SN/T 1135.3-2016
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出版信息
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标准简介
SN/T 1135.3-2016.Detection and identification of Potato mop-top virus.
1范围
SN/T 1135.3规定了马铃薯帚顶病毒检疫鉴定的基本原则和方法。
SN/T 1135.3适用于所有进境种薯、商品用薯、组培苗和脱毒苗等马铃薯种质中马铃薯帚顶病毒的检疫鉴定以及马铃薯帚顶病毒引起病害的田间调查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3马铃薯帚顶病毒基本信息
中文名:马铃薯帚顶病毒
学名:Potato mop-top virus
缩写:PMTV
分类地位:帚状病毒科(Virgaviridae)马铃薯帚顶病毒属(Pomovirus)。
马铃薯帚顶病毒的其他信息参见附录A。
4方法原理
马铃薯帚顶病毒的血清学特性、分子生物学特性和生物学特性是检疫鉴定的主要依据。
5仪器设备、用具及试剂
5.1 仪器设备
电子分析天平(0.0001 g)、小型离心机、台式冷冻离心机、恒温水浴锅、酶标仪、普通PCR仪、电泳系统、pH计、凝胶成像系统、4℃冰箱、超净工作台、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、涡旋振荡器、微波炉、电子透射显微镜等。
1范围
SN/T 1135.3规定了马铃薯帚顶病毒检疫鉴定的基本原则和方法。
SN/T 1135.3适用于所有进境种薯、商品用薯、组培苗和脱毒苗等马铃薯种质中马铃薯帚顶病毒的检疫鉴定以及马铃薯帚顶病毒引起病害的田间调查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3马铃薯帚顶病毒基本信息
中文名:马铃薯帚顶病毒
学名:Potato mop-top virus
缩写:PMTV
分类地位:帚状病毒科(Virgaviridae)马铃薯帚顶病毒属(Pomovirus)。
马铃薯帚顶病毒的其他信息参见附录A。
4方法原理
马铃薯帚顶病毒的血清学特性、分子生物学特性和生物学特性是检疫鉴定的主要依据。
5仪器设备、用具及试剂
5.1 仪器设备
电子分析天平(0.0001 g)、小型离心机、台式冷冻离心机、恒温水浴锅、酶标仪、普通PCR仪、电泳系统、pH计、凝胶成像系统、4℃冰箱、超净工作台、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、涡旋振荡器、微波炉、电子透射显微镜等。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1135.3—2016
代替SN/T1135.3—2003
马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of Potato mop-top virus2016-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-07-01实施
SN/T1135系列标准共分为13部分：前言
第1部分：马铃薯癌肿病检疫鉴定方法；第2部分：马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法；第3部分：马铃薯量顶病毒检疫鉴定方法：第4部分：马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法：第5部分：马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法；第6部分：马铃薯排腐病菌检疫鉴定方法；第7部分：马铃薯A病毒检疫鉴定方法；第8部分：马铃薯环疽病菌检疫鉴定方法：第9部分：马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法；第10部分：马铃薯V病毒检疫鉴定方法；第11部分：马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法；第12部分：马铃薯M病毒检疫鉴定方法；第13部分：马铃薯Y病毒检疫鉴定方法。本部分为SN/T1135的第3部分。
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分代替SN/T1135.3—2003《马铃薯顶病毒检疫鉴定方法》。本部分与SN/T1135.3—2003相比，主要技术性差异如下：删除了“引言”；
删除了“术语和定义”二章；
增加了“马铃薯帚顶病毒基本信息”一章；删除了“现场检疫与抽样”一章；增加了“检测方法”二节；
修改了RT-PCR检测方法。
SN/T1135.3—2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承扭识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：李明福、张永江、丁小兰、相宁、李桂芬、魏梅生、陈枝楠、黄文胜、张成良。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1135.3—2003。
1范围
马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法
本部分规定了马铃薯常顶病毒检疫鉴定的基本原则和方法。SN/T1135.3—2016
本部分适用于所有进境种薯、商品用薯、组培苗和脱毒苗等马铃薯种质中马铃薯帚顶病毒的检疫鉴定以及马铃薯带顶病毒引起病害的田间调查。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1840
植物病毒免疫电镜检测方法
SN/T2122
进出境植物及植物产品检疫抽样3马铃薯常顶病毒基本信息
中文名：马铃薯帚顶病毒
学名：Potatomop-topvirus
缩写：PMTV
分类地位：帚状病毒科（Virgaviridae)马铃薯顶病毒属（Pomouirus）。马铃薯帚顶病毒的其他信息参见附录A。4方法原理
马铃薯带顶病毒的血清学特性、分了生物学特性和生物学特性是检疫鉴定的主要依据仪器设备、用具及试剂
仪器设备
电子分析天平（0.0001g）、小型离心机、台式冷冻离心机、恒温水浴锅、酶标仪、普通PCR仪、电泳系统、pH计、凝胶成像系统、4℃冰箱、超净工作台、一80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、涡旋振荡器、微波炉、电子透射显微镜等。5.2用具
可调移液器（2.5μL、10μL20μL、100μL、200μL、1000μL、5000μL）及相应的无RNase吸头、无RNase离心管、PCR管、研钵、样品袋、标签等。5.3试剂
有特殊说明除外，所有实验用试剂均为分析纯1
SN/T1135.3—2016
三抗体酶联免疫吸附测定试剂(见附录B)、RT-PCR检测试剂（见附录C)。6样品制备
抽样按照SN/T2122的规定进行。将马铃薯块茎种植在隔离温室中，于25℃生长并进行症状观察。待长出3片4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。采集的叶片进行三抗体酶联免疫吸附测定、RT-PCR、免疫电镜检测或生物学测定。7
检测方法
7.1三抗体酶联免疫吸附测定
见附录B，其他有效的酶联免疫吸附测定检测方法可参照试剂说明书操作。7.2RT-PCR检测
见附录C。
7.3免疫电镜检测
按照SN/T1840中的方法进行电镜观察，参照附录A病毒粒体形态判定免疫电镜检测结果。7.4生物学测定
见附录D。
8结果判定
7.1、7.2、7.3和7.4中的两种检测结果为阳性，即可判定检出马铃薯顶病毒。9样品保存与记录结果
9.1样品保存
经检验确定携带马铃薯顶病毒的样品应在合适的条件下保存，马铃薯病薯块及叶片样品在一20℃或一80℃冰箱中保存，试管苗保存于组培室中，做好标记和登记工作。保存期满后，需经灭活处理。9.2结果记录与资料保存
完整的实验记录要包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。三抗体酶联免疫吸附测定检测应有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测应有电泳图片，免疫电镜检测应有病毒粒体照片，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片。rKNiKca
A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
马铃薯帚顶病毒背景资料
SN/T1135.3—2016
马铃薯（Solanumtuberosum）是它唯一重要的自然寄主。在人工接种的情况下还可侵染茄科、藜科的26种植物。
A.2分布
亚洲：日本、中国台湾、以色列。欧洲：爱尔兰、英国（苏格兰）、荷兰、分兰、前捷克斯洛伐克、瑞典、丹麦和挪威南美洲：玻利维亚、秘鲁、智利。A.3病害症状
症状随季节的变化而不同，在马铃薯植株上一般表现为矮化（帚顶），叶片有褪绿和坏死的V型斑纹，薯块开裂，在较凉的环境下（15℃）薯块上有贝壳状的坏死层。图A.1感染PMTV马铃薯植株
A.4传播途径
主要靠土壤中的马铃薯粉痧菌Spongosporasubterranea传播，汁液接种也能传毒。病薯块或组培苗可通过运输远距离传播。
A.5粒体形态
马铃薯帚顶病毒粒子为直杆状，长度为65nm80nm，150nm~160nm和290nm~310nm，宽为18nm~20nm
ikAoNrKAca
SN/T1135.3—2016
A.6基因组特征
图A.2PMTV病毒粒体
该病毒的基因组为三组分，正义单链RNA，分别为6.0kb,3.0kb~3.5kb和2.5kh~3.0kb。KAoNiKAca
B.1试剂
包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NaCO）
碳酸氢钠（NaHCO）
叠氮化钠（NaN）
附录B
（规范性附录）
三抗体酶联免疫吸附测定（TAS-ELISA）1.59g
用蒸馅水溶解并定容至1L，4℃储存。B.1.2
PBST缓冲液（pH7.4）
氯化钠（NaCI）
磷酸二氢钾（KH,PO）
磷酸氢二钠（NaHPO，·12H.O）氯化钾
Tween-20
用蒸馏水溶解并定容至IL。
样品抽提缓冲液
亚硫酸钠（Na2SO）
PVP(MW24000~40000)
叠氮化钠（NaN.）
用PBST缓冲液溶解并定容至1L，4℃储存。B.1.4
单克隆抗体稀释缓冲液/酶标抗体稀释缓冲液小牛血清
对硝基苯磷酸二钠（pNPP）
底物缓冲液
二乙醇胺
氯化镁（MgCl）
叠氮化钠（NaN，）
溶于0.8L蒸馏水中，用HCI调pH至9.8，再加蒸馅水到1L，4℃贮存。SN/T1135.3—2016
-iiKAoNrKAca
SN/T1135.3—2016
实验步骤
包被抗体
用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加人酶联板的孔中，100μL/孔，加盖，37℃孵育2h，清空孔中溶液，PBST洗涤3次，每次3min。
B.2.2样品制备
待测样品按1：10（g/mL）加人样品抽提缓冲液.用研钵研麻成浆.7500g离心10min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照阳性对照作相应的处理或按照说明书进行，空白对照为样品抽提缓冲液。
B.2.3加样
阻性对照孔2个阳性对照孔2个空自对照孔根据检测需要设计96孔（或48孔）酶联板，包括2个和多个待测样品孔。加样量为100L/孔，每个样品设个重复。4℃冰箱孵育过夜，酶联板用PBST洗涤3次。
B.2.4加单克隆抗体
洗板，步骤同B.2.2：用稀释缓冲液按说明将单克隆抗体稀释到工作浓度，并加人到酶联板中，100μL/孔，加盖，在37℃下孵育2h，清空孔中溶液，PBST洗涤3次，每次3min。B.2.5加碱性磷酸酯酶标记的抗体用稀释缓冲液将标有碱性磷酸鳍酶的免抗鼠IgG接说明稀释到工作浓度，每孔加100uL，同步骤B.2.1包好，在37℃下孵育1h，酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸馏水洗涤1次，PBST洗涤3次，每次3min。
B.2.6加底物
将底物力NPP加入到底物缓冲液使终浓度为1mg/mL（现配现用），按100μL/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育。
B.2.7读数
用酶标仪在30min，1h和2h于405nm处读OD值注：实际检测时，孵育温度PBST洗涤次数和显色读数时间需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行。B.3结果判定
B.3.1对照孔的ODses值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔）应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的OD值小于0.15，当阴性对照孔的（D0s值小于0.05时，按0.05计算；阳性对照ODao5值/阴性对照OD4os值大于5；同一样品的重复性一致。B.3.2在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上可判断如下：样品OD405/阴性对照OD05>2，判为阳性：样品OD40/阴性对照值接近阅值，判为可疑样品，需重新做一次，或者用其他方法进行验证样品OD40s/阴性对照OD45<2，判为阴性。B.3.3若满足不了B.3.1质量要求，则不能进行结果判断6
KAoNiKAca
C.1试剂
C.1.150×TAE电泳缓冲液
三羟甲基氨基甲烷（Tris）
冰乙酸
NaEDTA2H,O
附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测
加蒸馏水水至1L。用时加蒸馏水稀释至1×TAE。C.1.26×加样缓冲液
0.25%漠酚蓝
40%（质量浓度）蔗糖水溶液
C.2引物
上游引物PMTV-F：5--CTATGCACCAGCCCAGCGTAACC3下游引物PMTV-R：5'-CATGAAGGCTGCCGTGAGGAAGT-3预计扩增片段长度为460bp
实验步骤
C.3.1核酸提取
SN/T1135.3—2016
称取0.1g植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移人火菌的1.5mL离心管中，加人1mLTr-izol，剧烈震荡混匀：4℃，12000r/mim离心5min，取上清液移人新的离心管中，除去不溶成分；在室温下，静置5min后加入200μL三氯甲烷，剧烈振荡15s，在室温下放置10min；4℃12000r/min离心15min，取上清液水相放入新的离心管中；加入与上清液水相等体积异丙醇，颠倒混勾，在一20℃下，放置30min以上；4℃，12000r/min离心10min，RNA在侧壁或管底沉淀；弃上清液，加入1ml70%的冷乙醇，12000r/min离心2min，弃乙醇，重复3次；沉淀放于超净台无菌风吹干15min~20min，干燥后加入20uL～30μL的RNase-freewater，溶解沉淀，缓慢摇勾后，置于一80℃保存备用。注：或者按照等效RNA提取试剂盒进行操作。C.3.2RT-PCR扩增
cDNA的合成：在0.2mLPCR管中，加人总RNA3uL，1μL下游引物（10μmoL/L），1μL10mmol/LdNTP9μLRNasefreeHO,7o℃,5min，冰上放置5min，加人4μL5×M-MLVRTBuffer1μLM-MLV反转录酶（200U/μL），1μLRNasinRNA酶抑制剂（40U/μL)，42℃水浴1h，合成cDNA。PCR扩增：在0.2mLPCR管中，加人2.5μL10×PCR缓冲液，1μLcDNA，0.5μL10mmol/LdNTP，1.0μL上、下游引物（10μmol/L），0.5μLExTag聚合酶（5U/μL）.用无菌水补足到25μL。SN/T1135.3—2016
设置阳性对照、阴性对照及空白对照。反应条件：94℃5min91℃.30s62℃.30s.72℃4030cycles；72℃.5minC.3.3琼脂糖凝胶电泳
用电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶，将5uLPCR扩增产物与1uL6×加样缓冲液混合，然后将其和DNA分子量标记物分别加人到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统观察并保留结果。此内容来自标准下载网
结果判定
阳性对照在460bp处有扩增条带，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。2结果达到质控要求，且样品在460bp处无扩增条带，判定结果为阴性C.4.2
D.1接种
附录D
（规范性附录）
生物学测定
SN/T1135.3—2016
病叶加1：1质量：体积）的磷酸盐缓冲液（0.1moL/L.pH7.2)于研钵中充分研碎，在待接种植物叶片表面均匀酒上硅藻土，用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面，自来水冲洗叶表。做好标签，置于隔离温室中。每天观察记载寄主反应。2鉴别寄主症状
德伯纳依烟（Nicotianadebneyi）：接种叶表现为坏死斑，坏死或褪绿环斑。第一片系统侵染的叶片表现为坏死或褪绿栎叶纹。苋色藜（Chenopodiumamaranticolor）：在13℃~-16下，接种一周或一周以上，接种叶出现坏死环斑，单个的坏死斑可以发展到覆盖半个叶片，没有系统侵染。珊西烟（NicotianatabacumvarXanthi ne）或三生烟（NicotianatabacumSumson）：在低于20℃情况下，接种叶出现坏死或褪绿环斑，但在较高温度下通常不显症。冬季系统侵染占优势，造成坏死或褪绿栎叶纹。
SN/T1135.3-2016
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法
SN/T1135.3—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：(010)68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16印张1字数22千字2017年11月第一版2017年11月第一次印刷印数1—500
书号：155066：2-32386
定价18.00元
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代替SN/T1135.3—2003
马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of Potato mop-top virus2016-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-07-01实施
SN/T1135系列标准共分为13部分：前言
第1部分：马铃薯癌肿病检疫鉴定方法；第2部分：马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法；第3部分：马铃薯量顶病毒检疫鉴定方法：第4部分：马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法：第5部分：马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法；第6部分：马铃薯排腐病菌检疫鉴定方法；第7部分：马铃薯A病毒检疫鉴定方法；第8部分：马铃薯环疽病菌检疫鉴定方法：第9部分：马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法；第10部分：马铃薯V病毒检疫鉴定方法；第11部分：马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法；第12部分：马铃薯M病毒检疫鉴定方法；第13部分：马铃薯Y病毒检疫鉴定方法。本部分为SN/T1135的第3部分。
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分代替SN/T1135.3—2003《马铃薯顶病毒检疫鉴定方法》。本部分与SN/T1135.3—2003相比，主要技术性差异如下：删除了“引言”；
删除了“术语和定义”二章；
增加了“马铃薯帚顶病毒基本信息”一章；删除了“现场检疫与抽样”一章；增加了“检测方法”二节；
修改了RT-PCR检测方法。
SN/T1135.3—2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承扭识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：李明福、张永江、丁小兰、相宁、李桂芬、魏梅生、陈枝楠、黄文胜、张成良。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1135.3—2003。
1范围
马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法
本部分规定了马铃薯常顶病毒检疫鉴定的基本原则和方法。SN/T1135.3—2016
本部分适用于所有进境种薯、商品用薯、组培苗和脱毒苗等马铃薯种质中马铃薯帚顶病毒的检疫鉴定以及马铃薯带顶病毒引起病害的田间调查。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1840
植物病毒免疫电镜检测方法
SN/T2122
进出境植物及植物产品检疫抽样3马铃薯常顶病毒基本信息
中文名：马铃薯帚顶病毒
学名：Potatomop-topvirus
缩写：PMTV
分类地位：帚状病毒科（Virgaviridae)马铃薯顶病毒属（Pomouirus）。马铃薯帚顶病毒的其他信息参见附录A。4方法原理
马铃薯带顶病毒的血清学特性、分了生物学特性和生物学特性是检疫鉴定的主要依据仪器设备、用具及试剂
仪器设备
电子分析天平（0.0001g）、小型离心机、台式冷冻离心机、恒温水浴锅、酶标仪、普通PCR仪、电泳系统、pH计、凝胶成像系统、4℃冰箱、超净工作台、一80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、涡旋振荡器、微波炉、电子透射显微镜等。5.2用具
可调移液器（2.5μL、10μL20μL、100μL、200μL、1000μL、5000μL）及相应的无RNase吸头、无RNase离心管、PCR管、研钵、样品袋、标签等。5.3试剂
有特殊说明除外，所有实验用试剂均为分析纯1
SN/T1135.3—2016
三抗体酶联免疫吸附测定试剂(见附录B)、RT-PCR检测试剂（见附录C)。6样品制备
抽样按照SN/T2122的规定进行。将马铃薯块茎种植在隔离温室中，于25℃生长并进行症状观察。待长出3片4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。采集的叶片进行三抗体酶联免疫吸附测定、RT-PCR、免疫电镜检测或生物学测定。7
检测方法
7.1三抗体酶联免疫吸附测定
见附录B，其他有效的酶联免疫吸附测定检测方法可参照试剂说明书操作。7.2RT-PCR检测
见附录C。
7.3免疫电镜检测
按照SN/T1840中的方法进行电镜观察，参照附录A病毒粒体形态判定免疫电镜检测结果。7.4生物学测定
见附录D。
8结果判定
7.1、7.2、7.3和7.4中的两种检测结果为阳性，即可判定检出马铃薯顶病毒。9样品保存与记录结果
9.1样品保存
经检验确定携带马铃薯顶病毒的样品应在合适的条件下保存，马铃薯病薯块及叶片样品在一20℃或一80℃冰箱中保存，试管苗保存于组培室中，做好标记和登记工作。保存期满后，需经灭活处理。9.2结果记录与资料保存
完整的实验记录要包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。三抗体酶联免疫吸附测定检测应有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测应有电泳图片，免疫电镜检测应有病毒粒体照片，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片。rKNiKca
A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
马铃薯帚顶病毒背景资料
SN/T1135.3—2016
马铃薯（Solanumtuberosum）是它唯一重要的自然寄主。在人工接种的情况下还可侵染茄科、藜科的26种植物。
A.2分布
亚洲：日本、中国台湾、以色列。欧洲：爱尔兰、英国（苏格兰）、荷兰、分兰、前捷克斯洛伐克、瑞典、丹麦和挪威南美洲：玻利维亚、秘鲁、智利。A.3病害症状
症状随季节的变化而不同，在马铃薯植株上一般表现为矮化（帚顶），叶片有褪绿和坏死的V型斑纹，薯块开裂，在较凉的环境下（15℃）薯块上有贝壳状的坏死层。图A.1感染PMTV马铃薯植株
A.4传播途径
主要靠土壤中的马铃薯粉痧菌Spongosporasubterranea传播，汁液接种也能传毒。病薯块或组培苗可通过运输远距离传播。
A.5粒体形态
马铃薯帚顶病毒粒子为直杆状，长度为65nm80nm，150nm~160nm和290nm~310nm，宽为18nm~20nm
ikAoNrKAca
SN/T1135.3—2016
A.6基因组特征
图A.2PMTV病毒粒体
该病毒的基因组为三组分，正义单链RNA，分别为6.0kb,3.0kb~3.5kb和2.5kh~3.0kb。KAoNiKAca
B.1试剂
包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NaCO）
碳酸氢钠（NaHCO）
叠氮化钠（NaN）
附录B
（规范性附录）
三抗体酶联免疫吸附测定（TAS-ELISA）1.59g
用蒸馅水溶解并定容至1L，4℃储存。B.1.2
PBST缓冲液（pH7.4）
氯化钠（NaCI）
磷酸二氢钾（KH,PO）
磷酸氢二钠（NaHPO，·12H.O）氯化钾
Tween-20
用蒸馏水溶解并定容至IL。
样品抽提缓冲液
亚硫酸钠（Na2SO）
PVP(MW24000~40000)
叠氮化钠（NaN.）
用PBST缓冲液溶解并定容至1L，4℃储存。B.1.4
单克隆抗体稀释缓冲液/酶标抗体稀释缓冲液小牛血清
对硝基苯磷酸二钠（pNPP）
底物缓冲液
二乙醇胺
氯化镁（MgCl）
叠氮化钠（NaN，）
溶于0.8L蒸馏水中，用HCI调pH至9.8，再加蒸馅水到1L，4℃贮存。SN/T1135.3—2016
-iiKAoNrKAca
SN/T1135.3—2016
实验步骤
包被抗体
用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加人酶联板的孔中，100μL/孔，加盖，37℃孵育2h，清空孔中溶液，PBST洗涤3次，每次3min。
B.2.2样品制备
待测样品按1：10（g/mL）加人样品抽提缓冲液.用研钵研麻成浆.7500g离心10min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照阳性对照作相应的处理或按照说明书进行，空白对照为样品抽提缓冲液。
B.2.3加样
阻性对照孔2个阳性对照孔2个空自对照孔根据检测需要设计96孔（或48孔）酶联板，包括2个和多个待测样品孔。加样量为100L/孔，每个样品设个重复。4℃冰箱孵育过夜，酶联板用PBST洗涤3次。
B.2.4加单克隆抗体
洗板，步骤同B.2.2：用稀释缓冲液按说明将单克隆抗体稀释到工作浓度，并加人到酶联板中，100μL/孔，加盖，在37℃下孵育2h，清空孔中溶液，PBST洗涤3次，每次3min。B.2.5加碱性磷酸酯酶标记的抗体用稀释缓冲液将标有碱性磷酸鳍酶的免抗鼠IgG接说明稀释到工作浓度，每孔加100uL，同步骤B.2.1包好，在37℃下孵育1h，酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸馏水洗涤1次，PBST洗涤3次，每次3min。
B.2.6加底物
将底物力NPP加入到底物缓冲液使终浓度为1mg/mL（现配现用），按100μL/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育。
B.2.7读数
用酶标仪在30min，1h和2h于405nm处读OD值注：实际检测时，孵育温度PBST洗涤次数和显色读数时间需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行。B.3结果判定
B.3.1对照孔的ODses值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔）应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的OD值小于0.15，当阴性对照孔的（D0s值小于0.05时，按0.05计算；阳性对照ODao5值/阴性对照OD4os值大于5；同一样品的重复性一致。B.3.2在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上可判断如下：样品OD405/阴性对照OD05>2，判为阳性：样品OD40/阴性对照值接近阅值，判为可疑样品，需重新做一次，或者用其他方法进行验证样品OD40s/阴性对照OD45<2，判为阴性。B.3.3若满足不了B.3.1质量要求，则不能进行结果判断6
KAoNiKAca
C.1试剂
C.1.150×TAE电泳缓冲液
三羟甲基氨基甲烷（Tris）
冰乙酸
NaEDTA2H,O
附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测
加蒸馏水水至1L。用时加蒸馏水稀释至1×TAE。C.1.26×加样缓冲液
0.25%漠酚蓝
40%（质量浓度）蔗糖水溶液
C.2引物
上游引物PMTV-F：5--CTATGCACCAGCCCAGCGTAACC3下游引物PMTV-R：5'-CATGAAGGCTGCCGTGAGGAAGT-3预计扩增片段长度为460bp
实验步骤
C.3.1核酸提取
SN/T1135.3—2016
称取0.1g植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移人火菌的1.5mL离心管中，加人1mLTr-izol，剧烈震荡混匀：4℃，12000r/mim离心5min，取上清液移人新的离心管中，除去不溶成分；在室温下，静置5min后加入200μL三氯甲烷，剧烈振荡15s，在室温下放置10min；4℃12000r/min离心15min，取上清液水相放入新的离心管中；加入与上清液水相等体积异丙醇，颠倒混勾，在一20℃下，放置30min以上；4℃，12000r/min离心10min，RNA在侧壁或管底沉淀；弃上清液，加入1ml70%的冷乙醇，12000r/min离心2min，弃乙醇，重复3次；沉淀放于超净台无菌风吹干15min~20min，干燥后加入20uL～30μL的RNase-freewater，溶解沉淀，缓慢摇勾后，置于一80℃保存备用。注：或者按照等效RNA提取试剂盒进行操作。C.3.2RT-PCR扩增
cDNA的合成：在0.2mLPCR管中，加人总RNA3uL，1μL下游引物（10μmoL/L），1μL10mmol/LdNTP9μLRNasefreeHO,7o℃,5min，冰上放置5min，加人4μL5×M-MLVRTBuffer1μLM-MLV反转录酶（200U/μL），1μLRNasinRNA酶抑制剂（40U/μL)，42℃水浴1h，合成cDNA。PCR扩增：在0.2mLPCR管中，加人2.5μL10×PCR缓冲液，1μLcDNA，0.5μL10mmol/LdNTP，1.0μL上、下游引物（10μmol/L），0.5μLExTag聚合酶（5U/μL）.用无菌水补足到25μL。SN/T1135.3—2016
设置阳性对照、阴性对照及空白对照。反应条件：94℃5min91℃.30s62℃.30s.72℃4030cycles；72℃.5minC.3.3琼脂糖凝胶电泳
用电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶，将5uLPCR扩增产物与1uL6×加样缓冲液混合，然后将其和DNA分子量标记物分别加人到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统观察并保留结果。此内容来自标准下载网
结果判定
阳性对照在460bp处有扩增条带，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。2结果达到质控要求，且样品在460bp处无扩增条带，判定结果为阴性C.4.2
D.1接种
附录D
（规范性附录）
生物学测定
SN/T1135.3—2016
病叶加1：1质量：体积）的磷酸盐缓冲液（0.1moL/L.pH7.2)于研钵中充分研碎，在待接种植物叶片表面均匀酒上硅藻土，用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面，自来水冲洗叶表。做好标签，置于隔离温室中。每天观察记载寄主反应。2鉴别寄主症状
德伯纳依烟（Nicotianadebneyi）：接种叶表现为坏死斑，坏死或褪绿环斑。第一片系统侵染的叶片表现为坏死或褪绿栎叶纹。苋色藜（Chenopodiumamaranticolor）：在13℃~-16下，接种一周或一周以上，接种叶出现坏死环斑，单个的坏死斑可以发展到覆盖半个叶片，没有系统侵染。珊西烟（NicotianatabacumvarXanthi ne）或三生烟（NicotianatabacumSumson）：在低于20℃情况下，接种叶出现坏死或褪绿环斑，但在较高温度下通常不显症。冬季系统侵染占优势，造成坏死或褪绿栎叶纹。
SN/T1135.3-2016
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法
SN/T1135.3—2016
中国标准出版社出版
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中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16印张1字数22千字2017年11月第一版2017年11月第一次印刷印数1—500
书号：155066：2-32386
定价18.00元
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