SN/T 4616-2016.Detection with PCR for Bartonella at frontier port.
1范围
SN/T 4616规定了国境口岸巴尔通体的检验对象、方法、生物安全要求及结果判定。
SN/T 4616适用于国境口岸人、医学媒介生物(蜱、蚤等)、宿主动物中巴尔通体的PCR方法检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生 物安全通用要求
SN/T1193基因检验实验室技术要求
WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1巴尔通体 Bartonella
一属寄生于脊椎动物红细胞内的革兰染色阴性杆菌，可引起人类卡里翁病(Carrion's disease)、猫抓病( Cat-sratch disease, CSD)、战壕热(Trench fever、 心內膜炎、杆菌性血管瘤(Bacillary angiomatosis,BA)等多种疾病。
注:目前发现的巴尔通体有20余种.8种致病菌，除B. bailiformis、B.quintana的宿主是人类,其余均寄生于自然界动物体内,并经吸血节肢动物传播。
4检测对象
4.1疑似感染巴尔通体的受染嫌疑人、宿主动物的血液样本。
4.2从出人境交通工具、集装箱及口岸地区等场所采集疑似感染巴尔通体的医学媒介生物(蚤、蜱等)。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4616—2016
国境口岸巴尔通体PCR检测方法
Detection with PCR for Bartonella at frontier port2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
国境口岸巴尔通体PCR检测方法
SN/T4616—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010）68533533
网址spe.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×1230
2017年12月第一版
印张0.5
字数10.千字
2017年12月第一次印刷
印数1-500
书号：155066：2-32413
定价14.00元
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T4616—2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、军事医学科学院微生物流行病研究所
本标准主要起草人：翰文东、付维明、程成、焦丹、杨芳、徐宁、耿聪、杨德文，孙毅，I
1范围
国境口岸巴尔通体PCR检测方法
本标准规定了国境口岸巴尔通体的检验对象、方法、生物安全要求及结果判定。SN/T4616—2016
本标准适用于国境口岸人、医学媒介生物（蜱、蚤等）、宿主动物中巴尔通体的PCR方法检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件，GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1193
基因检验实验室技术要
WS/T230
3术语和定义
临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技）下列术语和定义适用于本文件。3.1
巴尔通体Bartonella
一属寄生于脊椎动物红细胞内的南中
阴性杆菌·可引起人类卡里翁病（Carrion'sdisease），猫兰染色
抓病（Cat-sratchdiscase，CSD）、战壕热angiomatosisBA）等多种疾病。Trench
、心内膜炎
杆菌性血管瘤（Bacillary
注：目前发现的巴尔通体有20余种文病菌，除B.bacilliformis，B.quintana的宿主是人类，其余均客生于自然118种致
界动物体内，并经吸血节肢动物传插4检测对象
疑似感染巴尔通体的受染嫌凝人，宿主动物的血液样本4.2
从出入境交通工具、集装箱及口岸地区等场所采集疑似感染巴尔通体的医学媒介生物（蚤、蜱等）。生物安全和PCR防污染要求bZxz.net
检测工作中的个人防护参照GB19489。5.1
进行标本检测的实验室应符合GB19489生物安全二级实验室要求。使用过的实验用品应按照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。5.3
5.4PCR防污染措施按照WS/T230和SN/T1193的规定执行。6仪器和耗材
本方法使用的主要仪器和设备如下：-riKAoNrKAca
SN/T4616—2016
一扩增仪：
生物安全柜：
高速台式离心机（最高离心力12000g以上）：台式离心机（最高离心力2000g以上）：漩涡振荡器：
恒温水浴锅；
一高压灭菌锅；
低温冷藏、冷冻冰箱；
微量可调移液器（10μL，100μL200μL，1000μL)及配套带滤芯吸头；Eppendorf管：
螺口塑料管
主要试剂
除另有规定外，所有化学试剂均采用分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。7.2核酸提取试剂：天根生化科技（北京)有限公司生产的细菌DNA提取试剂盒。7.3PCR反应试剂如下：
a）10×PCR缓冲液（Mg+plus）
b)dNTP(10mmol/L)
Taq酶（5U/μL)
阴性对照品（灭菌双蒸水ddH.O）阳性对照品（阳性的巴尔通体）e）
以上试剂也可由商品化试剂盒提供。电泳缓冲液（10XTBE）制备方法如下：7.4
称取108gTris碱.7.44gNazEDTA·H,O和55g硼酸.溶于800mL的ddH.O中，充分搅拌溶解后加水定容至1L，室温保存。7.56XLoading缓冲液（EDTA30mmol/L,Glycerol36%，XyleneCyanolFF0.035%，Bromophenol0.05%)。
GoldView核酸染料：使用浓度为0.05uL/mL8
检测程序
样本的采集，运送及保存
8.1.1血液样本
采集宿主动物或人全血标本，应常规无菌采集EDTA抗凝的血液样本至少1mL，4℃保存。样本运输采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封运输。对于24h内不能立即检测的样本，一周内检测可保存于20℃冰箱，如超过一周无法检测的样本应保存于一70℃及以下温度冰箱8.1.2节肢动物及啮齿动物组织样本将采集的蜱直接装入2mL螺口塑料管内，成蜱独立分装，若蜱或幼蜱按10只一组分装，在管壁上1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者：并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。-TKAONKAca
做好编号，低温运输或一70℃以下保存待检SN/T4616—2016
采集宿主动物组织脾或肾约50mg放人无菌螺口塑料管内，在管壁上标注好脏器名称及编号，低温运输或一70℃以下保存待检
8.2样本的前处理
8.2.1血液样本
血液样本3000g离心5min后，吸取血液白细胞层200μL提取DNA。节肢动物及啮齿动物样本
取节肢动物或者啮齿动物组织，加入无菌生理盐水200uL～300uL于研磨器中，研磨至匀浆状，4℃保存。
8.3样本的DNA提取
按照商品化试剂盒说明书进行。8.4PCR反应液配制
反应体系设置为50μL，组成如表1表1PCR反应液配制表
10×PCR缓冲液（含氯化镁）
dNTP(10mmol/L)
上游引物（20μmol/L）
下游引物（20μmol/L）
聚合酶（5U/mL）
双蒸水
依据上述反应体系配制待检样本、阳性对照品、阴性对照品的PCR检测反应液，并置于PCR反应管中。
8.5PCR扩增
8.5.1根据巴尔通体属rpoB基因设计引物，引物序列如下：Forwardprimer5-CGCATTATGGTCGTATTTGTCC-3Reverse primer 5'-GCA CGA TT(C/T) GCA TCA TCA TTT TCC-38.5.2扩增条件为94℃预变性5min，而后进行35个循环，条件为94℃变性30s，60℃退火30s72℃延伸30s。最后72℃延伸5min。用该引物可扩增出440bp的片段。8.6电泳
取5L扩增产物，加人1uL浪酚蓝上样缓冲液，混勾，加样于1.5%琼脂糖凝胶（含0.05μL/mLGoldView)胶孔中，以5V/cm稳定电压电泳30min，用凝胶成像系统观察是否出现目的条带（440bp）。-TrKAoNiKAca
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结果判定
8.7.1阳性
如阴性对照和空白对照末出现条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带（扩增片段大小为440bp）.则判定该样品斑点热群立克次体PCR检验阳性。如认为有必要进行确认或针对特殊样品，可进一步进行测序验证。
8.7.2阴性
如阴性对照和空白对照末出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带（扩增片段大小为440bp），而待测样品中未出现PCR扩增产物，则判断待测样品巴尔通体PCR检验阴性。书号：155066·2-32413
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