SN/T 4280.1-2015
基本信息
标准号： SN/T 4280.1-2015
中文名称：国境口岸红头丽蝇DNA条形码鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4280.1-2015.DNA barcoding identification of Calliphora vicina Robineau-Desvoidy,1830 at the frontier port.
1范围
SN/T 4280.1规定了红头丽蝇的DNA条形码鉴定程序和结果判定。
SN/T 4280.1适用于对红头丽蝇的成虫(包括肢体不全的成虫),以及蛹、幼虫、卵等DNA条形码鉴定的工作。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB19489实验室生物安全通用要求
SN/T 1876医学 媒介生物标本采集、制作及保存规程
SN/T 2752.4卫生检疫 人员的自我防护规范第 4部分:实验室人员
WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
3术语和定义.
下列术语和定义适用于本文件。
3.1红头丽蝇Calli phora vicina Robineau-Desvoidy, 1830
丽蝇科,丽蝇属。因为腹部呈青色，俗名为“blue blowfly”或者“blue bottle" ,因其颊部橙红色,所以
中文名为红头丽蝇,为重要的媒介生物和法医昆虫。
3.2DNA条形码DNA barcode
生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易摣增且相对较短的DNA片段。DNA条形码已经成为物种鉴定的重要工具,在节肢动物尤其是昆虫中,般是指线粒体COI(线粒体细胞色素C氧化酶亚基I)上的658bp的标准片段
1范围
SN/T 4280.1规定了红头丽蝇的DNA条形码鉴定程序和结果判定。
SN/T 4280.1适用于对红头丽蝇的成虫(包括肢体不全的成虫),以及蛹、幼虫、卵等DNA条形码鉴定的工作。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB19489实验室生物安全通用要求
SN/T 1876医学 媒介生物标本采集、制作及保存规程
SN/T 2752.4卫生检疫 人员的自我防护规范第 4部分:实验室人员
WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
3术语和定义.
下列术语和定义适用于本文件。
3.1红头丽蝇Calli phora vicina Robineau-Desvoidy, 1830
丽蝇科,丽蝇属。因为腹部呈青色，俗名为“blue blowfly”或者“blue bottle" ,因其颊部橙红色,所以
中文名为红头丽蝇,为重要的媒介生物和法医昆虫。
3.2DNA条形码DNA barcode
生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易摣增且相对较短的DNA片段。DNA条形码已经成为物种鉴定的重要工具,在节肢动物尤其是昆虫中,般是指线粒体COI(线粒体细胞色素C氧化酶亚基I)上的658bp的标准片段
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4280.1—2015
国境口岸红头丽蝇DNA条形码鉴定方法DNA barcoding identification of Calliphora vicina Robineau-Desvoidy1830atthefrontierport
2015-05-26发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-01-01实施
本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4280.1—2015
本部分起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：邱德义、岳巧云、张宪臣、刘德星、聂维忠、陈健、魏晓雅、吴可量、胡佳1范围
国境口岸红头丽蝇DNA条形码鉴定方法SN/T4280的本部分规定了红头丽的DNA条形码鉴定程序和结果判定SN/T4280.1—2015
本部分适用于对红头丽蝇的成虫（包括肢体不全的成虫），以及蛹、幼虫、卵等DNA条形码鉴定的工作。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件：其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1876医学媒介生物标本采集、制作及保存规程SN/T2752.4卫生检疫人员的自我防扩规范第4部分：实验室人员WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
Calliphora vicina Robinean-Desvoidy,1830红头丽蝇
丽蝇科，丽蝇属。因为腹部呈青色，俗名为“blueblowfly\或者\bluebottle\，因其颊部橙红色，所以中文名为红头丽蝇，为重要的媒介生物和法医昆虫3.2
DNA条形码DNAbarcode
生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。DNA条形码已经成为物种鉴定的重要工具，在节肢动物尤其是昆虫中，一般是指线粒体COI（线粒体细胞色素C氧化酶亚基1)上的658bp的标准片段3.3
DNA条形码鉴定技术DNAbarcodingidentificationtechnology-种利用DNA条形码基因片段进行生物物种鉴定和系统进化关系研究的技术，建立在基因扩增和序列比对的基础之上，它具有不受物种发育状态、性别及形态特征完整与否的限制、减少对形态分类专家的依赖、不受主观因素影响、准确率高、借助互联网可以实现数据共享等特点。3.4
空白对照blankcontrol
从基因组DNA提取步骤开始至PCR扩增和PCR产物检测整个过程，没有加人任何医学媒介昆虫组织的空白，与其他受试的昆虫平行进行操作以观察实验是否处于正常状态。空白对照应没有PCR产物条带产生。
SN/T4280.1—2015
阳性对照positivecontrol
在PCR扩增过程中，与受试样品平行进行的，在正常反应情况下，一定能产生PCR产物的DNA为反应模板，用于观察整个反应体系和反应过程是否正常，阳性对照应有PCR产物带产生。3.6
Rnegativecontrol
阴性对照
在PCR扩增过程中，与受试样品平行进行的，用ddHO代替模板DNA而进行的对照反应，用于观察整个反应体系是否止常，确认没有受到污染，阴性对照应没有PCR产物条带产生。3.7
voucherspecimen
凭证标本
获取DNA条形码等分子数据的来源（母体）标本。凭证标本可以是不完整的标本，但与本标本的DNA条形码数据等分子凭证必须是一一对应的关系。凭证标本的保存非常重要，必须有唯一性标识如：标本编号、存放，鉴定以及采集等详细信息。3.8
molecular voucher
分子凭证
与凭证标本相对应的基因组DNA，PCR产物、DNA条形码序列及峰图.做克降还应包括含DNA条形码片段的阳性转化子。分子凭证的保存非常重要，必须有唯一性的编号、存放等详细信息，以便于H后查证。
4缩略语
下列缩略语适用于木文件。
BOLD：生物条形码数据系统（barcodingoflifedatasystem）注：网址：http：//boldsystems.org。5原理
利用线粒体DNA中的COI基因的通用引物对受试样品基因组DVA进行扩增，PCR产物测序后，得到长度约为658bp不包含引物的序列）的DNA片段，跟BOLD数据库进行比对，根据序列的相似度实现物种鉴定的目的
6引物
LCO14905-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3HCO21985-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-37鉴定程序
7.1准备
实验空需具备的设备和试剂参见附录A，实验室生物安全应符合GB19489要求，人员防护应符合SN/T2752.4的规定；PCR防污染措施遵照WS/T230执行。2
-TKAONiKAca
7.2标本的处理
7.2.1取样
SN/T4280.1—2015
对所检测的标本进行唯一性标识。新鲜标本（包括卵、幼虫，蛹及成虫）及时冷冻或者置于毒瓶处死后，投入大于75%的乙醇固定；截获的干燥标本和死标本直接投入大于75%的乙醇固定。取样时，尽量减小组织块的大小，尽可能保持凭证标本的形态完整性，尤其是避免破坏具有重要分类意义的形态特征。
7.2.2凭证标本的制作
将取样后的标本制作成凭证标本，标本的制作按照SN/T1876执行。7.3基因组DNA的抽提
7.3.1取样
取成虫左侧前足或中足，若左侧前、中足缺失，可取右侧；或一个、一头幼虫的一部分、一只卵，置于灭菌的洁净1.5mL离心管中，加人50μL裂解液研磨至糜状，根据实验室实际情况，选择试剂盒法或者酚-三氯甲烷法抽提DNA。提取时应设置空白对照。7.3.2试剂盒法
按动物组织基因组DNA提取试剂盒的操作指导书进行基因组DVA的抽提。7.3.3酚-三氯甲烷法
细胞裂解后离心分离含核酸的水相，然后再加人等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1），14000g离心5min~10min，取上清液至一新的离心管中；加人等体积的饱和酚，14000g离心5min，转移上清液至一新的离心管，加人等体积的饱和酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1），14000g离心5min，转移上清液至-新的离心管；加人等体积的饱和酚，14000g离心5mim.转移上清液至一新的离心管；加人2借体积的无水乙醇，14000g离心5min，弃上清液：加人500μL的70%乙醇，14000g离心1min，弃上清液，重复该步骤一次：室温或者37℃彻底T燥离心管，加人50μL经高压灭菌的ddH,O溶解DNA；提取的DNA保存在4℃备用，长期保存应置于一20℃或以下冷冻保存。7.4PCR扩增
7.4.1PCR扩增体系
根据实际情况，可以选择50L体系，或者25L体系。为了验证PCR体系有无污染，需同时设置阴性对照。为了验证PCR反应正常，需要设置阳性对照50μL体系：缓冲液（10×）5μL，dNTP（各2.5mmol/L）2uL，正反引物（20μmol/L）各luL，TagDNA聚合酶（5U/μL)0.5μL，模板50ng/μL100ng/μL3μL.ddH037.5μL25证体系各组分减半。
7.4.2PCR扩增条件
94℃预变性3min；94℃变性305.50℃退火308.72℃延伸30s30个循环；72℃延伸10min；10℃保温30min。
TiKAoNiKAca
SN/T4280.1—2015
PCR产物的检测
用1XTAE缓冲液与琼脂糖配成1%的琼脂糖凝胶，检测是否有PCR产物及产物的质量。TAE缓冲液的配制参见附录B,PCR产物检测过程参见附录C。7.6PCR产物的纯化
如需要纯化，选用胶孔大的梳子（如：厚度1.5mm，13齿），重新制胶跑胶，将目的片段连胶一起割下，按PCR产物纯化试剂盒的操作指导书进行PCR产物的纯化。也可根据实际情况，委托测序公司进行纯化。
7.7PCR纯化产物的测序
委托专业的测序公司进行PCR产物的直接测序，按照所选公司的特定要求进行送样。要求两端测序或测通。实验室也可以选择克隆后测序，克隆测序流程参见附录D7.8序列的分析和比对
7.8.1序列的有效性
序列长度应为658bp左右。通过查看序列的原始峰图，有效序列段峰高，基部杂峰少且低的序列为有效序列（参见附录E中的E.1）。将符合要求的序列进行拼接，去除引物片段，拼接后的序列可翻译成通顺的蛋白质序列，反之序列仅可供为参考（参见附录E中的E.2）。7.8.2序列比对
与BOLD系统的序列进行比对。
具体操作见附录
比对序列时，引物序列不包含在内。红头丽蝇的DVA条形码序列参见附录G。8结果判定
BOLD系统给出最大相似种为红头丽蝇并相似度大于99.0%者，DNA条形码方法鉴定为红头丽蝇。若大于98%，小于99.0%，需参考形态学特征进行综合判断，小于98%者，不了与种类判定。A
-rrKAoNniKAca
仪器和用具
附录A
（资料性附录）
主要设备和试剂
SN/T4280.1—2015
普通台式离心机（相对离心力大于14000g）、各量程（2L、10μl20uL、100μL、200μL、1000μL）可调移液器、可调式恒温浴、PCR工作站或者超净工作台、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、冰箱、A.2耗材
1.5mL离心管、0.2mLPCR管、各量程的移液器TIPS、无粉一次性手套。A.3试剂
除另有规定外，所有试剂均采用分析乙醇、动物组织基因组DNA提取试剂盒、Taq酶、dNTP、PCR产物纯化试剂盒、琼脂糖、DNA分子量标准、核酸染料、TAE电泳液、上样缓冲液等。使用酚-三氯甲烷法提取DNA需要饱和酚、三氯甲烷、异戊醇等试剂。5
TTKAONiKAca
SN/T 4280.1—2015
50×储存液（1L)的配制
称量试剂
Tris(三羟甲基氨基甲烷）
附录B
（资料性附录）
TAE缓冲液的配制
NazEDTA·2H,O（乙二胺四乙酸二钠·2HO)配制
加入800nL的去离子水，充分揽拌溶解，加人57.1ml的醋酸，充分混勾。用么离于水定容至1I.，室温保存备用。
1×工作液的配制此内容来自标准下载网
用去离子水稀释50×储存液成1×工作液示例：配制1L1×的工作液，取50×储存液20mL，加人980mL去离子水，混匀即可。6
-iiKAoNiKAca
C.1制胶
附录C
（资料性附录）
PCR产物检测过程
SN/T4280.1—2015
用1×TAE缓冲液与琼脂糖配成1%的琼脂糖凝胶，加热煮沸充分溶解后，降温至50℃左右，或者用手背碰触烧瓶可以忍受的温度，按照核酸染料的说明加入适量的核酸染料，混勺。在制胶板上加人梳子，倒人适量的琼脂糖凝胶，室温凝固备用，C.2点样
将制胶板和胶一起放入电泳槽内，带胶孔的一端位于负电极端，加入1倍的TAE电泳缓冲液至完全浸没制胶板和胶。一个胶孔中加人6的DNA分子量标准，另胶孔中加人6L混人上样缓冲液的PCR产物（5μL的PCR产物中加人IμL的6倍上样缓冲液）。C.3跑胶
电压5V/cm，依据胶块的大小，时间在20min～40min之间。将胶块整个移人凝胶成像仪，检查有无日的片段，片段的大小约为710bp左右，PCR产物胶图参见图C.1。M
说明：
MDNA分子量标准，
1——阳性对照：
阴性对照：
3空自对照：
日的片段。
图C.1PCR产物胶图
SN/T4280.1—2015
D.1纯化产物的连接
附录D
（资料性附录）
PCR纯化产物的克隆测序流程
将DNA纯化产物50ng用连接酶连接到50ng载体中。具体操作方法参考连接酶说明书D.2转化
D.2.1转化平板的制备
向铺好的含有100μg/mL相应抗生素的LB固体培养基表面加人5μL的IPTG（异内基硫代半乳糖苷，5Cmg/mL）和20μL的X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-3-D半乳糖昔，20mg/mL），使用无菌的弯头玻璃棒将其均勾涂布，避光置于37放置1h3h.使溶解X-Gal的二甲基甲酰胺尽量挥发干净。D.2.2转化
将感受态细胞从一80℃冰箱取出放于冰浴上，取10μL连接产物加人到100μL刚刚解冻的感受态细胞中。轻弹混匀，冰浴30min，置于42℃水浴90s，取出后立即置于冰浴中放置2min~3min，期间不要摇动离心管。向离心管中加入500℃预热的培养基（不含抗生素），150r/min、37℃振荡uL37
培养45min。将离心管中的菌液混匀，加到已制备好的转化平板中，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均勾涂布。待平板表面T燥后，倒置平板，37培养12h～16h，D.3
挑取阳性克隆
将过夜培养生长出的白色菌落可根据载体特性选择PCR或酶切方法鉴定插人片段是否正确。挑取判断为阳性的克隆用5mLLB液体培养基（含有100\g/ml相应抗生素），37℃过夜培养后提取质粒，送测序公司进行测序。
D.4阳性转化子的保存
将经序列比对分析确定无污染的阳性克降重组菌落（转化子）保存于终浓度为15%～20%的甘油中，置于80℃冷冻保存。
E.1通过原始峰图判断
见图E.1。
E.2通过翻译成氨基酸判断
附录E
（资料性附录）
序列的有效性判断
图E.1原始峰图
E.2.1登陆网址：ebi.ac.uk/Tools/st/cmboss_transeq。SN/T4280.12015
SN/T 4280.1—2015
EMBOssTranseg
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序列输入窗口截图
E.2.2将序列复制至图E.2Step1中的空格处，Step2中的Frame栏中选择6（AllFrame）.CodonTable中选择\invertebralemitochondrial”，点击Submit，得到以下画面（见图E.3）。EMBOSSTranseg
Pesuhsforkobaeaongegaotawaear.tesaarcyoorbsubmissionpetais
showColbe
输出的翻译蛋白质序列窗口截图3给出的六条氨基酸序列中，只要有一条没有星号，能翻译通顺，即为好的序列，否则序列仪供E.2.3
参考。
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国境口岸红头丽蝇DNA条形码鉴定方法DNA barcoding identification of Calliphora vicina Robineau-Desvoidy1830atthefrontierport
2015-05-26发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-01-01实施
本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4280.1—2015
本部分起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：邱德义、岳巧云、张宪臣、刘德星、聂维忠、陈健、魏晓雅、吴可量、胡佳1范围
国境口岸红头丽蝇DNA条形码鉴定方法SN/T4280的本部分规定了红头丽的DNA条形码鉴定程序和结果判定SN/T4280.1—2015
本部分适用于对红头丽蝇的成虫（包括肢体不全的成虫），以及蛹、幼虫、卵等DNA条形码鉴定的工作。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件：其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1876医学媒介生物标本采集、制作及保存规程SN/T2752.4卫生检疫人员的自我防扩规范第4部分：实验室人员WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
Calliphora vicina Robinean-Desvoidy,1830红头丽蝇
丽蝇科，丽蝇属。因为腹部呈青色，俗名为“blueblowfly\或者\bluebottle\，因其颊部橙红色，所以中文名为红头丽蝇，为重要的媒介生物和法医昆虫3.2
DNA条形码DNAbarcode
生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。DNA条形码已经成为物种鉴定的重要工具，在节肢动物尤其是昆虫中，一般是指线粒体COI（线粒体细胞色素C氧化酶亚基1)上的658bp的标准片段3.3
DNA条形码鉴定技术DNAbarcodingidentificationtechnology-种利用DNA条形码基因片段进行生物物种鉴定和系统进化关系研究的技术，建立在基因扩增和序列比对的基础之上，它具有不受物种发育状态、性别及形态特征完整与否的限制、减少对形态分类专家的依赖、不受主观因素影响、准确率高、借助互联网可以实现数据共享等特点。3.4
空白对照blankcontrol
从基因组DNA提取步骤开始至PCR扩增和PCR产物检测整个过程，没有加人任何医学媒介昆虫组织的空白，与其他受试的昆虫平行进行操作以观察实验是否处于正常状态。空白对照应没有PCR产物条带产生。
SN/T4280.1—2015
阳性对照positivecontrol
在PCR扩增过程中，与受试样品平行进行的，在正常反应情况下，一定能产生PCR产物的DNA为反应模板，用于观察整个反应体系和反应过程是否正常，阳性对照应有PCR产物带产生。3.6
Rnegativecontrol
阴性对照
在PCR扩增过程中，与受试样品平行进行的，用ddHO代替模板DNA而进行的对照反应，用于观察整个反应体系是否止常，确认没有受到污染，阴性对照应没有PCR产物条带产生。3.7
voucherspecimen
凭证标本
获取DNA条形码等分子数据的来源（母体）标本。凭证标本可以是不完整的标本，但与本标本的DNA条形码数据等分子凭证必须是一一对应的关系。凭证标本的保存非常重要，必须有唯一性标识如：标本编号、存放，鉴定以及采集等详细信息。3.8
molecular voucher
分子凭证
与凭证标本相对应的基因组DNA，PCR产物、DNA条形码序列及峰图.做克降还应包括含DNA条形码片段的阳性转化子。分子凭证的保存非常重要，必须有唯一性的编号、存放等详细信息，以便于H后查证。
4缩略语
下列缩略语适用于木文件。
BOLD：生物条形码数据系统（barcodingoflifedatasystem）注：网址：http：//boldsystems.org。5原理
利用线粒体DNA中的COI基因的通用引物对受试样品基因组DVA进行扩增，PCR产物测序后，得到长度约为658bp不包含引物的序列）的DNA片段，跟BOLD数据库进行比对，根据序列的相似度实现物种鉴定的目的
6引物
LCO14905-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3HCO21985-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-37鉴定程序
7.1准备
实验空需具备的设备和试剂参见附录A，实验室生物安全应符合GB19489要求，人员防护应符合SN/T2752.4的规定；PCR防污染措施遵照WS/T230执行。2
-TKAONiKAca
7.2标本的处理
7.2.1取样
SN/T4280.1—2015
对所检测的标本进行唯一性标识。新鲜标本（包括卵、幼虫，蛹及成虫）及时冷冻或者置于毒瓶处死后，投入大于75%的乙醇固定；截获的干燥标本和死标本直接投入大于75%的乙醇固定。取样时，尽量减小组织块的大小，尽可能保持凭证标本的形态完整性，尤其是避免破坏具有重要分类意义的形态特征。
7.2.2凭证标本的制作
将取样后的标本制作成凭证标本，标本的制作按照SN/T1876执行。7.3基因组DNA的抽提
7.3.1取样
取成虫左侧前足或中足，若左侧前、中足缺失，可取右侧；或一个、一头幼虫的一部分、一只卵，置于灭菌的洁净1.5mL离心管中，加人50μL裂解液研磨至糜状，根据实验室实际情况，选择试剂盒法或者酚-三氯甲烷法抽提DNA。提取时应设置空白对照。7.3.2试剂盒法
按动物组织基因组DNA提取试剂盒的操作指导书进行基因组DVA的抽提。7.3.3酚-三氯甲烷法
细胞裂解后离心分离含核酸的水相，然后再加人等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1），14000g离心5min~10min，取上清液至一新的离心管中；加人等体积的饱和酚，14000g离心5min，转移上清液至一新的离心管，加人等体积的饱和酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1），14000g离心5min，转移上清液至-新的离心管；加人等体积的饱和酚，14000g离心5mim.转移上清液至一新的离心管；加人2借体积的无水乙醇，14000g离心5min，弃上清液：加人500μL的70%乙醇，14000g离心1min，弃上清液，重复该步骤一次：室温或者37℃彻底T燥离心管，加人50μL经高压灭菌的ddH,O溶解DNA；提取的DNA保存在4℃备用，长期保存应置于一20℃或以下冷冻保存。7.4PCR扩增
7.4.1PCR扩增体系
根据实际情况，可以选择50L体系，或者25L体系。为了验证PCR体系有无污染，需同时设置阴性对照。为了验证PCR反应正常，需要设置阳性对照50μL体系：缓冲液（10×）5μL，dNTP（各2.5mmol/L）2uL，正反引物（20μmol/L）各luL，TagDNA聚合酶（5U/μL)0.5μL，模板50ng/μL100ng/μL3μL.ddH037.5μL25证体系各组分减半。
7.4.2PCR扩增条件
94℃预变性3min；94℃变性305.50℃退火308.72℃延伸30s30个循环；72℃延伸10min；10℃保温30min。
TiKAoNiKAca
SN/T4280.1—2015
PCR产物的检测
用1XTAE缓冲液与琼脂糖配成1%的琼脂糖凝胶，检测是否有PCR产物及产物的质量。TAE缓冲液的配制参见附录B,PCR产物检测过程参见附录C。7.6PCR产物的纯化
如需要纯化，选用胶孔大的梳子（如：厚度1.5mm，13齿），重新制胶跑胶，将目的片段连胶一起割下，按PCR产物纯化试剂盒的操作指导书进行PCR产物的纯化。也可根据实际情况，委托测序公司进行纯化。
7.7PCR纯化产物的测序
委托专业的测序公司进行PCR产物的直接测序，按照所选公司的特定要求进行送样。要求两端测序或测通。实验室也可以选择克隆后测序，克隆测序流程参见附录D7.8序列的分析和比对
7.8.1序列的有效性
序列长度应为658bp左右。通过查看序列的原始峰图，有效序列段峰高，基部杂峰少且低的序列为有效序列（参见附录E中的E.1）。将符合要求的序列进行拼接，去除引物片段，拼接后的序列可翻译成通顺的蛋白质序列，反之序列仅可供为参考（参见附录E中的E.2）。7.8.2序列比对
与BOLD系统的序列进行比对。
具体操作见附录
比对序列时，引物序列不包含在内。红头丽蝇的DVA条形码序列参见附录G。8结果判定
BOLD系统给出最大相似种为红头丽蝇并相似度大于99.0%者，DNA条形码方法鉴定为红头丽蝇。若大于98%，小于99.0%，需参考形态学特征进行综合判断，小于98%者，不了与种类判定。A
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仪器和用具
附录A
（资料性附录）
主要设备和试剂
SN/T4280.1—2015
普通台式离心机（相对离心力大于14000g）、各量程（2L、10μl20uL、100μL、200μL、1000μL）可调移液器、可调式恒温浴、PCR工作站或者超净工作台、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、冰箱、A.2耗材
1.5mL离心管、0.2mLPCR管、各量程的移液器TIPS、无粉一次性手套。A.3试剂
除另有规定外，所有试剂均采用分析乙醇、动物组织基因组DNA提取试剂盒、Taq酶、dNTP、PCR产物纯化试剂盒、琼脂糖、DNA分子量标准、核酸染料、TAE电泳液、上样缓冲液等。使用酚-三氯甲烷法提取DNA需要饱和酚、三氯甲烷、异戊醇等试剂。5
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SN/T 4280.1—2015
50×储存液（1L)的配制
称量试剂
Tris(三羟甲基氨基甲烷）
附录B
（资料性附录）
TAE缓冲液的配制
NazEDTA·2H,O（乙二胺四乙酸二钠·2HO)配制
加入800nL的去离子水，充分揽拌溶解，加人57.1ml的醋酸，充分混勾。用么离于水定容至1I.，室温保存备用。
1×工作液的配制此内容来自标准下载网
用去离子水稀释50×储存液成1×工作液示例：配制1L1×的工作液，取50×储存液20mL，加人980mL去离子水，混匀即可。6
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C.1制胶
附录C
（资料性附录）
PCR产物检测过程
SN/T4280.1—2015
用1×TAE缓冲液与琼脂糖配成1%的琼脂糖凝胶，加热煮沸充分溶解后，降温至50℃左右，或者用手背碰触烧瓶可以忍受的温度，按照核酸染料的说明加入适量的核酸染料，混勺。在制胶板上加人梳子，倒人适量的琼脂糖凝胶，室温凝固备用，C.2点样
将制胶板和胶一起放入电泳槽内，带胶孔的一端位于负电极端，加入1倍的TAE电泳缓冲液至完全浸没制胶板和胶。一个胶孔中加人6的DNA分子量标准，另胶孔中加人6L混人上样缓冲液的PCR产物（5μL的PCR产物中加人IμL的6倍上样缓冲液）。C.3跑胶
电压5V/cm，依据胶块的大小，时间在20min～40min之间。将胶块整个移人凝胶成像仪，检查有无日的片段，片段的大小约为710bp左右，PCR产物胶图参见图C.1。M
说明：
MDNA分子量标准，
1——阳性对照：
阴性对照：
3空自对照：
日的片段。
图C.1PCR产物胶图
SN/T4280.1—2015
D.1纯化产物的连接
附录D
（资料性附录）
PCR纯化产物的克隆测序流程
将DNA纯化产物50ng用连接酶连接到50ng载体中。具体操作方法参考连接酶说明书D.2转化
D.2.1转化平板的制备
向铺好的含有100μg/mL相应抗生素的LB固体培养基表面加人5μL的IPTG（异内基硫代半乳糖苷，5Cmg/mL）和20μL的X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-3-D半乳糖昔，20mg/mL），使用无菌的弯头玻璃棒将其均勾涂布，避光置于37放置1h3h.使溶解X-Gal的二甲基甲酰胺尽量挥发干净。D.2.2转化
将感受态细胞从一80℃冰箱取出放于冰浴上，取10μL连接产物加人到100μL刚刚解冻的感受态细胞中。轻弹混匀，冰浴30min，置于42℃水浴90s，取出后立即置于冰浴中放置2min~3min，期间不要摇动离心管。向离心管中加入500℃预热的培养基（不含抗生素），150r/min、37℃振荡uL37
培养45min。将离心管中的菌液混匀，加到已制备好的转化平板中，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均勾涂布。待平板表面T燥后，倒置平板，37培养12h～16h，D.3
挑取阳性克隆
将过夜培养生长出的白色菌落可根据载体特性选择PCR或酶切方法鉴定插人片段是否正确。挑取判断为阳性的克隆用5mLLB液体培养基（含有100\g/ml相应抗生素），37℃过夜培养后提取质粒，送测序公司进行测序。
D.4阳性转化子的保存
将经序列比对分析确定无污染的阳性克降重组菌落（转化子）保存于终浓度为15%～20%的甘油中，置于80℃冷冻保存。
E.1通过原始峰图判断
见图E.1。
E.2通过翻译成氨基酸判断
附录E
（资料性附录）
序列的有效性判断
图E.1原始峰图
E.2.1登陆网址：ebi.ac.uk/Tools/st/cmboss_transeq。SN/T4280.12015
SN/T 4280.1—2015
EMBOssTranseg
：水2光达排真行
feFaseeee
eySune
EML-Or
序列输入窗口截图
E.2.2将序列复制至图E.2Step1中的空格处，Step2中的Frame栏中选择6（AllFrame）.CodonTable中选择\invertebralemitochondrial”，点击Submit，得到以下画面（见图E.3）。EMBOSSTranseg
Pesuhsforkobaeaongegaotawaear.tesaarcyoorbsubmissionpetais
showColbe
输出的翻译蛋白质序列窗口截图3给出的六条氨基酸序列中，只要有一条没有星号，能翻译通顺，即为好的序列，否则序列仪供E.2.3
参考。
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