。3.4
杂茵率percentage of untarget micrnorganism被测真菌生物农药中除了活性组分真菌外其他真菌量占总菌量的含量。3.5
贮存稳定性stability of storage在一般室温或高于室温下贮存-定时间后，产品保持活菌率比标明值的相对水平。3.6
杀死生物种群半数(5o%)所需用的浓度（merlian lethal concentration，个孢了/mL）SN/T2374—2009
杀死生物种群半数（5o%）所需用的剂量（medianlethalconcentration，个孢子/g）。3.8
杀死生物种群半数（50%）所需用的时间（medianlethaltime，天）。4抽样
4.1抽样工具及用品
抽样前预先准备好自封式塑料袋（或塑料瓶）、金属勺、剪刀、封口胶带、标签、牛皮纸封样袋、抽样封条和胶水。
4.2抽样方法与数量
按照GB/T1605进行，抽样过程
4.3样品的标识
抽取的样品在样品袋上贴上抽样标签和抽样样人姓名、抽样日期。所抽样品一份留存被4.4样品保存
保存样品不少于500g（或500m
5检验
5.1菌种鉴定
5.1.1绿僵菌在现代真菌分类系统中分类地位属于fungi），绿僵菌属（Metarhizium）。5.1.2白僵菌在现代真菌分类系统fungi），白僵菌属（Beauveria）。5.1.3菌种鉴定目前主要依据传统议时，可采用18rDNA的ITS序
5.2含孢量测定
5.2.1方法提要
使用光学显微镜和血球计数板测5.2.2试剂和材料
煤油。
5.2.3仪器
5.2.3.1光学显微镜。
5.2.3.2天平：感量0.01g。
也位属
态产雅
子鉴定
注明报验号、样品名称、数量、规格、抽实验室检测。
个月～12个月。
有丝分裂孢子真菌（Mitosboric丝分裂孢子真菌（Mitosporic
生孢子
)（见附录
武样，计
5.2.3.3纽鲍尔（Neubauer)血球计数板：小方格容积0.00025mm。5.2.3.4可调移液器：0.2ml~5.0mL。5.2.3.5磁力搅拌器：无级调速，100r/min5000r/min。5.2.3.6容量瓶：100mL。bzxz.net
5.2.4测定步骤
5.2.4.1样品处理
5.2.4.1.1油悬浮剂样品
特征（参见附录A）。当发生争
将样品搅拌均匀后，准确吸取1.00mL孢子悬浮液至100mL容量瓶中，用煤油稀释定容至2
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100mL。摇匀后从中取出1.0mL释释液至100mL容量瓶中，用煤油稀释定容，作待检液。5.2.4.1.2粉剂、可湿性粉剂和母药样品称取1g（精确至0.01g)样品于洁净干燥的烧杯中，加人20mL煤油制成孢子悬浮液，用磁力搅拌器搅拌混匀后，转移至100mL容量瓶中，用煤油稀释定容。摇匀后从中取出1.0mL于100mL容量瓶中，用煤油稀释定容，作待检液。5.2.4.2测定
盖好血球计数板的盖玻片，将待测样品摇匀后立即用移液器吸取待检液0.2mL，使待检液从盖玻片缝隙中进人血球计数板，静置3min后在光学显微镜10×40倍下镜检，计数80个小方格中孢子总数。重复3次，取平均值n。
5.2.5计算
试样的含孢量按式(1)计算：
式中：
W1—一含孢量，单位为个孢子/mL或个孢子/gnl——个小方格的孢子总数，单位为个。5.3活孢率测定
5.3.1方法提要
将混匀的生物农药用色拉油稀释后均涤在故有
保湿培养24h，观察萌发孢子与未萌发的狼子数，计算发百分率5.3.2试剂和材料
食用色拉油。
蛋白陈：生化试剂。
酵母浸膏：生化试剂。
5.3.2.4琼脂粉：生化试剂。
葡萄糖：分析纯。
蔗糖：分析纯。
5.3.3仪器
光学显微镜。
天平；感量0.001g。
超净工作台。
恒温箱（5℃~60℃）
高压灭菌锅。
板上，接种后在25℃土1℃下
5.3.3.6可调移液器：100μL~1000μL。5.3.4测定步骤
5.3.4.1配制培养基（配方参见附录C)取各物质加入80mL蒸馏水中，调整pH值至6.5左右，用蒸馏水定容至100mL；然后在高压灭菌锅中于121℃高压灭菌30min，倒入直径9cm培养皿中（每血约15mL），冷却后在无菌条件下放入经灭菌的直径为15mm的玻璃纸圆片。5.3.4.2接种
移取1.00mL油悬浮剂样品或称取1g(精确至0.001g)孢子粉于10mL色拉油中，在旋涡混合器上混合均匀，用接种环沾取孢子悬浮液涂在玻璃纸圆片上，并用玻璃推推匀。5.3.4.3培养计数
将接种后的培养基平板置于恒温箱25℃土1℃保湿培养24h后，取出玻璃纸圆片镜检，计数视野3
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中萌发（孢子萌芽长度人于孢子半径）孢子数及孢子总数（孢子总数不得少于300个）。重复3次，取平均值。
5.3.5计算
试样的活孢率按式(2)计算：
n×100
式中：
W.—活孢率,为;
发孢子数,单位为个；
n3—.一检查孢了总数，单位为个。5.4杂菌率测定
5. 4. 1方法提要
将混勾的生物农药用煤油稀释均匀后镜检，根据绿僵菌和自僵菌分生孢子的形态特征及大小分别记录口标真菌的分生孢子数及非月标真菌分生孢子数，计算杂菌率。5.4.2试剂和材料
煤油。
5.4.3仪器
5.4.3.1光学显微镜，
5.4.3.2天平：感量0.01g。
5.4.3.3可调移液器：0.2mL~-5.0ml.。5.4.3.4纽鲍尔（Ncubauer)血球计数板：小方格容积0.00025mm，5.4.3.5磁力搅拌器：无级调速，100r/min~+5(0)r/min。5. 4. 3. 6容量瓶:100 ml-
5.4.4测定步骤
5.4.4.1样品处理
按照5.2.4.1将样品制备成待检液。5.4.4.2真菌计数
盖好纽鲍尔（Neuhauer)血球计数板的盖玻片，用可调移液器吸取0.2ml.特检液，使之从盖坡片缝隙中进入血球计数板，静置3min后在光学显微镜10×.40倍下镜检，计数80个小方格中孢子目标真菌的分生孢子数、非且标真菌分生孢子数。重复3次，取平均值。5. 4. 5计算
试样的杂菌率按式(3)计算：
式中：
杂菌率，%，
月标真菌分生孢子数，单位为个；一非尽标真菌分生孢于数，单位为个。5.5生物活性测定
5. 5. 1方法提要
由于真菌生物农药不同菌株有不同专化性，进行生物活性测定时应以登记的靶标害虫作为生物活性测定的试盅。本标准以乐亚飞蝗Locustu migratoriamanitensis（Mey.）、铜缘丽金龟Ancmalacorputentu作为试虫，分别用点滴法，土壤混药法测定绿僵菌生物农药的毒力效价：以桃蚜Myeupersirae4
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Suters、马尾松毛虫Dendrolimuspuncintus作为试虫分别用浸虫法、点滴法测定白僵菌生物农药的毒力效价（东亚飞蝗、铜绿丽金龟、桃蚜和马尾松毛虫的饲养方法蚕见附录D)，5.5.2试剂和材料
5.5.2.1东亚飞蝗Lucusta migrutoria manilensis(Mey.)4龄蝗鋪。5.5.2.2铜绿丽金龟AnomutaCorputenta.2龄幼虫。5. 5.2. 3 桃蚜 Myzu persicae Sutzers 成虫。5.5.2.4马尾松毛虫Dendrotimus nunetatus3龄幼虫。5.5.2.5麦：5片~6片叫以上。
发芽玉米，
甘蓝苗：3片~1片叶。
麦麸。
5. 5. 2. 10
酵母粉。
5. 5. 2. 11
吐溢-80。
5. 5.3仪器与用具
5. 5. 3. 1
各种饲虫箱。
光学显微镜。
5. 5. 3. 3
磁力搅拌器：无级调速，1000r/min~5000r/min。5. 5.3. 4
纽鲍尔(Neubauer)血球计数板。5.5.3.5
可调移液器:0.1μL~10 μL,
5. 5. 3. 6
可调移液器：200μL~～1000μl.5. 5, 3.7
烧杯：100 ml.。
5. 5. 4 测定步骤
参见附录 E。
5. 6 干燥减量测定
5.6. 1方法提要
将测试样品在105℃士2℃于燥箱中干燥恒重,通过前后质量之差计算干燥减显。5.6.2仪器
5.6.2.1电热鼓风干燥箱。
5.6.2.2干燥器，
5.6.2.3天平：感量0.001g。
5.6.2.4扁型称量瓶：40mm。
5.6.3操作方法
将扁型称量瓶烘至恒重（m1）,装人约10（精确至0.001g）混句试样后一起称量（m2）,在105℃2 的电热恒温烘箱中烘 1 h,取出立即放人于煤器中冷却至室温,称量(m3)5. 6.4讨期
试样的下燥减量按式(4)计算：
m2-m3 ×100
m2—ml
戏巾：
Wi\下燥减量,;
一扁型称量瓶质量，单位为克（g)；烘前样品与扁型称量瓶质量，单位为克（g）；(4)
SN/T2374—2009
烘后样品与扁型称量瓶质量，单位为克（g）。m3
5.7pH值测定
按GB/T1601进行。
5.8贮存稳定性测定
5.8.1方法提要
将待测样品密闭置于38℃士2℃下贮存14d，然后按照5.3测定活孢率。5.8.2仪器
5.8.2.1恒温箱（或恒温水浴）：温度38℃±2℃。5.8.2.2具塞塑料离心管：50mL，在38℃下，仍能充分保证其密封性。5.8.2.3光学显微镜。
5.8.2.4超净工作台。
5.8.2.5天平：感量0.001g。
5.8.3测定步骤
用可调移液器量取1.00mL油悬浮剂样品中，使其铺成平滑均勾层，置塑料离心管于24h内完成对活孢率（nl）的检验。活5.8.4计算
贮存稳定性按式（5)计算：
式中：
一贮存稳定性，%；
活孢率，%；
待测样品贮存前的
5.9细度测定
对于粉剂和可湿性粉剂样
5.10润湿性
对可湿性粉剂按GB/T54
5.11悬浮率测定
对于油悬浮剂参照附录F的方
6数据处理
按GB/
销至0.001g）试样放入50mL塑料离心管温箱中放置14d。取出使试样冷至室温。于法同5.3。
中的“干
模剂、可湿
极限数值的处理，采用GB/T8170中的修约值比较法。中“湿筛法”进行细度测定。
安GB/T14825进行“悬浮率”测定。附录A
（资料性附录）
绿僵菌属、白僵菌属常见种的主要形态特征A，1绿優菌属常见种主要形态特征A.1.1金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae（Metsch.）SorokinvarSN/T2374—2009
在PDA及察氏培养基上菌落绒毛状至棉絮状。最初白色，产孢时橄榄绿色。菌丝具分隔和分枝，透明，直径为1.5μm2μm。分生孢子梗很难与菌丝区别，直径约2μm，其末端产生瓶形小梗，（8.6μm~25μm）×（1.5μm~2.2μm）。分生孢子单细胞，长椭圆形至圆柱状，两端钝截形或钝圆，大小变化甚大，（5.7μm~9μm）×（2.3μm~4.5μm）。金龟子绿僵菌被Tulloch分为2个变种：金龟子绿僵菌小孢变种（M.anisopliaevar.anisopliae）和金龟子绿僵菌大孢变种（M.anisopliaevar.majus）（见图A. 1)。
图A.卜‘金龟子绿僵菌大孢变种（M.anisopliaevar.majus）的分生孢子A.1.2黄绿绿菌（M.flavovirideGams&Rozsypal）在察氏平板上，14d时菌落直径达55mm，黄绿色。分生孢子梗疏松轮状分枝，其上着生（1～2）杆状瓶梗，与分生孢子梗成宽的夹角，顶部急尖（7.0μm~12μm）×（1.8μm~3μm）。分生孢子单细胞，广卵圆形，具有不同的顶端，（7.2um~9.3μm）×（3μm~4μm），两端钝截形或钝圆，大小变化甚大，（5.7μm~9μm）×（2.3um~4.5um）。在PDA琼脂培养基上，菌落开始白色，后变成淡绿色，生长较弱。分生孢子梗瓶形，分生孢子长椭圆形至短柱形。黄绿绿僵菌（见图A.2分为2个变种：黄绿绿僵菌小孢变种（M.flavoviridevar.minus）和黄绿绿僵菌大孢变种（M.flavoviridevarflavoviride）。SN/T2374-2009
图A.2黄绿绿僵菌（M.flavoviride）的分生孢子A.1.3戴氏绿僵菌（M.taiLiang&Liu）戴氏绿僵菌是本属中唯一发现具有性型的种，其有性型为戴氏虫草（Cordycepstaii）。瓶梗柱状，具短尖（8.4μm20μm）×（1um~1.5μm），单生于气生菌丝或紧密地轮生于分生孢子梗及原瓶梗上，也可通过微循环产孢从次生子囊孢子产生。分生孢子柱状，中部稍缢缩，两端圆形，分生孢子大小约为13μmX3um，由微循环产孢形成的分生孢子，其形状与前者基本相同，大小约为（7.2μm～9μm）×2.5um
A.2自僵菌属常见种的主要形态特征A,2.1球孢白僵菌Beauveriabassiana（Balsamo）Vuillem菌丝细长，直径1.5μm~2.0μm，丝状有隔；菌落平坦粉末状，表面白色或灰色。产孢细胞基部形状，从典型的瓶状到丝状，垂直着生于菌丝分支或短的小分枝上；分生孢子着生在之字形产孢细胞梗上；孢子多数为球形，直径2.0um～4.0um。球孢白僵菌PDA培养基上的萌发见图A.3。图A.3球孢白僵菌PDA培养基上的萌发A.2.2卵孢白僵菌[Beauveriabrongniarti（Saccardo）Petch）SN/T2374—2009
菌落絮状、茸毛状或粉状，表面白色浮白色或淡黄色，能使某些受感染的昆虫变成粉红色或紫色，也可使明胶培养基的边缘变为红色或紫红色。菌丝细长透明有隔，产孢细胞形状不定，瓶状或丝状，垂直着生在主轴菌丝上或短的分枝上，形成一个球形的产孢细胞束。分生孢子（见图A.4）卵圆或椭圆形(2.0μm~6.0μm）×（1.5μm~3.0μm），孢子着生在由产孢细胞顶部延伸而成的之字形丝状结构上。图A.4卵孢白僵菌（Beauveriabrongniarti）的分生孢子A.2.3白色白僵菌[Beauveriaalbum（Limber）Saccas]菌丝透明有隔，常在隔附近有分枝，分支细长1um2μm粗。分生孢子梗垂直生于菌丝上，顶端生有2个～4个轮生的产孢细胞或产孢细胞直接着生于菌丝上。孢子着生在之字形产孢梗。孢子透明，球形或卵圆形（1.6μm~2.5um）×（1.7μm~3.2μm）。菌落纯白色，椭圆形，表面絮状，边缘规则。A.2.4双型白僵菌[Beauveriaamorpha（Hohnel)Sam son&Evans]在成熟的菌丝上，由多个产孢细胞形成一个轮状结构；产孢细胞基部膨大，直径2um～4um，顶端延伸出18um长的之字形结构，分生孢子着生在之字形结构上。分生孢子透明，表面光滑，圆柱状常向一侧略弯曲（3.5um~5.0μm）×（1.5μm~2.0μm）。在麦芽或燕麦琼脂培养基上菌落2.5cm~4.0cm（14d），开始表面白色棉絮状，以后变成粉末状；表面起初无色，长期培养变成黄褐色。A.2.5蠕跑白僵菌[BeauveriavermiconiadeHoog&Rao]菌丝透明表面光滑，直径1.5μm～3.5μm，常常是二分支。产孢结构（conidialapparatus）紧密成簇，由一群膨大的细胞（5.0μm~60μm）×（3.0μm~4.0μm）构成，这些膨大细胞进一步分枝产生较小的膨大细胞或产孢细胞。产孢细胞有一个椭圆或瓶状的基部（4.0μm~5.0μm）X（2.0μm~2.5μm），顶部延伸出一个之字形弯形或镰刀形，外侧2.5μm内侧1.0μm~1.5μm。A.2.6缘膜白僵菌（Beauveriavelata Samson&Evans）菌丝透明有隔，直径2.0μm~4.0um，淡黄色至浅褐色，孢子形成后表面粉末状，背面起初无色以后变黄色。产孢细胞4个~8个成束着生在成熟的菌丝分支上，基部膨大呈球形2.5um~~3.0μm，项端延伸出短轴丝。分生孢子透明偶见表面光滑，但常常被具有突起的松散的胶质层包被，孢子球形或椭圆形3.0μm4.0μm。
SN/T2374—2009
B.1原理
附录B
（规范性附录）
绿僵菌（Metarhizium）、白僵菌（Beauveria）分子鉴定方法通过真菌18SrDNAITS序列克隆与测序，与基因文库中已有数据比较，作为鉴定真菌的分类归属的重要参考依据。
B.2试剂
液氮。
DNA提取试剂盒。
引物。
Tag酶。
dNTP。
氯化镁（MgCl2）。
超纯水。
石蜡油。
2%的琼脂糖凝胶（含EB）
PCRPrepsDNAPurificationSystem纯仪器及用具
PCR仪。
电泳仪。
凝胶成像系统。
核酸蛋白分析仪。
1.5mL、5mL离心管。
可调移液器：0.1μL~10
可调移液器：20~2004
可调移液器：200μL~1000μL，B.4方法
B.4.1DNA提取
将绿僵菌属（Metarhizium）、白僵菌属（Beauveria）孢子分别接种到1/4SDA，PDA液体培养基中，28℃摇瓶培养48h，用四层纱布过滤收集菌丝。将1g真菌菌丝在液氮中研磨成粉末，采用DNA提取试剂盒提取真菌DNA。
B.4.2真菌ITSrDNA的克隆及测序B.4.2.1用通用引物扩增真菌ITs区序列：（Paul,B.2000）引物为:ITS15-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3,ITS45-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3\
PCR反应体系（25μL）2.5μl.10×Taq酶缓冲液，dNTP各200mol/LMgClz1.5mmol/L，引物50pmol/L，Taq酶0.5μL（2.5U），模板DNA10ng~1μg，加灭菌超纯水补足总体积25μL，加30μL石10
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