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SN/T 4624.6-2016

基本信息

标准号: SN/T 4624.6-2016

中文名称:入境环保用微生物菌剂检测方法第6部分:金黄色葡萄球菌

标准类别:商检行业标准(SN)

标准状态:现行

出版语种:简体中文

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相关标签: 入境 环保 微生物 菌剂 检测 方法 金黄色 葡萄球菌

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标准简介

SN/T 4624.6-2016.Methods for examination of import microbial blends in the environmental
protection-Part 6 :Sta ph ylococcus aureus.
1范围
SN/T 4624.6规定了人境环保用微生物菌剂卫生学检验金黄色葡萄球菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR、实时荧光PCR检测方法。
SN/T 4624.6适用于人境环保用微生物菌剂卫生学检验金黄色葡萄球菌的检测和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
3主要试剂和培养基
3.1 实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。
3.2 生理盐水:见附录A中A.1。
3.3 7.5%氯化钠肉汤:见A.2。
3.4 血琼脂平板:见A.3。
3.5 Baird-Parker 琼脂平板:见A.4
3.6 脑心浸出液肉汤(BHI):见A.5
3.7 兔血浆:见A.6。
3.8 TBE:见A.9。
3.9 Taq DNA聚合酶。
3.10 细菌基因组DNA提取试剂盒。
3.11琼脂糖。
3.12溴化乙锭。
4主要仪器和设备
4.1 电子天平(感量0.01 g)。
4.2恒 温培养箱:36℃±1℃。
4.3恒 温水浴锅。
4.4台式冷冻离心机(最高转速15 000 r/ min)。

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标准内容

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4624.6—2016
入境环保用微生物菌剂检测方法第6部分:金黄色葡萄球菌
Methods for examination of import microbial blends in the environmentalprotection-Part 6:Staphylococcus aureus2016-08-23发布
中华人民共和国
声真t
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
SN/T4624《入境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分:第1部分:地衣芽孢杆菌:
第2部分:短小芽孢杆菌;
第3部分:巨大芽孢杆菌:
第4部分:嗜酸氧化亚铁硫杆菌;第5部分:β型溶血性链球菌:
第6部分:金黄色葡萄球菌;
第7部分:沙门氏菌;
第8部分:志贺氏菌;
第9部分:致泻大肠埃希氏菌;
第10部分:淡紫拟青霉;
第11部分:雅致小克银汉霉;
第12部分:哈茨木霉;
第13部分:黄孢原毛平革菌;
第14部分:焦曲霉;
第15部分:解淀粉芽孢杆菌:
第16部分:类产碱假单胞菌;
第17部分:恶奥假单胞菌。
本部分为SN/T4624的第6部分
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本部分主要起草人:李成铺、王婧、蒋施、刘瑜、侯彤言、付洋、王芳。SN/T4624.6-—2016
1范围
入境环保用微生物菌剂检测方法第6部分:金黄色葡萄球菌
SN/T4624.6—2016
SV/T4624的本部分规定了人境环保用微生物菌剂卫生学检验金黄色葡萄球菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR、实时荧光PCR检测方法。本部分适用于人境环保用微生物菌剂卫生学检验金黄色葡萄球菌的检测和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3
主要试剂和培养基
实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。3.1
生理盐水:见附录A中A,1。
7.5%氯化钠肉汤:见A.2。
血琼脂平板:见A.3。
Baird-Parker琼脂平板:见A.4。脑心浸出液肉汤(BHI):见A.5。免血浆:见A.6。
革兰氏染色液:见A.7。
营养琼脂小斜面:见A.8。
DNA分子量标记:100bpDNAladder。3.10
dNTP:dATP、dTTP、dGTP,dCTP。TBE:见A.9。
TagDNA聚合酶。
细菌基因组DNA提取试剂盒。
琼脂糖。
漠化乙锭。
主要仪器和设备
4.1电子天平(感量0.01g)。
4.2恒温培养箱:36℃土1℃。
4.3恒温水浴锅。
4.4台式冷冻离心机(最高转速15000r/min)。1
SN/T4624.6-2016
PCR扩增仪。
4.6实时荧光PCR仪,
微量移液器和灭菌吸头:10μL20μL、200uL、1000μL。4.7
高压灭菌锅。
4.9PCR超净工作台。
电泳仪。
核酸/蛋白分析仪。
凝胶成像系统。
无菌培养血:直径90mm。
5样品制备
以无菌操作取1g(mL)样品加人到100mL生理盐水中混匀.从中移取25mL加人到225mL灭菌生理盐水中混勾。取样过程中,在样品旁边放置1个营养琼脂平板作为空白对照。6形态学及生化鉴定
6.1增菌
从上述样品勾液中取25mL加人到225mL的7.5%氯化钠肉汤的均质袋中混匀,于36℃土1℃培养18h~24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。将上述培养物,分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板,血平板36℃士1C培养18h24hBaird-Parker平板36C士1℃培养18h~24h观察记录菌落特征,必要时可将培养时间延长至45h~48h。6.2分离
金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上·菌落直径为2m3mm.
颜色量灰色到黑色,边缘为淡
色,周围为一混浊带,在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度,偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落,但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色淡些,外观可能粗糙并干燥。在血平板上·形成菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。6.3染色、镜检
染色镜检:金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,排列呈葡萄球状,无芽孢,无英膜,直径约为0.5um~1μm。
6.4血浆凝固酶试验
挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上,分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面36℃±1℃培养18h~24h
取新鲜配置兔血浆0.5mL,放入小试管中,再加人BHI培养物0.2mL~0.3mL,振荡摇匀,置于36℃土1℃恒温箱或水浴箱内,每30min观察一次,观察6h,如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时,呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半,被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂,按说明书操作,进行血浆凝固酶试验。结果如可疑,挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI.36℃士1℃培养18h~48h,重复试验。2
TrKAoNIKAca
6.5结果判定和报告
综合6.2、6.4的结果,报告1g(mL)样品中检出(或未检出)金黄色葡萄球菌。7分子生物学检测(选做)
7.1细菌模板DNA的提取
7.1.1直接提取法
SN/T4624.6-2016
取6.1中菌液2mL加入2mL无菌离心管中,10000r/min离心2min,尽量弃净上清,沉淀加人TE100μL、10mg/mL溶菌酶100μL,37℃温育30min,12000r/min离心2min,沉淀加人TE缓冲液600μL重悬,再加人15mg/mL蛋白酶K25mL.55℃温育1h后沸水浴10min,12000r/min离心5min,取上清于20℃保存以待检测。7.1.2有机溶剂提取法
取6.1中菌液2mL加到2mL无菌离心管中,10000r/min离心2min,弃上清,尽量弃净上清,沉淀加入TE缓冲液570μL重悬,然后加人10mg/mL溶菌酶100pL,37℃温育30min,再加入10%SDS30uL,65℃温育10min,加人等体积的酚混匀,12000r/min离心10min,取上清移人一新离心管中,重复一次,两次酚抽提后取上清加等体积的酚/氯仿(1:1,体积比)混匀,12000r/min离心10min,取上清再移人一新离心管中,加等体积的无水乙醇,1/10体积的3mo1/L乙酸钠,轻缓颠倒混匀,12000r/min离心10min,弃上清,沉淀用500μL75%乙醇洗两次,离心管开盖室温放置数分钟使乙醇挥发,加人100μL无菌水(预先加热至65℃有利于DNA溶解),一20℃保存以待检测。7.1.3试剂盒法
使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒,具体提取操作参照说明书进行。7.2DNA质量检测
将提取的DNA用1.0%含溴化乙锭(或等效染料)的琼脂糖凝胶进行完整性检测。然后用核酸/蛋OD值,用于PCR反应的DNA纯度一般为1.6≤OD20/白分析仪分别在260nm和280nm下测定OD2≤2.0。
DNA浓度(ng/μL)=ODzaX50×核酸稀释倍数7.3PCR方法
7.3.1引物序列
引物序列及扩增片段长度见表1。表1引物序列及扩增片段长度
PCR扩增
常规PCR
引物来源
引物序列
5'-AAA AAA GCACAT AAC AAGCG-3'5'-GAT AAA GAA GAA ACC AGC AG 3扩增片段大小
-TTKAONIKAca
SN/T4624.6—2016
反应体系
PCR反应体系见表2。
试剂名称
10×PCR缓冲液(含Mg+)
dNTP(10mmol/L.)
TayDNA聚合酶(5U/μL)
正向引物和反向引物(10μmol/L)DNA模板(50ng~200ng)
双蒸水
表2PCR反应体系
补至25.0μL
PCR反应体系
注:反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整7.3.3PCR反应条件
94℃预变性5min:94℃变性2min,57℃退火2min,72℃延伸1min,进行35个循环;72℃延伸7min,4℃保存反应产物。
使用不同PCR仪.可对参数作适当调整。7.3.4空白对照、阴性对照和阳性对照设置阴性对照:非金黄色葡萄球菌DNA为模板;阳性对照:已知金黄色葡萄球菌的DNA或含有待测基因序列的质粒为模板;空白对照:设两个,一是提取DNA时设置的提取空白对照(以等体积水代替样品),二是PCR反应的空白对照(以水代替DNA模板)。7.3.5PCR扩增产物的电泳检测
用电泳缓冲液(0.5×TBE)制备2%琼脂糖凝胶,取5L.PCR扩增产物,与1μL上样缓冲液混合,进行点样,DNAmarker(100bpDNAladder)做参照,3V/cm~5V/cm恒压电泳,电泳50min~60min,电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。7.3.6PCR扩增结果判定和报告
7.3.6.1对照结果
阳性对照:出现132bp的扩增条带;阴性对照:未出现特征条带;
空白对照:未出现特征条带。
7.3.6.2结果判定和报告
对照实验结果正常,待测样品未出现132bp扩增条带,则可判定该样品PCR扩增结果为阴性,报告1g(mL)样品中末检出金黄色葡萄球菌。对照实验结果正常,待测样品出现132bp扩增条带,则可初步判定该样品PCR扩增结果为阳性,4
iKAoNrKAca
SN/T4624.6—2016
应依据形态学、血浆凝固酶试验的结果对该菌进行进一步确认,最终结果以形态学和血浆凝固酶试验的检测结果为准,报告1g(mL)样品中检出(或未检出)金黄色葡菊球菌。对照实验结果异常,本次待测样品的结果无效,应重新做实验,并排除污染因素。7.4实时荧光PCR方法
引物和探针序列
引物和探针序列见表3。其中探针的5端标记FAM,3'端标记TAMRA,表3引物和探针序列
鉴定菌名称
金黄色葡萄球菌
引物序列
LTTCTTCACGACTAAATAAACGCTCA-35'-GGTACTACTAAAGATTATCAAGACGGCT-3实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表4。
探针序列
5FAM-CAGAACACAATGTTTCCGATG-
CAACGT-TAMRA3
表4实时荧光PCR反应体系
试剂名称
10XPCR缓冲液(含Mg+)
dNTPs(10 mmol/L)
TaDNA聚合酶(5U/μL)
正向引物和反向引物(10(mol/L)探针(20μmol/L)
DNA模板
双蒸水
补至25l
实时荧光PCR反应体系
注:反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整,7.4.3此内容来自标准下载网
实时荧光PCR反应参数
实时荧光PCR反应参数:37℃5min,95℃预变性3min;94℃变性5s,60℃退火延伸40s,同时收集FAM荧光信号,进行40个循环,4℃保存反应产物。使用不同实时荧光PCR仪,可对参数作适当调整。7.4.4空白对照、阴性对照和阳性对照设置阴性对照:非金黄色葡萄球菌DNA为模板;阳性对照:已知金黄色葡萄球菌的DNA或含有待测基因序列的质粒为模板;空白对照:设两个,一是提取DNA时设置的提取空白对照(以等体积水代替样品),二是实时荧光PCR反应的空白对照(以水代替DNA模板)。-TriKAoNiKAca
SN/T4624.6—2016
7.4.5实时荧光PCR扩增结果判定和报告7.4.5.1对照结果
阴性对照:无扩增曲线Ct值≥40.0;阳性对照:出现典型的扩增曲线,Ct值应<30.0;空白对照:无扩增曲线;Ct值≥40.0;否则,检测视为无效。
7.4.5.2结果判定和报告
Ct值≥40.0,可判定该样品实时荧光PCR结果为阴性,报告1g(mL)样品中未检出金黄色葡萄球菌。
Ct值≤35.0,可初步判定该样品实时荧光PCR结果为阳性,应依据形态学和血浆凝固酶试验对该菌进行进一步确认,最终结果以形态学和血浆凝固酶试验的检测结果为准,报告1g(mL)样品中检出(或未检出)金黄色葡葡球菌。
35.0iikAoNiKAca
生理盐水
A.1.1成分
氯化钠
蒸馏水
A.1.2制法
附录A
(规范性附录)
培养基和试剂
1000ml
称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。A.27.5%氯化钠肉汤
A.2.1成分
牛肉膏
蛋白陈
氯化钠
蒸馏水
A.2.2制法
1000mL
将以上成分煮沸溶解,调节pH7.4.121℃高压灭菌15min
A.3血琼脂平板
A.3.1成分
豆粉琼脂
脱纤维羊血
5ml~10ml
加热溶化琼脂,冷却至50℃,以无菌操作加人脱纤维羊血,摇匀,倾注平板。A.4
Baird-Parker琼脂平板
A.4.1成分
基础液:
胰蛋白陈
牛肉膏
SN/T4624.6-2016
SN/T4624.6—2016
酵母膏
丙酮酸钠
甘氨酸
氯化锂(LiCl·6H,O)
煮沸溶解,调节pH7.0士0.2,分装每瓶95mL,121℃高压灭菌15min。增菌剂:
30%卵黄盐水
1%亚碲酸钾溶液
30%卵黄盐水50mL与经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL混合,保存于冰箱内。A.4.2制法
临用前,加热溶化琼脂,冷至50℃,每95mL加人预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL摇后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h。A.5
脑心漫出液肉汤(BHI)
A.5.1成分
牛心浸出液
胰蛋白质陈
氯化钠
磷酸氢二钠(Na.HPO·12H,O)
葡萄糖
A.5.2制法
将以上成分煮沸溶解,调节pH7.4土0.2,分装16mm×160mm试管,每管5mL,121℃高压灭菌15min。
A.6兔血浆
A.6.1成分
柠檬酸钠
蒸馏水
兔全血
A.6.2制法
取柠檬酸钠3.8g,加蒸馏水100mL,溶解后过滤,装瓶,121℃高压灭菌15min。免血浆制备:取3.8%柠檬酸钠溶液一份,加免全血4份,混好静置(或以3000r/min离心30min),使血液细胞下降,即可得血浆。
A.7革兰氏染色液
A.7.1成分
去离子水
A.7.2制法
SN/T4624.6—2016
称量10.0g高纯度的SDS置于100mL~200ml烧杯中,加入约80mL的去离子水,68℃加热溶滴加数滴浓盐酸调节pH至7.2将溶液定容至100mL后,室温保存。解。
营养琼脂小斜面
A.8.1成分
胰蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
2制法
15.0g~20.0g
1000mL
将以上成分煮沸溶解,调节pH7.2~7.4,分装13mm×130mm管,121℃高压灭菌15min。A.9
A.9.1成分
去离子水
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
54.0gTris,27.5g硼酸,800mL去离子水溶解,20mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)定容至1L。9
SN/T4624.6-2016
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
入境环保用微生物菌剂检测方法第6部分:金黄色葡萄球菌
SN/T4624.6—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)68533533
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中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16印张1字数22千字2017年12月第一版2017年12月第一次印刷印数1-—500
书号:155066:2-32342
2定价18.00元
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