SN/T 4615-2016.Detection method for human infected avian influenza A (H7N9) virus by real time RT-PCR at frontier ports.
1范围
SN/T 4615规定了国境口岸人感染H7N9禽流感病毒检测的生物安全要求,标本的采集、运输和保存，标本的处理，人感染H7N9禽流感实时荧光RT-PCR检测方法。
SN/T 4615适用于国境口岸人出境人员携带人感染H7N9禽流感病毒的核酸检测。
2规范性引 用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安全通 用要求
WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则
可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定(中华人民共和国卫生部令(第45号))
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1人感染H7N9禽流感病毒Human infected avian influenza A(H7N9)
正粘病毒科所属的禽流感病毒的一种亚型,该病毒为新型重配病毒。由于禽流感病毒与人流感病毒存在受体特异性差异,虽然偶尔会有某些H7病毒(H7N2、H7N3 H7N7)感染人类的报告,一般认为禽流感是不易感染给人的,但经过近年来流感病毒的基因重组,一些既往在禽间传播的高致病性禽流感亚型和新形成的禽流感亚型已可以突破种系感染人类。
3.2实时荧光RT-PCR real time fluorescence RT-PCR
在常规RT-PCR的基础上,加入一条特异性的荧光探针。该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,利用Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭基团分离,从而荧光监测系统可以接受到荧光信号。每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数,用Ct值表示。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4615—2016
国境口岸人感染H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法
Detection method for human infected avianinfluenza A(H7N9)virus byreal timeRT-PCR at frontier ports2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准草单位：中国检验检疫科学研究院本标准主要起草人：胡孔新、马雪征、张丽萍、孙肖红、刘健。SN/T4615—2016
1范围
国境口岸人感染H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法
SN/T4615—2016
本标准规定了国境口岸人感染H7N9禽流感病毒检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理，人感染H7N9禽流感实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于国境口岸人出境人员携带人感染H7N9禽流感病毒的核酸检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（中华人民共和国卫生部令（第
45号））
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
人感染H7N9禽流感病毒HumaninfectedavianinfluenzaA（H7Ng）正粘病毒科所属的禽流感病毒的种亚型
该病毒为新型重配病毒由于禽流感病毒与人流感病毒存在受体特异性差异，虽然偶尔会有某些H17病毒（H7N2、H7N3H7N7）感染人类的报告，一般认为禽流感是不易感染给人的，但经过近年来流感病毒的基因重组，一些既往在禽间传播的高致病性禽流感亚型和新形成的禽流感亚型已可以突破种系感染人类。3.2
实时荧光RT-PCRrealtimefluorescenceRT-PCR在常规RT-PCR的基础上，加人一条特异性的荧光探针。该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告基团和一个率灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，利用Taq酶的5°-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接受到荧光信号。每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，用Ct值表示。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（reversetranscription-polymerasechainreaction）SN/T4615—2016
Ct值Cyclethreshold
循环阈值，每个反应管内的荧光信号达到设定的阐值时所经历的循环数。4.3
FAM：6-羧基荧光素（6-carboxy-fluorescein）种荧光报告基团。
BHQ1：黑洞淬灭基团（BlackHoleQuencher1）一类非荧光灭基因。
检测对象
出入境口岸发现的可疑病例。
6实验室生物安全要求
生物安全遵循以下要求：
个人防护遵循GB19489；
实验室应遵循GB19489和WS233对生物安全二级（BSL-2）实验室的生物安全要求：使用过的实验用品应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理；疑似人感染H7N9禽流感病毒的材料的包装及转运应符合《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》。实验室仪器设备
本方法使用的主要仪器如下：
荧光PCR仪；
超净工作台：
二级生物安全柜；
高压灭菌锅；
低温高速离心机：最大离心力20000g；漩涡振荡器；
冰箱：4℃、-20℃和-70℃；
移液器：10μL、20μL、100μ、200μL和1mL恒温水浴锅：
无菌注射器。
8试剂
除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。本方法使用的主要试剂如下：标本保存液：pH7.4~7.6的Hanks液或Earles平衡盐溶液，并含5%牛血清白蛋白，万古霉索100ug/mL，阿米卡星30μg/ml和制霉菌素40U/mL。商品化系统如BDUniversalViralCulturetterm Transport System。2
rKAoNrKAca
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核酸提取试剂：用德国Qiagen公司QIAampViralRNAKit提取病毒核酸！；实时荧光RT-PCR试剂：Ag-Path-IDTMOnestepRT-PCRKit，美国Ambion公司产品；无RNA酶的DEPC水；
引物和探针序列见表1。
表1人感染H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR引物探针扩增基因
9检测程序
引物和探针
正向引物CNIC-H7F
反向引物CNIC-H7R
探针CNIC-H7P
正向引物CNIC-N9F
反向引物CNIC-N9R
探针CNIC-N9P
9.1标本的采集
9.1.1鼻拭子的采集
5'-AGAAATGAAATGGCTCCTGTCAA-35'-GGTTTTTTCTTGTATTTTTATATGACTTAG-35'FAM-AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-BHQ1-35-TAGCAATGACACACACTAGTCAAT-35'-ATTACCTGGATAAGGGTCATTACACT-35'FAM-AGACAATCCCCGACCGAATGACCC-BHQ1-3将灭菌棉棒插鼻腔中，摩擦鼻甲数次，采集黏膜表皮获得鼻拭子。将棉棒头部浸入2mL采集液中，折断尾部弃去，对采集的样本进行编号登记。9.1.2咽拭子的采集
将灭菌棉从口腔完全插入咽喉中，以咽后壁、上颚扁桃的发红部位为中心，摩擦数次，采集黏膜表皮获得咽拭子（采集时，要注意不要触碰到唾液）。将棉棒头部浸入2mL采集液中，折断尾部弃去，对采集的样本进行编号登记。
9.2标本的保存
采集的新鲜的鼻（咽）试子标本应保存在4℃条件下，24h内运送至实验室：末能24h内送至实验室的，应置一80℃或以下保存。9.3标本的转运
疑似人感染H7N9禽流感病毒感染材料的包装及转运应符合《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》。9.4核酸提取
9.4.1核酸的提取按照商品化核酸提取试剂盒进行。将采集的样本平衡至室温静置10min，取140μL上清液进行试验。
1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。3
-TTKAONIKAca
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9.4.2用移液器吸取310μLAVL加人到310μg的CarrierRNA中，使CarrierRNA彻底溶解，得到终浓度为1μg/uL的CarrierRNA水溶液。9.4.3根据样本的数量（n），先吸取裂解液（n×0.56）mL，再吸取CarrierRNA水溶液（n×5.6)μL将两者进行充分混匀，每管分装0.56mL。注：剩余CarrierRNA水溶液应及时分装到无核酸酶的离心管中，一20保存，避免反复冻融。9.4.4向每管CarrierRNA-裂解缓冲液中加入140叫L的含鼻（咽）拭子的采集液，混勾后旋振荡15s。9.4.5在室温下静置10min后，短暂离心。9.4.6加入560uL的无水乙醇，并涡旋振荡15s。短暂离心后，吸取离心管中的630uL混合液（包括CarrierRNA裂解缓冲液，含鼻（咽）拭子的9.4.7
采集液及无水乙醇），转移到带有离心管的吸附柱内，以6000g离心1min。9.4.8弃掉废液，将吸附柱放回收集管，将剩余的630μL混合液转移至带有离心管的吸附柱内，以6000g离心1min。
9.4.9弃掉废液，将吸附柱放回收集管并向吸附柱内加人缓冲液AW1（使儿前检查是否已加入无水乙醇）500μL，盖上盖了，6000g离心1min弃掉废液，将吸附柱放回收集管并向吸附柱内加人漂洗液AW2（使用前检查是否已加人无水9.4.10
乙醇）500μL，13400g离心1min。9.4.11弃掉废液，将吸附柱放回收集管，13400g离心30
，弃掉废液。
9.4.12将吸附柱放置在一支无核酸酶的离心管上，并向离心柱内加人60置2min。
L的无核酸酶的水，室温静
3以13400g，离心2min，弃掉吸附柱，离心管内的液体即为病毒的核酸水溶液，做好标记，9.4.13
-80℃保存待用。
荧光RT-PCR检测体系
荧光RTPCR反应体系配置（在体系配置区），按表2中的顺序，依次加人。表2人感染H7N9禽流感病毒核酸实时荧光RT-PCR检测试剂反应液各成分名称
无RNA酶水
2XRT-PCRBulfer
CNIC-H7F/N9F(10μM)
CNICHZR/NSR(1OuM)
CNIC-H7P/N9P(10(M)
25 X RT-PCR Enzyme
模板RNA
用量/L
同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板可为H7N9病毒核酸，也可为根据病毒核苷酸序列体外合成的RNA片段，阴性对照模板为不含H7N9病毒核酸的标本或无RNA酶的水。9.6荧光RT-PCR扩增反应
荧光PCR反应（在核酸扩增区）：将加好样的PCR反应管分别转移到荧光PCR检测仪上进行扩增反应，程序设置为以ABIPrism7500型全自动荧光PCR检测仪为例说明，将荧光信号设置为：Reporter4
KAoNiKAca
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Dyel:FAM，QucncherDyel：TAM，PassiveReference：ROX（视所选用的荧光PCR反应试剂而定）。荧光PCR扩增程序按照表3中的程序进行设置，反应总体积为25uL表3人感染H7N9禽流感病毒核酸实时荧光RT-PCR的反应程序步骤
逆转录
预扩增
扩增及荧光收集
9.7结果分析
阈值确定
反应温度wwW.bzxz.Net
是否采集荧光信号
循环数
阅值确定的方法对所有白的标本都是统的，一般是以荧光PCR反应的前3个15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光闻值，以标本扩增产生的荧光信号达到荧光國值时所对应的循环数为循环阈值（Ct值）9.7.2质量控制
反应结果应同时符合以下两个条件：阴性对照无扩增曲线，1值应显示无扩增曲线或有明显的扩增曲线
阳性对照Ct值≤
36并有
检测结果无效需重做
如不满足以上两个条件，此次
9.8结果判定
在满足以上两个质量控制的条件下，根据以下条件进行结果判定：Ct值应显示无扩增曲线或40，且无明显扩增曲线：判断为人感染H7N9禽流感病毒荧光RT-PCR检测阴性。
Ct值36.并有明显扩增曲线，初步判断为人感染H7N9禽流感病毒荧光RT-PCR检测阳性。检测样品36TYKAOMTKAca
SN/T4615-2016
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
国境口岸人感染H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法
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中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010）68533533
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中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16印张0.75字数12千字2017年12月第一版
安2017年12月第一次印刷
印数1-500
书号：155066·232412
定价16.00元
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