SN/T 4624.4-2016
基本信息
标准号： SN/T 4624.4-2016
中文名称：入境环保用微生物菌剂检测方法第4部分:嗜酸氧化亚铁硫杆菌
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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下载大小：3936111
相关标签： 入境 环保 微生物 菌剂 检测 方法 氧化亚 杆菌
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4624.4-2016.Methods for examination of import microbial blends in the environmental
protection-Part 4 :Acidithiobacillus ferrooxidans.
1范围
SN/T 4624.4规定了人境环保用微生物菌剂符合性检验嗜酸氧化亚铁硫杆菌的形态学鉴定、生化鉴定、实时荧光PCR检测方法。
SN/T 4624.4适用于人境环保用微生物菌剂符合性检验嗜酸氧化亚铁硫杆菌的检测和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3分类地位
种名:Acidithiobacillus ferrooxidans
分类地位:原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。
4主要试剂和培养基
4.1实验用水:应符合 GB/T 6682中一级水的规格。
4.2 LEPTOSPIRILLUM 液体培养基:见附录A中A.1。
4.3 硫代硫酸钠:见A.2。
4.4 葡萄糖:见A.3。
4.5蔗糖:见 A.4。
4.6 丙三醇:见A.5。
4.7蛋白胨:见 A.6。
4.8 LEPTOSPIRILLUM+葡萄糖:见A.7。
4.9 LEPTOSPIRILLUM+ 蛋白胨:见A.8。
4.10磷酸二氢铵:见 A.9。
4.11硝酸钾:见 A.10。
protection-Part 4 :Acidithiobacillus ferrooxidans.
1范围
SN/T 4624.4规定了人境环保用微生物菌剂符合性检验嗜酸氧化亚铁硫杆菌的形态学鉴定、生化鉴定、实时荧光PCR检测方法。
SN/T 4624.4适用于人境环保用微生物菌剂符合性检验嗜酸氧化亚铁硫杆菌的检测和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3分类地位
种名:Acidithiobacillus ferrooxidans
分类地位:原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。
4主要试剂和培养基
4.1实验用水:应符合 GB/T 6682中一级水的规格。
4.2 LEPTOSPIRILLUM 液体培养基:见附录A中A.1。
4.3 硫代硫酸钠:见A.2。
4.4 葡萄糖:见A.3。
4.5蔗糖:见 A.4。
4.6 丙三醇:见A.5。
4.7蛋白胨:见 A.6。
4.8 LEPTOSPIRILLUM+葡萄糖:见A.7。
4.9 LEPTOSPIRILLUM+ 蛋白胨:见A.8。
4.10磷酸二氢铵:见 A.9。
4.11硝酸钾:见 A.10。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4624.4—2016
入境环保用微生物菌剂检测方法第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌
Methods for examination of import microbial blends in the environmentalprotection-Part 4:Acidithiobacillus ferrooxidans2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分：第1部分：地衣芽孢杆菌：
第2部分：短小芽孢杆菌；
第3部分：巨大芽孢杆菌；
第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌；第5部分：β型溶血性链球菌：
第6部分：金黄色葡萄球菌；
第7部分：沙门氏菌；
第8部分：志贺氏菌；
第9部分：致泻大肠埃希氏菌；
第10部分：淡紫拟青霉；
第11部分：雅致小克银汉霉：
第12部分：哈茨木；
第13部分：黄孢原毛平革菌；
第14部分：焦曲霉；
第15部分：解淀粉芽孢杆菌：
第16部分：类产碱假单胞菌；
第17部分：恶臭假单胞菌。
本部分为SN/T4624的第4部分。
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局本部分主要起草人：王金玲、李靓、金雁、赵颖、贾琳、李瑶、王芳。SN/T4624.4—2016
1范围
入境环保用微生物菌剂检测方法第4部分.嗜酸氧化亚铁硫杆菌
SN/T4624.4—2016
SN/T4624的本部分规定了入境环保用微生物菌剂符合性检验嗜酸氧化亚铁硫杆菌的形态学鉴定、生化鉴定、实时荧光PCR检测方法。本部分适用于入境环保用微生物菌剂符合性检验嗜酸氧化亚铁硫杆菌的检测和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3分类地位
种名：Acidithiobacillusferrooxidans分类地位：原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。4主要试剂和培养基
实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。LEPTOSPIRILLUM液体培养基：见附录A中A.1。硫代硫酸钠：见A.2。
葡萄糖：见A.3，
煎糖：见A.4。
内三醇见A.5。
蛋白陈：见A.6。
LEPTOSPIRILLUM+葡萄糖：见A.7。LEPTOSPIRILLUM+蛋白陈：见A.8磷酸二氢铵：见A.9。
硝酸钾：见A.10。
pH1.见 A.11。
pH2.见A.12。
pH3:见A.13。
TE缓冲液（pH8.0）：见A.14。
TBE.见A.15。
TaqDNA聚合酶。
细菌基因组DNA提取试剂盒。
SN/T4624.4—2016
50XTAE缓冲液（pH8.5）：见A.16。琼脂糖。
溴化乙锭。
DNA分子量标记：100bpDNAladder主要仪器和设备
电子天平（感量0.01g）。
恒温培养箱：30℃土1℃bzxz.net
恒温振荡培养箱：30
恒温水浴锅。
台式冷冻离心机（最高转速15000/min）实时荧光PCR仪
微量移液器和灭菌吸头：10uL、20L200L1000gl
高压灭菌锅。
PCR超净工作台。
电泳仪。
核酸/蛋白分析仪
凝胶成像系统。
6样品制备
以无菌操作取10g（mL）样品加人到100mLLEPTOSPIRILL.UM液体培养基中混勾，在30℃士1℃、150r/min条件下培养4d.直至锥形瓶中颜色变成红棕色。7形态学鉴定
革兰氏染色：取6中的菌液10mL加到无菌离心管中，10000r/min离心10min，弃净上清，取沉淀做涂片进行革兰氏染色，镜检。菌体呈杆状，为革兰氏阴性8生化鉴定
用1.5mL无菌水悬浮7.1中沉淀，取悬浮水溶液进行生化鉴定，每管100μL在30℃土1℃150r/min条件下除硝酸钾培养5d外其余均培养3d，反应结果见表1。表1
嗜酸氧化亚铁硫杆菌生化特征
鉴定项目
硫代硫酸钠
葡萄糖
丙三醇
嗜酸氧化亚铁硫杆菌
rKAoNiKAca
鉴定项目
蛋白陈
LEPTOSPIRILLUM+葡萄糖
LEPTOSPIRILLUM+蛋白陈
硝酸钾
磷酸二氢铵
9分子生物学检测
细菌模板DNA的提取
直接提取法
表1（续）
SN/T4624.4—2016
嗜酸氧化亚铁硫杆菌
取6中菌液2mL加到2mL无菌离心管中，10000/min离心2min，尽量弃净上清，沉淀加人TE100uL10mg/mL溶菌酶100
℃温育30min.12000r/min离心2min，沉淀加入TE缓冲液酶K
600μL重悬，再加人15mg/mL蛋白25uL.55℃温育1h后沸水浴10min，12000r/min离心0℃保存以待检测
5min.取上清保存于一20
有机溶剂提取法
取6中菌液2mL加到2mL无菌离心管中，10000r/min离心2min，弃上清，尽量弃净上清，沉淀加人TE缓冲液570μL重悬，然后加入10mg/mL溶菌酶100L，37℃温育30min，再加人10%SDS30μL65℃温育10min，加入等体积的酚混匀，12000/min离心10min，取上清移人一新离心管中，重复一次，两次酚抽提后取上清加等体积的酚/氯仿（1体积比）混匀，12000r/min离心10min，取上清再移人一新离心管中，加等体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/L乙酸钠，轻缓颠倒混匀，12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用500uL75%乙醇洗两次，离心管开盖室温放置数分钟使乙醇挥发，加入100μL无菌水（预先加热至65℃有利于DNA溶解），一20℃保存以待检测。9.1.3试剂盒法
使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。9.2DNA质量检测
将提取的DNA用1.0%含溴化乙锭（或等效染料）的琼脂糖凝胶进行完整性检测。然后用核酸/蛋白分析仪分别在260nm和280nm下测定OD值，用于PCR反应的DNA纯度一般为1.6≤OD2/OD82.0
DNA浓度（ng/uL）=OD2eaX50X核酸稀释倍数3
iKAoNiKAca
SN/T4624.4—2016
实时荧光PCR鉴定
引物和探针序列
引物和探针序列见表2。其中探针的5端标记FAM.3端标记TAMRA表2引物和探针序列
鉴定菌名称
嗜酸氧化亚铁
硫杆菌
引物序列
5-AAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTC-3
5'-GGAGTTAGCCGGTGCTTCTTC-3
实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表3。
试剂名称
10×PCR缓冲液（含Mg+）
dNTP(2.5mmol/L)
TagDNA聚合酶（5U/μL）
正向引物和反向引物（25pmol/xL）探针
DNA模板（50ng~200ng）
双蒸水
探针序列
5'FAM-AGGACGAAAAGGYGGGTTCTA
ATACAATCTGCTA-TAMRA3
实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系
各1.0μL
补至25μ
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行造当调整9.3.3实时荧光PCR反应参数
实时荧光PCR反应参数：95℃预变性3min：95C变性15s，58℃退火延伸45s同时收集FAM荧光信号，进行40个循环。
使用不同实时荧光PCR仪，可对参数作适当调整空白对照、阴性对照和阳性对照设置9.3.4
阴性对照：非嗜酸氧化亚铁硫杆菌DNA为模板。阳性对照：已知嗜酸氧化亚铁硫杆菌的DNA或含有待测基因序列的质粒为模板。空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是实时荧光PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。9.3.5实时荧光PCR扩增结果判定9.3.5.1对照结果
阴性对照：无扩增曲线；Ct值≥40.0；4
-iKAoNiKAca
阳性对照：出现典型的扩增曲线Ct值应<30.0；空白对照：无扩增曲线；Ct值≥40.0。否则，检测视为无效。
9.3.5.2结果判定
Ct值≥40.0，可判定该样品实时荧光PCR结果为阴性；Ct值≤32.0，可判定该样品实时荧光PCR结果为阳性SN/T4624.4—2016
32.0Ct值40.0，建议重做。再次扩增后的外源基因Ct值仍小于40.0，且曲线有明显的对数增长期，并且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定为阳性；再次扩增后外源基因Ct值大于40.0，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，可判定为阴性。10
结果报告
当形态学鉴定、生化鉴定、分子生物学检测结果符合时，报告检出嗜酸氧化亚铁硫杆菌当形态学鉴定、生化鉴定、分子生物学检测不符合时，建议重做。仍有不符合时，报告未检出嗜酸氧化亚铁硫杆菌。
-TrKAoNiKAca
SN/T4624.4—2016
A.1LEPTOSPIRILLUM液体培养基
A.1.1成分
甲液：
硫酸铵（NH.）,SO
六水合氯化镁MgCl2
磷酸二氢钾KH2PO.
二水合氯化钙CaCl2·2HC
蒸馏水
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
用5mol/LHzSQ调节pH至1.8.112℃高压灭菌30min。乙液：
七水合亚硫酸铁FeSO，·7H,O
0.125mol/LH,So
该溶液pH应为1.2，112℃高压灭菌30min微量元素溶液：
二水合氯化锰MnCl
氯化锌ZnCl
·2H20
六水合氯化钴CoCl
硼酸H.BO3
钼酸钠Na,MoO
二水合氯化铜CuCl·2HO
蒸馏水
用5mol/LH,SO,调节pH至1.8,112℃高压灭菌30min。制法
现配现用，将甲液和乙液混合后加入0.1mL微量元素溶液，最终pH为1.8。A.2
硫代硫酸钠
A.2.1成分
甲液：
硫酸铵（NH）2SO
六水合氯化镁MgCl2·6H.O
磷酸二氢钾KH:PO
二水合氯化钙CaCl·2H.0
蒸馏水
-TTTKAONIKAca
用5mol/LHSO，调节pH至1.8，分装，112℃高压灭菌30min。艺液：
硫代硫酸钠Na,S,O
蒸馏水
用0.22um滤膜过滤除菌。
2制法
现配现用，将甲液和乙液混合，最终pH为1.8，分装。A.3葡萄糖
硫酸铵（NH)SO
六水合氯化镁MgCl2·6HO
磷酸二氢钾KH2PO4
二水合氯化钙CaCl，·2H,O
葡萄糖
蒸馏水
用5mol/LH,SO，调节pH至1.8.分装，112℃高压灭菌30min。A.4蔗糖
硫酸铵（NH）2SO
六水合氯化镁MgCl2
磷酸二氢钾KH.PO
二水合氯化钙CaCl2
蒸馏水
用5mol/LHzSO，调节pH至1.8.分装，12℃高压灭菌30min。A.5
5丙三醇
硫酸铵（NH）2SO
六水合氯化镁MgCl,·6H,O
磷酸二氢钾KH,PO
二水合氯化钙CaClz·2H,O
丙三醇
蒸馅水
用5mol/LH.SO。调节pH至1.8.分装，112℃高压灭菌30min。A.6
蛋白陈
硫酸铵（NH）,SO
六水合氯化镁MgCl2·6H.O
SN/T4624.4—2016
1000mL
1000mL
1000ml
SN/T4624.4—2016
磷酸二氢钾KH,PO4
二水合氯化钙CaC122HO
蛋白陈
蒸馏水
用5mol/LH,SO.调节pH至1.8，分装，112℃高压灭菌30min。LEPTOSPIRILLUM+葡萄糖
A.7.1成分
甲液：
硫酸铵（NH),SO
六水合氯化镁MgClz·6Hz0
磷酸二氢钾KH,PO
二水合氯化钙CaCl·2H20
葡葡糖
蒸馏水
用5mol/LHSO,调节pH至1.8112℃高压灭菌30min乙液：
七水合亚硫酸铁FeSO4·7H,O
0.125 mol/LH,SO4
该溶液pH应为1.2.112℃高压灭菌30min。A.7.2制法
现配现用，将甲液和乙液混合，最终pH为1.8，分装。A.8
LEPTOSPIRILLUM+蛋白陈
A.8.1成分
甲液：
硫酸铵（NH),SO
六水合氯化镁MgCl，·6H,0
磷酸二氢钾KHPO
二水合氯化钙CaCl·2H,0
蛋白陈
蒸馏水
用5mol/LHzSO，调节pH至1.8，112℃高压灭菌30min。乙液：
七水合亚硫酸铁FeSO4·7H.O
0.125mol/LH,SO
该溶液pH应为1.2,112℃高压灭菌30minA.8.2制法
现配现用，将甲液和乙液混合，最终pH为1.8，分装。8
1000mL
磷酸二氢铵
甲液：
磷酸二氢铵(NH)H,PO
六水合氯化镁MgCl2·6H，0
磷酸二氢钾KH,PO,
二水合氯化钙CaCl，·2H,O
蒸馏水
用5mol/LHzSO,调节pH至1.8，112℃高压灭菌30min。乙液：
七水合亚硫酸铁FeSO·7H,O
0.125mol/L.H,SO.
该溶液pH应为1.2112℃高压灭菌30min。A.9.2制法
现配现用，将甲液和乙液混合，最终pH为1.8，分装。硝酸钾
A.10.1成分
甲液：
硝酸钾KNO,
六水合氯化镁MgC12·6HO
磷酸二氢钾KH,PO
二水合氯化钙CaClz·2H,O
蒸馏水
用5mol/LHzSO4调节pH至1.8，112℃高压灭菌30min。乙液：
七水合亚硫酸铁FSO。·7H2O
0.125mol/LH,SO
该溶液pH应为1.2112℃高压灭菌30min。A.10.2制法
现配现用，将甲液和乙液混合，最终pH为1.8，分装，A.11pH1
A.11.1成分
甲液：
硫酸铵（NH.),SO
六水合氯化镁MgCl·6H.O
SN/T4624.4—2016
SN/T4624.4—2016
磷酸二氢钾KH,PO
二水合氯化钙CaCl，·2H,O
蒸馏水
用5mol/LHzSO.调节pH至1.0,112℃高压灭菌30min。乙液：
七水合亚硫酸铁FeSO.·7HO
0.125 mol/LH,SO,
该溶液pH应为1.2.112℃高压灭菌30min。A.11.2制法
现配现用，将甲液和乙液混合，调节PH至1.0.分装。A.12pH2
A.12.1成分
甲液：
硫酸铵（NH)SO
六水合氯化镁MgCl,·6H,0
磷酸二氢钾KH,PO
二水合氯化钙CaCl·2H，O
蒸馏水
用5mol/LH，SO.调节pH至2.0.112C高压灭菌30min乙液：
七水合亚硫酸铁FeSO，·7H，
0.125mol/L.H,SO
该溶液pH应为1.2.112℃高压火菌30minA.12.2制法
现配现用，将甲液和乙液混合，调节PH至2.0，分装A.13pH3
A.13.1成分
甲液：
硫酸铵（NH),SO
六水合氯化镁MgCl·6H，O
磷酸二氢钾KH,PO4
二水合氯化钙CaCl2·2H2O
蒸馏水
用5mol/LH，SO，调节pH至3.0,112℃高压灭菌30min。乙液：
七水合亚硫酸铁FeSO，：7HO
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入境环保用微生物菌剂检测方法第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌
Methods for examination of import microbial blends in the environmentalprotection-Part 4:Acidithiobacillus ferrooxidans2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分：第1部分：地衣芽孢杆菌：
第2部分：短小芽孢杆菌；
第3部分：巨大芽孢杆菌；
第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌；第5部分：β型溶血性链球菌：
第6部分：金黄色葡萄球菌；
第7部分：沙门氏菌；
第8部分：志贺氏菌；
第9部分：致泻大肠埃希氏菌；
第10部分：淡紫拟青霉；
第11部分：雅致小克银汉霉：
第12部分：哈茨木；
第13部分：黄孢原毛平革菌；
第14部分：焦曲霉；
第15部分：解淀粉芽孢杆菌：
第16部分：类产碱假单胞菌；
第17部分：恶臭假单胞菌。
本部分为SN/T4624的第4部分。
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局本部分主要起草人：王金玲、李靓、金雁、赵颖、贾琳、李瑶、王芳。SN/T4624.4—2016
1范围
入境环保用微生物菌剂检测方法第4部分.嗜酸氧化亚铁硫杆菌
SN/T4624.4—2016
SN/T4624的本部分规定了入境环保用微生物菌剂符合性检验嗜酸氧化亚铁硫杆菌的形态学鉴定、生化鉴定、实时荧光PCR检测方法。本部分适用于入境环保用微生物菌剂符合性检验嗜酸氧化亚铁硫杆菌的检测和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3分类地位
种名：Acidithiobacillusferrooxidans分类地位：原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。4主要试剂和培养基
实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。LEPTOSPIRILLUM液体培养基：见附录A中A.1。硫代硫酸钠：见A.2。
葡萄糖：见A.3，
煎糖：见A.4。
内三醇见A.5。
蛋白陈：见A.6。
LEPTOSPIRILLUM+葡萄糖：见A.7。LEPTOSPIRILLUM+蛋白陈：见A.8磷酸二氢铵：见A.9。
硝酸钾：见A.10。
pH1.见 A.11。
pH2.见A.12。
pH3:见A.13。
TE缓冲液（pH8.0）：见A.14。
TBE.见A.15。
TaqDNA聚合酶。
细菌基因组DNA提取试剂盒。
SN/T4624.4—2016
50XTAE缓冲液（pH8.5）：见A.16。琼脂糖。
溴化乙锭。
DNA分子量标记：100bpDNAladder主要仪器和设备
电子天平（感量0.01g）。
恒温培养箱：30℃土1℃bzxz.net
恒温振荡培养箱：30
恒温水浴锅。
台式冷冻离心机（最高转速15000/min）实时荧光PCR仪
微量移液器和灭菌吸头：10uL、20L200L1000gl
高压灭菌锅。
PCR超净工作台。
电泳仪。
核酸/蛋白分析仪
凝胶成像系统。
6样品制备
以无菌操作取10g（mL）样品加人到100mLLEPTOSPIRILL.UM液体培养基中混勾，在30℃士1℃、150r/min条件下培养4d.直至锥形瓶中颜色变成红棕色。7形态学鉴定
革兰氏染色：取6中的菌液10mL加到无菌离心管中，10000r/min离心10min，弃净上清，取沉淀做涂片进行革兰氏染色，镜检。菌体呈杆状，为革兰氏阴性8生化鉴定
用1.5mL无菌水悬浮7.1中沉淀，取悬浮水溶液进行生化鉴定，每管100μL在30℃土1℃150r/min条件下除硝酸钾培养5d外其余均培养3d，反应结果见表1。表1
嗜酸氧化亚铁硫杆菌生化特征
鉴定项目
硫代硫酸钠
葡萄糖
丙三醇
嗜酸氧化亚铁硫杆菌
rKAoNiKAca
鉴定项目
蛋白陈
LEPTOSPIRILLUM+葡萄糖
LEPTOSPIRILLUM+蛋白陈
硝酸钾
磷酸二氢铵
9分子生物学检测
细菌模板DNA的提取
直接提取法
表1（续）
SN/T4624.4—2016
嗜酸氧化亚铁硫杆菌
取6中菌液2mL加到2mL无菌离心管中，10000/min离心2min，尽量弃净上清，沉淀加人TE100uL10mg/mL溶菌酶100
℃温育30min.12000r/min离心2min，沉淀加入TE缓冲液酶K
600μL重悬，再加人15mg/mL蛋白25uL.55℃温育1h后沸水浴10min，12000r/min离心0℃保存以待检测
5min.取上清保存于一20
有机溶剂提取法
取6中菌液2mL加到2mL无菌离心管中，10000r/min离心2min，弃上清，尽量弃净上清，沉淀加人TE缓冲液570μL重悬，然后加入10mg/mL溶菌酶100L，37℃温育30min，再加人10%SDS30μL65℃温育10min，加入等体积的酚混匀，12000/min离心10min，取上清移人一新离心管中，重复一次，两次酚抽提后取上清加等体积的酚/氯仿（1体积比）混匀，12000r/min离心10min，取上清再移人一新离心管中，加等体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/L乙酸钠，轻缓颠倒混匀，12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用500uL75%乙醇洗两次，离心管开盖室温放置数分钟使乙醇挥发，加入100μL无菌水（预先加热至65℃有利于DNA溶解），一20℃保存以待检测。9.1.3试剂盒法
使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。9.2DNA质量检测
将提取的DNA用1.0%含溴化乙锭（或等效染料）的琼脂糖凝胶进行完整性检测。然后用核酸/蛋白分析仪分别在260nm和280nm下测定OD值，用于PCR反应的DNA纯度一般为1.6≤OD2/OD82.0
DNA浓度（ng/uL）=OD2eaX50X核酸稀释倍数3
iKAoNiKAca
SN/T4624.4—2016
实时荧光PCR鉴定
引物和探针序列
引物和探针序列见表2。其中探针的5端标记FAM.3端标记TAMRA表2引物和探针序列
鉴定菌名称
嗜酸氧化亚铁
硫杆菌
引物序列
5-AAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTC-3
5'-GGAGTTAGCCGGTGCTTCTTC-3
实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表3。
试剂名称
10×PCR缓冲液（含Mg+）
dNTP(2.5mmol/L)
TagDNA聚合酶（5U/μL）
正向引物和反向引物（25pmol/xL）探针
DNA模板（50ng~200ng）
双蒸水
探针序列
5'FAM-AGGACGAAAAGGYGGGTTCTA
ATACAATCTGCTA-TAMRA3
实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系
各1.0μL
补至25μ
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行造当调整9.3.3实时荧光PCR反应参数
实时荧光PCR反应参数：95℃预变性3min：95C变性15s，58℃退火延伸45s同时收集FAM荧光信号，进行40个循环。
使用不同实时荧光PCR仪，可对参数作适当调整空白对照、阴性对照和阳性对照设置9.3.4
阴性对照：非嗜酸氧化亚铁硫杆菌DNA为模板。阳性对照：已知嗜酸氧化亚铁硫杆菌的DNA或含有待测基因序列的质粒为模板。空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是实时荧光PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。9.3.5实时荧光PCR扩增结果判定9.3.5.1对照结果
阴性对照：无扩增曲线；Ct值≥40.0；4
-iKAoNiKAca
阳性对照：出现典型的扩增曲线Ct值应<30.0；空白对照：无扩增曲线；Ct值≥40.0。否则，检测视为无效。
9.3.5.2结果判定
Ct值≥40.0，可判定该样品实时荧光PCR结果为阴性；Ct值≤32.0，可判定该样品实时荧光PCR结果为阳性SN/T4624.4—2016
32.0Ct值40.0，建议重做。再次扩增后的外源基因Ct值仍小于40.0，且曲线有明显的对数增长期，并且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定为阳性；再次扩增后外源基因Ct值大于40.0，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，可判定为阴性。10
结果报告
当形态学鉴定、生化鉴定、分子生物学检测结果符合时，报告检出嗜酸氧化亚铁硫杆菌当形态学鉴定、生化鉴定、分子生物学检测不符合时，建议重做。仍有不符合时，报告未检出嗜酸氧化亚铁硫杆菌。
-TrKAoNiKAca
SN/T4624.4—2016
A.1LEPTOSPIRILLUM液体培养基
A.1.1成分
甲液：
硫酸铵（NH.）,SO
六水合氯化镁MgCl2
磷酸二氢钾KH2PO.
二水合氯化钙CaCl2·2HC
蒸馏水
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
用5mol/LHzSQ调节pH至1.8.112℃高压灭菌30min。乙液：
七水合亚硫酸铁FeSO，·7H,O
0.125mol/LH,So
该溶液pH应为1.2，112℃高压灭菌30min微量元素溶液：
二水合氯化锰MnCl
氯化锌ZnCl
·2H20
六水合氯化钴CoCl
硼酸H.BO3
钼酸钠Na,MoO
二水合氯化铜CuCl·2HO
蒸馏水
用5mol/LH,SO,调节pH至1.8,112℃高压灭菌30min。制法
现配现用，将甲液和乙液混合后加入0.1mL微量元素溶液，最终pH为1.8。A.2
硫代硫酸钠
A.2.1成分
甲液：
硫酸铵（NH）2SO
六水合氯化镁MgCl2·6H.O
磷酸二氢钾KH:PO
二水合氯化钙CaCl·2H.0
蒸馏水
-TTTKAONIKAca
用5mol/LHSO，调节pH至1.8，分装，112℃高压灭菌30min。艺液：
硫代硫酸钠Na,S,O
蒸馏水
用0.22um滤膜过滤除菌。
2制法
现配现用，将甲液和乙液混合，最终pH为1.8，分装。A.3葡萄糖
硫酸铵（NH)SO
六水合氯化镁MgCl2·6HO
磷酸二氢钾KH2PO4
二水合氯化钙CaCl，·2H,O
葡萄糖
蒸馏水
用5mol/LH,SO，调节pH至1.8.分装，112℃高压灭菌30min。A.4蔗糖
硫酸铵（NH）2SO
六水合氯化镁MgCl2
磷酸二氢钾KH.PO
二水合氯化钙CaCl2
蒸馏水
用5mol/LHzSO，调节pH至1.8.分装，12℃高压灭菌30min。A.5
5丙三醇
硫酸铵（NH）2SO
六水合氯化镁MgCl,·6H,O
磷酸二氢钾KH,PO
二水合氯化钙CaClz·2H,O
丙三醇
蒸馅水
用5mol/LH.SO。调节pH至1.8.分装，112℃高压灭菌30min。A.6
蛋白陈
硫酸铵（NH）,SO
六水合氯化镁MgCl2·6H.O
SN/T4624.4—2016
1000mL
1000mL
1000ml
SN/T4624.4—2016
磷酸二氢钾KH,PO4
二水合氯化钙CaC122HO
蛋白陈
蒸馏水
用5mol/LH,SO.调节pH至1.8，分装，112℃高压灭菌30min。LEPTOSPIRILLUM+葡萄糖
A.7.1成分
甲液：
硫酸铵（NH),SO
六水合氯化镁MgClz·6Hz0
磷酸二氢钾KH,PO
二水合氯化钙CaCl·2H20
葡葡糖
蒸馏水
用5mol/LHSO,调节pH至1.8112℃高压灭菌30min乙液：
七水合亚硫酸铁FeSO4·7H,O
0.125 mol/LH,SO4
该溶液pH应为1.2.112℃高压灭菌30min。A.7.2制法
现配现用，将甲液和乙液混合，最终pH为1.8，分装。A.8
LEPTOSPIRILLUM+蛋白陈
A.8.1成分
甲液：
硫酸铵（NH),SO
六水合氯化镁MgCl，·6H,0
磷酸二氢钾KHPO
二水合氯化钙CaCl·2H,0
蛋白陈
蒸馏水
用5mol/LHzSO，调节pH至1.8，112℃高压灭菌30min。乙液：
七水合亚硫酸铁FeSO4·7H.O
0.125mol/LH,SO
该溶液pH应为1.2,112℃高压灭菌30minA.8.2制法
现配现用，将甲液和乙液混合，最终pH为1.8，分装。8
1000mL
磷酸二氢铵
甲液：
磷酸二氢铵(NH)H,PO
六水合氯化镁MgCl2·6H，0
磷酸二氢钾KH,PO,
二水合氯化钙CaCl，·2H,O
蒸馏水
用5mol/LHzSO,调节pH至1.8，112℃高压灭菌30min。乙液：
七水合亚硫酸铁FeSO·7H,O
0.125mol/L.H,SO.
该溶液pH应为1.2112℃高压灭菌30min。A.9.2制法
现配现用，将甲液和乙液混合，最终pH为1.8，分装。硝酸钾
A.10.1成分
甲液：
硝酸钾KNO,
六水合氯化镁MgC12·6HO
磷酸二氢钾KH,PO
二水合氯化钙CaClz·2H,O
蒸馏水
用5mol/LHzSO4调节pH至1.8，112℃高压灭菌30min。乙液：
七水合亚硫酸铁FSO。·7H2O
0.125mol/LH,SO
该溶液pH应为1.2112℃高压灭菌30min。A.10.2制法
现配现用，将甲液和乙液混合，最终pH为1.8，分装，A.11pH1
A.11.1成分
甲液：
硫酸铵（NH.),SO
六水合氯化镁MgCl·6H.O
SN/T4624.4—2016
SN/T4624.4—2016
磷酸二氢钾KH,PO
二水合氯化钙CaCl，·2H,O
蒸馏水
用5mol/LHzSO.调节pH至1.0,112℃高压灭菌30min。乙液：
七水合亚硫酸铁FeSO.·7HO
0.125 mol/LH,SO,
该溶液pH应为1.2.112℃高压灭菌30min。A.11.2制法
现配现用，将甲液和乙液混合，调节PH至1.0.分装。A.12pH2
A.12.1成分
甲液：
硫酸铵（NH)SO
六水合氯化镁MgCl,·6H,0
磷酸二氢钾KH,PO
二水合氯化钙CaCl·2H，O
蒸馏水
用5mol/LH，SO.调节pH至2.0.112C高压灭菌30min乙液：
七水合亚硫酸铁FeSO，·7H，
0.125mol/L.H,SO
该溶液pH应为1.2.112℃高压火菌30minA.12.2制法
现配现用，将甲液和乙液混合，调节PH至2.0，分装A.13pH3
A.13.1成分
甲液：
硫酸铵（NH),SO
六水合氯化镁MgCl·6H，O
磷酸二氢钾KH,PO4
二水合氯化钙CaCl2·2H2O
蒸馏水
用5mol/LH，SO，调节pH至3.0,112℃高压灭菌30min。乙液：
七水合亚硫酸铁FeSO，：7HO
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