SN/T 4577-2016
基本信息
标准号： SN/T 4577-2016
中文名称：化妆品皮肤刺激性检测重建人体表皮模型体外测试方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：3737154
相关标签： 化妆品 皮肤 刺激性 检测 人体 模型 体外 测试方法
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4577-2016.Skin irritation test for cosmetics- Reconstructed human epidermal model in vitro alternative method.
1范围
SN/T 4577规定了化妆品和化妆品原料对人体皮肤刺激性体外测试方法。
SN/T 4577适用于化妆品和化妆品原料的安全性检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
3术语、定义和缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1替代alternatives
改善试验设计和提高试验效率以减少动物的应激(优化替代),减少某一试验所需动物的数量(减少替代),以及完全停止某- -试验的动物使用(代替替代)，以及为实现上述目的进行的研究。
3.1.2替代试验alternatives testing
利用低等动物或利用离体器官、培养的细胞或细胞器、生物模拟系统以优化、减少或替代传统的动物试验,进行毒理学评价、功效性评价和其他生命科学研究。
3.1.3体外试验in vitro testing
用体外培养的细胞或组织进行的试验。
3.1.4重建人体表皮模型reconstructed human epidermal skin
采用人皮肤来源细胞利用组织工程学技术进行三维结构的重建,可获得与正常皮肤相似的结构和功能。体外重建表皮模型能更好地模拟人体实际接触外源性化学物的情况,可用于替代活体动物进行实验。
1范围
SN/T 4577规定了化妆品和化妆品原料对人体皮肤刺激性体外测试方法。
SN/T 4577适用于化妆品和化妆品原料的安全性检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
3术语、定义和缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1替代alternatives
改善试验设计和提高试验效率以减少动物的应激(优化替代),减少某一试验所需动物的数量(减少替代),以及完全停止某- -试验的动物使用(代替替代)，以及为实现上述目的进行的研究。
3.1.2替代试验alternatives testing
利用低等动物或利用离体器官、培养的细胞或细胞器、生物模拟系统以优化、减少或替代传统的动物试验,进行毒理学评价、功效性评价和其他生命科学研究。
3.1.3体外试验in vitro testing
用体外培养的细胞或组织进行的试验。
3.1.4重建人体表皮模型reconstructed human epidermal skin
采用人皮肤来源细胞利用组织工程学技术进行三维结构的重建,可获得与正常皮肤相似的结构和功能。体外重建表皮模型能更好地模拟人体实际接触外源性化学物的情况,可用于替代活体动物进行实验。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4577—2016
化妆品皮肤刺激性检测
重建人体表皮模型体外测试方法Skin irritation test for cosmetics-Reconstructed human epidermalmodel in vitro alternativemethod2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
涂品南票
2017-03-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
化妆品皮肤刺激性检测
重建人体表皮模型体外测试方法S.V/T4577-—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010)68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社泰皇岛印刷厂印刷*
开本880×1230
2018年1月第一版
字数18千字
2018年1月第一次印刷
印数1-500
书号：155066·2-32326
定价16.00元
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T4577—2016
本标准参照采用\经济合作与发展组织\发布的《化学品测试指南》第439号（OECDGuidelinesforthe testing of Chemicals No.439)。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、欧莱雅中国研发和创新中心本标准主要起草人：曾静、马丹、苏宁、程树军、邱璐、蔡臻子、郑红艳、魏海燕、秦瑶、李小林、赵、李楠。
1范围
化妆品皮肤刺激性检测
重建人体表皮模型体外测试方法本标准规定了化妆品和化妆品原料对人体皮肤刺激性体外测试方法本标准适用于化妆品和化妆品原料的安全性检测。2规范性引用文件
SN/T4577—2016
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
替代alternatives
改善试验设计和提高试验效率以减少动物的应激（优化替代），减少某一试验所需动物的数量（减少
替代），以及完全停止某一试验的动物使用（代替替代），以及为实现述目的进行的研究。3.1.2
替代试验alternativestesting
利用低等动物或利用离体器官、培养的细胞或细胞器、生物模拟系统人优化、减少或替代传统的动物试验，进行毒理学评价，功效性评价和其他生命科学研究。3.1.3
体外试验invitrotesting
用体外培养的细胞或组织进行的试验。3.1.4
重建人体表皮模型reconstructedhumanepidermalskin采用人皮肤来源细胞利用组织工程学技术进行三维结构的重建，可获得与正常皮肤相似的结构和功能。体外重建表皮模型能更好地模拟人体实际接触外源性化学物的情况，可用于替代活体动物进行实验。
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件
MTT[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl TetrazoliumBromide3-（4.5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑蓝，中文简称噻唑蓝，-KAONiKAca
SN/T4577—2016
4表皮模型体外替代试验法实验原理4.1方法简要步骤
本标准使用重建人体表皮模型对化妆品、化妆品原料的皮肤刺激性进行检测。化学品和化妆品原料与相应的表皮模型反应15min，冲洗干净，于37℃，5%CO，95%相对湿度的CO2培养箱中，培养42h后，用MTT法对反应后的表皮模型进行细胞活性的测试。化妆品成品与相应的表皮模型反应18h后，用MTT法对反应后的表皮模型进行细胞活性的测试。4.2方法测试终点
测试终点是使用MTT法测定细胞活性，并以细胞活性是否超过50%来分类刺激性和非刺激性。MTT是一种黄色染料，活细胞线粒体中玻珀酸脱氢酶还原MTT，在细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲膦（Formazan），用酶标仪在570nm处测定甲的量。通常情况下，甲生成量与活细胞数成正比。因此，可根据570nm处OD值推算活细胞数，死细胞中不含琉拍酸脱氢酶，不与MTT发生反应。然而，一些化妆品、化妆品原料直接与MTT作用，产生颜色反应，干扰实验结果。因此，在开始测试前，首先测试化妆品、化妆品原料是否与MTT产生颜色反应，对于产生颜色反应的化妆品、化妆品原料，用表皮模型的死皮作为对照。5仪器和设备
5.1移液器：连续加样器和25mL、10mL吸头、M25活塞排代式移液器和相应吸头、100μl~1000μL移液器和相应吸头、20μL~200μL移液器和相应吸头。5.2CO，培养箱：37℃±1℃（5+1)%CO2，95%相对湿度5.3酶标仪：570nm。
5.4通风柜。免费标准下载网bzxz
5.5超净工作台。
5.637℃恒温水浴。
5.7摇床，70r/min。
5.8涡旋振荡器。
5.9计时器。
大平（精度0.1mg）。
6试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，试验用水参照GB/T6682规定6.1EpiSkinTM表皮模型（包含：测试培养基、维持培养基、打孔器）\。表皮模型产品应提供相关批次的质检报告（如1C50或ET50），参见附录A。6.2DPBS缓冲液：参见B.1。
6.3阴性对照：DPBS。
6.4阳性对照：5%SDS。
1）握荐使用该表皮模型，该产品购买于上海斯安肤诺生物科技有限公司，如有等效产晶也可替代该款产品。2
KAONKAca
6.5MTT母液：参见B.2。
6.6MTT工作液：参见B.3。
酸性异丙醇：参见B.4。
6.8无菌双蒸水。
96孔板（平底），12孔板。
离心管：1.5mL、2mL。
小钝头镊和小平头镊。
2无菌棉签。
6.13漏斗。
称量漏斗（weighingfunnel）。废液缸。
检测步骤
7.1准备工作
7.1.1待测样品与MTT反应
SN/T4577—2016
用DPBS缓冲液配制浓度为3mg/mL的MTT母液。将MTT母液用测试培养基稀释至0.3Img/mL。取一个新的12孔板，每种待测样品进行单孔试验（根据需测试样品的个数，确定使用的孔数）。每块12孔板准备一个对照孔（无待测样品）。每孔加人2mL0.3mg/mL的MTT溶液，将10μL或10mg待测样品加入有MTT溶液的反应孔中，用移液器枪头混勾，将载有MTT溶液和样品的12孔板置于37℃，5%CO，95%相对湿度的COz培养箱中，培养3h。3h后，从培养箱中取出，观察与对照孔相比是否有颜色变化，如果MTT溶液颜色变为蓝色或者紫色，说明待测样品与MTT反应，在之后的测试中需使用死皮对照以去掉非特异性光密度值。若没有颜色变化，则无需制备死皮对照7.1.2制备死皮对照
将具有活性的表皮模型转移到12孔板中，每孔加人2mL的无菌双蒸水。在37℃，5%CO2，95%相对湿度条件下，培养48h土1h。48h后，弃去无菌双蒸水，此时的表皮模型经48h无菌双蒸水浸泡后，失去活性变成死皮。将死皮对照放置在一18℃～一20℃条件下，可以保存6个月。使用前，将死皮在2mI.的维持培养基中室温放置1h，进行解冻。死皮组织与有活性的表皮模型的试验方法一致。
7.1.3与MTT有反应的待测样品的对照设置为了准确计算结果，对于与MTT，有反应的待测样品，应设3个经待测样品处理的死皮对照（消除待测样品本身与MTT，反应对测试结果的影响）和3个不经待测样品处理的死皮对照（消除死皮组织中残存的微量琥珀酸脱氢酶与MTT反应对测试结果的影响）。7.1.4表皮模型的准备
该步骤应在超净工作台中进行。每轮测试需要1块12孔板用于测试阳性对照，一块12孔板用于测试阴性对照，如果本轮测试中有与MTT反应的待测样品，则需增加1块12孔板用于死皮对照。对于不与MTT反应的待测样品，每个待测样品需要1个12孔板用于测试待测样品；与MTT有反应的待测样品，需要2个12孔板。标记12孔板，在12孔板的第一列加人2mL维持培养基，用镊子将表皮模型移至该培养基中。每种待测样品做3个平行复孔，5%SDS为阳性对照，DPBS为阴性对照，阳性和阴3
TTKAONIKAca
SN/T4577—2016
性对照均设3个平行。将转移有表皮模型的12孔板置于37℃、5%CO2，95%相对湿度条件下，培养24h。培养24h后，加入2mL维持培养基到12孔板的第二列，7.2称样
固体样品用称量漏斗称量10mg土2mg，液体样品用移液器吸取10μL。每个待测样品称取3份，与MTT反应的待测样品称取6份，其中3份用于死皮对照试验。7.3样品涂抹
将10ul.或10mg待测样品，10L阳性对照和10L阴性对照，均勾涂抹到表皮模型表面。液体样品，粘性物质或乳状液应使用吸头涂抹至少30s.动作尽量轻柔，以免破坏表皮模型。粉末状样品，先将5αL无菌双蒸水均匀涂抹在表皮模型表面，然后涂上待测样品。待测样品、阳性对照和阴性对照均做三个平行。需用到死皮对照的待测样品，将待测样品涂抹于死皮对照表面，后续实验方法与有活性的表皮模型一致，死皮对照做3个平行，另设3个不与待测样品反应的死皮对照。7.4冲洗
将涂有待测样品、阳性和阴性对照的表皮模型，室温放置15min。15min后，用DPBS缓冲液彻底冲洗以去除表皮模型表面的样品、阳性和阴性对照。用棉签将每个表皮模型表面残留液体轻轻吸干，将表皮模型逐个移人加有维持培养基的第二列孔中.将培养板放在37C通有5%CO2，95%相对湿度的培养箱中培养42 h。
7.5MTT反应
培养42h后，在培养板第三列孔中加人0.3mg/0L的MTT工作液，将表皮模型移入，检查确认表皮模型与MTT溶液间没有气泡。
7.6MTT孵育
将载有MTT溶液和表皮模型的培养板放在37℃通有5%COz.95%相对湿度的培养箱中培养3h。
7.7表皮模型颜色萃取
培养3h后，使用打孔器取下表皮模型样块，用轰子轻柔的将表皮模型从胶原托上分离并将其翻转，将翻转后的表皮模型重新放置于胶原托上，将表皮模型和胶原托一并移至2mL离心管中，加人500L酸性异丙醇，在涡旋振荡器上混勾，室温避光放置过夜或于4℃放置72h，萃取表皮模型的颜色。
7.8萃取液转移至96孔板
转移200uL酸性异丙醇萃取液，至96孔板，在570nm读取OD值，每一块表皮模型在96孔板上测试两个平行。
7.9检测OD值
转移200μL酸性异丙醇溶液，至96孔板，设6个空白对照重复，在570nm读取0D值。7.10测试化妆品
如测试化妆品成品，则将150uL或150mg的待测样品涂抹到皮肤模型表面，培养18h后冲洗并4
irKAoNiKAca
SN/T4577—2016
进行MTT测试。其他检测流程与化妆品原料一致。测试特殊要求的化妆品成品，参照皮肤模型使用说明书进行测试。
8结果计算
8.1与MTT没有交叉反应的待测样品结果计算8.1.1空白对照：读取6个空白对照的OD值，其平均值作为空白对照的OD值。8.1.2阴性对照：3个阴性对照，每个阴性对照读取2个平行复孔OD值取其平均值。然后计算3个阴性对照的平均OD值作为阴性对照的OD值。阴性对照OD值减去空白对照的OD值，将其设为100%相对细胞活性。
8.1.3阳性对照：3个阳性对照，每个阳性对照读取2个平行复孔0D值取其平均值。然后计算3个阳性对照的平均OD值作为阳性对照的OD值，（阳性对照OD值值×100%一阳性对照的相对细胞活性。空白对照的OD值）/阴性对照OD
8.1.4待测样品：每个组织的OD值均需减去空白对照的OD值，计算测试样品3个组织的OD值的平均值。
8.1.5待测样品的细胞活性的百分比值，是其与阴性对照的比值，而这个百分比值就应用于预测模型来预测此测试样品对皮肤的刺激性8.1.6OD值以及活性的百分比值都应计算标准偏差。8.2与MTT有交叉反应的待测样品结果计算8.2.1待测样品与MTT的反应会产生非特异的颜色反应，干扰MTT直接与细胞反应的数据，因此在计算细胞活性时有必要排除这
特异的于扰
非特异MTT反应的计算（NSMTT），见式（1）8.2.2
式中：
未用待测样品干预的死皮组织光密度值；用待测样品干预的死皮组织光密度值；阴性对照（negative.control）光密度值。NSMTT应该小于阴性对照活性的30%100%
8.2.3MTT与活细胞反应的数据（TODTT),见式（2)和式（3）TODTT-[OD-（OD-OD)]
表皮模型组织的活性（%）
式中：
9质量控制
与待测样品反应的有活性的表皮模型组织（treatedviabletissues）的光密度值·（1)
·（2）
（3）
9.1基本原则：实验室中设置的各种对照检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做试验。
9.2阴性对照：阴性对照地OD值反映表皮模型的活性。其平均OD值大于或等于0.6、小于或等于1.5，并且相对细胞活性的标准偏差小于或等于18%。5
iiKAoNiiKAca
SN/T4577—2016
3阳性对照：阳性对照的OD值反映表皮模型的敏感性。阳性对照地相对细胞活性小于或等于阴性9.3
对照相对细胞活性的40%，并且相对细胞活性的标准偏差小于或等于18%。4待测样品：每个待测样品3个平行测试相对细胞活性的标准偏差小于或等于18%。9.4
结果判定报告
待测样品3个平行测试的平均相对细胞活性大于50%.同时满足第9章质量控制要求，判定该待10.1
测样品不具有皮肤刺激性，其结果报告为该样品不具有皮肤刺激性10.2待测样品3个平行测试的平均相对细胞活性小于或等于50%，同时满足第9章质量控制要求，判定该待测样品具有皮肤刺激性，其结果报告为该样品具有皮肤刺激性。6
附录A
（资料性附录）
表皮模型
角质层
颗粒层
基底层
SN/T4577—2016
重建人体表皮模型（EpiSkinTM表皮模型）组织切片（HE染色）图2重建人体表皮模型（EpiSkinTM表皮模型）实物图图A.2
SN/T4577-2016
B.1DPBS的制备：
氯化钾(KCI)
氯化钠(NaCI)
磷酸二氢钾（KHPO,）
附录B
（资料性附录）
溶液的配制
磷酸氢二钠（NazHPO·7HO)
氯化镁（MgCl·6H,O）
氯化钙（CaCl）
用蒸馏水定容至1000mL，调节pH值至7.4.121℃高压灭菌15min。2MTT母液的准备：
MTT黄色粉末
配成3mg/mL的MTT母液，涡旋震荡15min，4C避光保存，保质期15d。B.3MTT工作液的准备：测试培养基预热至37℃，3mg/mL的MTT母液与测试培养基按1：9比例进行稀释，MTT终浓度达0.3mg/mL，避光保存。B.4酸性异丙醇的制备：在500ml.的异丙醇中加人1.8mL的12NHCl,HCl终浓度达0.04N4℃避光保存，保质期1个月。
书号：1550662-32326
SN/T4577-2016
定价：
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化妆品皮肤刺激性检测
重建人体表皮模型体外测试方法Skin irritation test for cosmetics-Reconstructed human epidermalmodel in vitro alternativemethod2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
涂品南票
2017-03-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
化妆品皮肤刺激性检测
重建人体表皮模型体外测试方法S.V/T4577-—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010)68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社泰皇岛印刷厂印刷*
开本880×1230
2018年1月第一版
字数18千字
2018年1月第一次印刷
印数1-500
书号：155066·2-32326
定价16.00元
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T4577—2016
本标准参照采用\经济合作与发展组织\发布的《化学品测试指南》第439号（OECDGuidelinesforthe testing of Chemicals No.439)。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、欧莱雅中国研发和创新中心本标准主要起草人：曾静、马丹、苏宁、程树军、邱璐、蔡臻子、郑红艳、魏海燕、秦瑶、李小林、赵、李楠。
1范围
化妆品皮肤刺激性检测
重建人体表皮模型体外测试方法本标准规定了化妆品和化妆品原料对人体皮肤刺激性体外测试方法本标准适用于化妆品和化妆品原料的安全性检测。2规范性引用文件
SN/T4577—2016
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
替代alternatives
改善试验设计和提高试验效率以减少动物的应激（优化替代），减少某一试验所需动物的数量（减少
替代），以及完全停止某一试验的动物使用（代替替代），以及为实现述目的进行的研究。3.1.2
替代试验alternativestesting
利用低等动物或利用离体器官、培养的细胞或细胞器、生物模拟系统人优化、减少或替代传统的动物试验，进行毒理学评价，功效性评价和其他生命科学研究。3.1.3
体外试验invitrotesting
用体外培养的细胞或组织进行的试验。3.1.4
重建人体表皮模型reconstructedhumanepidermalskin采用人皮肤来源细胞利用组织工程学技术进行三维结构的重建，可获得与正常皮肤相似的结构和功能。体外重建表皮模型能更好地模拟人体实际接触外源性化学物的情况，可用于替代活体动物进行实验。
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件
MTT[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl TetrazoliumBromide3-（4.5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑蓝，中文简称噻唑蓝，-KAONiKAca
SN/T4577—2016
4表皮模型体外替代试验法实验原理4.1方法简要步骤
本标准使用重建人体表皮模型对化妆品、化妆品原料的皮肤刺激性进行检测。化学品和化妆品原料与相应的表皮模型反应15min，冲洗干净，于37℃，5%CO，95%相对湿度的CO2培养箱中，培养42h后，用MTT法对反应后的表皮模型进行细胞活性的测试。化妆品成品与相应的表皮模型反应18h后，用MTT法对反应后的表皮模型进行细胞活性的测试。4.2方法测试终点
测试终点是使用MTT法测定细胞活性，并以细胞活性是否超过50%来分类刺激性和非刺激性。MTT是一种黄色染料，活细胞线粒体中玻珀酸脱氢酶还原MTT，在细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲膦（Formazan），用酶标仪在570nm处测定甲的量。通常情况下，甲生成量与活细胞数成正比。因此，可根据570nm处OD值推算活细胞数，死细胞中不含琉拍酸脱氢酶，不与MTT发生反应。然而，一些化妆品、化妆品原料直接与MTT作用，产生颜色反应，干扰实验结果。因此，在开始测试前，首先测试化妆品、化妆品原料是否与MTT产生颜色反应，对于产生颜色反应的化妆品、化妆品原料，用表皮模型的死皮作为对照。5仪器和设备
5.1移液器：连续加样器和25mL、10mL吸头、M25活塞排代式移液器和相应吸头、100μl~1000μL移液器和相应吸头、20μL~200μL移液器和相应吸头。5.2CO，培养箱：37℃±1℃（5+1)%CO2，95%相对湿度5.3酶标仪：570nm。
5.4通风柜。免费标准下载网bzxz
5.5超净工作台。
5.637℃恒温水浴。
5.7摇床，70r/min。
5.8涡旋振荡器。
5.9计时器。
大平（精度0.1mg）。
6试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，试验用水参照GB/T6682规定6.1EpiSkinTM表皮模型（包含：测试培养基、维持培养基、打孔器）\。表皮模型产品应提供相关批次的质检报告（如1C50或ET50），参见附录A。6.2DPBS缓冲液：参见B.1。
6.3阴性对照：DPBS。
6.4阳性对照：5%SDS。
1）握荐使用该表皮模型，该产品购买于上海斯安肤诺生物科技有限公司，如有等效产晶也可替代该款产品。2
KAONKAca
6.5MTT母液：参见B.2。
6.6MTT工作液：参见B.3。
酸性异丙醇：参见B.4。
6.8无菌双蒸水。
96孔板（平底），12孔板。
离心管：1.5mL、2mL。
小钝头镊和小平头镊。
2无菌棉签。
6.13漏斗。
称量漏斗（weighingfunnel）。废液缸。
检测步骤
7.1准备工作
7.1.1待测样品与MTT反应
SN/T4577—2016
用DPBS缓冲液配制浓度为3mg/mL的MTT母液。将MTT母液用测试培养基稀释至0.3Img/mL。取一个新的12孔板，每种待测样品进行单孔试验（根据需测试样品的个数，确定使用的孔数）。每块12孔板准备一个对照孔（无待测样品）。每孔加人2mL0.3mg/mL的MTT溶液，将10μL或10mg待测样品加入有MTT溶液的反应孔中，用移液器枪头混勾，将载有MTT溶液和样品的12孔板置于37℃，5%CO，95%相对湿度的COz培养箱中，培养3h。3h后，从培养箱中取出，观察与对照孔相比是否有颜色变化，如果MTT溶液颜色变为蓝色或者紫色，说明待测样品与MTT反应，在之后的测试中需使用死皮对照以去掉非特异性光密度值。若没有颜色变化，则无需制备死皮对照7.1.2制备死皮对照
将具有活性的表皮模型转移到12孔板中，每孔加人2mL的无菌双蒸水。在37℃，5%CO2，95%相对湿度条件下，培养48h土1h。48h后，弃去无菌双蒸水，此时的表皮模型经48h无菌双蒸水浸泡后，失去活性变成死皮。将死皮对照放置在一18℃～一20℃条件下，可以保存6个月。使用前，将死皮在2mI.的维持培养基中室温放置1h，进行解冻。死皮组织与有活性的表皮模型的试验方法一致。
7.1.3与MTT有反应的待测样品的对照设置为了准确计算结果，对于与MTT，有反应的待测样品，应设3个经待测样品处理的死皮对照（消除待测样品本身与MTT，反应对测试结果的影响）和3个不经待测样品处理的死皮对照（消除死皮组织中残存的微量琥珀酸脱氢酶与MTT反应对测试结果的影响）。7.1.4表皮模型的准备
该步骤应在超净工作台中进行。每轮测试需要1块12孔板用于测试阳性对照，一块12孔板用于测试阴性对照，如果本轮测试中有与MTT反应的待测样品，则需增加1块12孔板用于死皮对照。对于不与MTT反应的待测样品，每个待测样品需要1个12孔板用于测试待测样品；与MTT有反应的待测样品，需要2个12孔板。标记12孔板，在12孔板的第一列加人2mL维持培养基，用镊子将表皮模型移至该培养基中。每种待测样品做3个平行复孔，5%SDS为阳性对照，DPBS为阴性对照，阳性和阴3
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性对照均设3个平行。将转移有表皮模型的12孔板置于37℃、5%CO2，95%相对湿度条件下，培养24h。培养24h后，加入2mL维持培养基到12孔板的第二列，7.2称样
固体样品用称量漏斗称量10mg土2mg，液体样品用移液器吸取10μL。每个待测样品称取3份，与MTT反应的待测样品称取6份，其中3份用于死皮对照试验。7.3样品涂抹
将10ul.或10mg待测样品，10L阳性对照和10L阴性对照，均勾涂抹到表皮模型表面。液体样品，粘性物质或乳状液应使用吸头涂抹至少30s.动作尽量轻柔，以免破坏表皮模型。粉末状样品，先将5αL无菌双蒸水均匀涂抹在表皮模型表面，然后涂上待测样品。待测样品、阳性对照和阴性对照均做三个平行。需用到死皮对照的待测样品，将待测样品涂抹于死皮对照表面，后续实验方法与有活性的表皮模型一致，死皮对照做3个平行，另设3个不与待测样品反应的死皮对照。7.4冲洗
将涂有待测样品、阳性和阴性对照的表皮模型，室温放置15min。15min后，用DPBS缓冲液彻底冲洗以去除表皮模型表面的样品、阳性和阴性对照。用棉签将每个表皮模型表面残留液体轻轻吸干，将表皮模型逐个移人加有维持培养基的第二列孔中.将培养板放在37C通有5%CO2，95%相对湿度的培养箱中培养42 h。
7.5MTT反应
培养42h后，在培养板第三列孔中加人0.3mg/0L的MTT工作液，将表皮模型移入，检查确认表皮模型与MTT溶液间没有气泡。
7.6MTT孵育
将载有MTT溶液和表皮模型的培养板放在37℃通有5%COz.95%相对湿度的培养箱中培养3h。
7.7表皮模型颜色萃取
培养3h后，使用打孔器取下表皮模型样块，用轰子轻柔的将表皮模型从胶原托上分离并将其翻转，将翻转后的表皮模型重新放置于胶原托上，将表皮模型和胶原托一并移至2mL离心管中，加人500L酸性异丙醇，在涡旋振荡器上混勾，室温避光放置过夜或于4℃放置72h，萃取表皮模型的颜色。
7.8萃取液转移至96孔板
转移200uL酸性异丙醇萃取液，至96孔板，在570nm读取OD值，每一块表皮模型在96孔板上测试两个平行。
7.9检测OD值
转移200μL酸性异丙醇溶液，至96孔板，设6个空白对照重复，在570nm读取0D值。7.10测试化妆品
如测试化妆品成品，则将150uL或150mg的待测样品涂抹到皮肤模型表面，培养18h后冲洗并4
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进行MTT测试。其他检测流程与化妆品原料一致。测试特殊要求的化妆品成品，参照皮肤模型使用说明书进行测试。
8结果计算
8.1与MTT没有交叉反应的待测样品结果计算8.1.1空白对照：读取6个空白对照的OD值，其平均值作为空白对照的OD值。8.1.2阴性对照：3个阴性对照，每个阴性对照读取2个平行复孔OD值取其平均值。然后计算3个阴性对照的平均OD值作为阴性对照的OD值。阴性对照OD值减去空白对照的OD值，将其设为100%相对细胞活性。
8.1.3阳性对照：3个阳性对照，每个阳性对照读取2个平行复孔0D值取其平均值。然后计算3个阳性对照的平均OD值作为阳性对照的OD值，（阳性对照OD值值×100%一阳性对照的相对细胞活性。空白对照的OD值）/阴性对照OD
8.1.4待测样品：每个组织的OD值均需减去空白对照的OD值，计算测试样品3个组织的OD值的平均值。
8.1.5待测样品的细胞活性的百分比值，是其与阴性对照的比值，而这个百分比值就应用于预测模型来预测此测试样品对皮肤的刺激性8.1.6OD值以及活性的百分比值都应计算标准偏差。8.2与MTT有交叉反应的待测样品结果计算8.2.1待测样品与MTT的反应会产生非特异的颜色反应，干扰MTT直接与细胞反应的数据，因此在计算细胞活性时有必要排除这
特异的于扰
非特异MTT反应的计算（NSMTT），见式（1）8.2.2
式中：
未用待测样品干预的死皮组织光密度值；用待测样品干预的死皮组织光密度值；阴性对照（negative.control）光密度值。NSMTT应该小于阴性对照活性的30%100%
8.2.3MTT与活细胞反应的数据（TODTT),见式（2)和式（3）TODTT-[OD-（OD-OD)]
表皮模型组织的活性（%）
式中：
9质量控制
与待测样品反应的有活性的表皮模型组织（treatedviabletissues）的光密度值·（1)
·（2）
（3）
9.1基本原则：实验室中设置的各种对照检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做试验。
9.2阴性对照：阴性对照地OD值反映表皮模型的活性。其平均OD值大于或等于0.6、小于或等于1.5，并且相对细胞活性的标准偏差小于或等于18%。5
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3阳性对照：阳性对照的OD值反映表皮模型的敏感性。阳性对照地相对细胞活性小于或等于阴性9.3
对照相对细胞活性的40%，并且相对细胞活性的标准偏差小于或等于18%。4待测样品：每个待测样品3个平行测试相对细胞活性的标准偏差小于或等于18%。9.4
结果判定报告
待测样品3个平行测试的平均相对细胞活性大于50%.同时满足第9章质量控制要求，判定该待10.1
测样品不具有皮肤刺激性，其结果报告为该样品不具有皮肤刺激性10.2待测样品3个平行测试的平均相对细胞活性小于或等于50%，同时满足第9章质量控制要求，判定该待测样品具有皮肤刺激性，其结果报告为该样品具有皮肤刺激性。6
附录A
（资料性附录）
表皮模型
角质层
颗粒层
基底层
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重建人体表皮模型（EpiSkinTM表皮模型）组织切片（HE染色）图2重建人体表皮模型（EpiSkinTM表皮模型）实物图图A.2
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B.1DPBS的制备：
氯化钾(KCI)
氯化钠(NaCI)
磷酸二氢钾（KHPO,）
附录B
（资料性附录）
溶液的配制
磷酸氢二钠（NazHPO·7HO)
氯化镁（MgCl·6H,O）
氯化钙（CaCl）
用蒸馏水定容至1000mL，调节pH值至7.4.121℃高压灭菌15min。2MTT母液的准备：
MTT黄色粉末
配成3mg/mL的MTT母液，涡旋震荡15min，4C避光保存，保质期15d。B.3MTT工作液的准备：测试培养基预热至37℃，3mg/mL的MTT母液与测试培养基按1：9比例进行稀释，MTT终浓度达0.3mg/mL，避光保存。B.4酸性异丙醇的制备：在500ml.的异丙醇中加人1.8mL的12NHCl,HCl终浓度达0.04N4℃避光保存，保质期1个月。
书号：1550662-32326
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