SN/T 4624.11-2016.Methods for examination of import microbial blends in the environmental protection-Part 11 :Cunninghamella elegans.
1范围
SN/T 4624.11规定了人境环保用微生物菌剂符合性检验雅致小克银汉霉的形态学鉴定、实时荧光PCR检测方法。
SN/T 4624.11适用于人境环保用微生物菌剂符合性检验雅致小克银汉霉检测和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682、分析实验室用水规格和试验方法
3主要试剂和培养基
3.1实验 用水应符合GB/T 6682中- -级水的规格。
3.2 马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(PDA):见附录A中A.1。
3.3 马铃薯葡萄糖液体培养基:见A.2。
3.4 CTAB缓冲液:见A.3。
3.5 蛋白酶K。
3.6 Tris饱和酚。
3.7三氯甲烷。
3.8 异戊醇。
3.9异丙醇。
3.10 TE缓冲液(pH 8.0):见A.4。
3.11 70%乙醇。
3.12溴化乙锭。
3.13 DNA分子量标记:1000 bp DNA ladder.
3.14琼脂糖。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4624.11-2016
入境环保用微生物菌剂检测方法第11部分：雅致小克银汉霉
Methods for examination of import microbial blends in the environmentalprotection-Part 11:Cunninghamella elegans2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
SN/T4624入境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分第1部分：地衣芽孢杆菌；
第2部分：短小芽孢杆菌：
第3部分：巨大芽孢杆菌：
第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌；第5部分：β型溶血性链球菌；
第6部分：金黄色葡萄球菌；
第7部分：沙门氏菌；
第8部分：志贺氏菌；
第9部分：致冯大肠埃希氏菌：
第10部分：淡紫拟青；
第11部分：雅致小克银汉霉；
第12部分：哈茨木霉；
第13部分：黄孢原毛平革菌；
第14部分：焦曲霉；
第15部分：解淀粉芽孢杆菌：
第16部分：类产碱假单胞菌；
第17部分：恶臭假单胞菌。
本部分为SN/T4624的第11部分
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草，本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、沈阳药科大学。本部分主要起草人：李俊环、王秋艳、徐慰倬、贺瑞、张新元、王芳。SN/T4624.11—2016
1范围
入境环保用微生物菌剂检测方法第11部分：雅致小克银汉霉
SN/T4624.11—2016
SN/T4624的本部分规定了入境环保用微生物菌剂符合性检验雅致小克银汉霉的形态学鉴定、实时荧光PCR检测方法。
本部分适用于人境环保用微生物菌剂符合性检验雅致小克银汉霉检测和鉴定。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注口期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3
主要试剂和培养基
实验用水应符合GB/T6682中级水的规格。马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（PDA)：见附录A中A马铃薯-葡萄糖液体培养基：见A.2CTAB缓冲液：见A.3。
蛋白酶K。
Tris饱和酚。
三氯甲烷。
异戊醇。
异丙醇。
TE缓冲液（pH8.0)：见A.4。
70%乙醇。
溴化乙锭。
DNA分子量标记：1000bpDNAladder。3.13
琼脂糖。
50XTAE缓冲液（pH8.5）：见A.5RealMasterMix(2.5×，含ROx内参染料)。20XProbe Enhancer Solution。液氮。
主要设备和材料
电子天平（感量0.01g）。
恒温培养箱：25℃±1℃。
SN/T4624.112016
4.3恒温振荡器：25℃+1℃
4.4恒温水浴锅
台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。PCR超净工作台。
实时荧光PCR仪。
微量移液器和灭菌吸头：10uL、20uL、200μL、1000μl。高压灭菌锅。
电泳仪装置。
核酸/蛋白分析仪，
凝胶成像系统。
陶瓷研钵。
无菌培养血：直径90mm。
火菌三角烧瓶：500mL.250mL。
接种棒、镍铬丝。
Eppendorf管和PCR反应管。
显微镜：物镜10×~100×。
5样品制备、培养
5.1无菌操作取1g（mL）样品加人到100mL无菌水中混勺，移取1环菌液连续划线接种5个PDA琼脂平板，25℃十1℃条件下培养3d~5d，观察琼脂平板上的菌落特征。取样过程中，在样品旁边放置1个PDA平板作为空白对照。
5.2挑取单菌落划线接种在PDA平板上.25℃土1℃条件下培养3d5d，得到纯化的菌株，进行形态学鉴定。
5.3挑取符合形态学特征单菌落转人马铃薯-葡萄糖液体培养基中，25℃土1℃条件下180r/min振荡培养3d~5d,获得菌丝体
鉴定特征
6.1培养性状
雅致小克银汉霉生长迅速，接种PDA平板，25℃培养3d后菌落直径为80mm左右，高10mm~15mm左右，表面长绒絮状，灰黑色，反面暗黄或深灰黑色。6.2
2形态特征
囊轴倒梨形，项囊直径5.2μm12.5pm，小孢囊黑褐色，球形至椭圆形，表面粗糙，直径6.5um~8.3um或(8.0μm~9.3um)X(6.8μm~8.2μm)7分子生物学检测
模板DNA的提取
7.1.1直接提取法
取5.3中菌液过滤抽干收集菌丝，取0.1g菌丝于液氮中研磨至粉末状，收集粉末于1.5mlL离心管2
rKAoNrKAca
SN/T 4624.11—2016
中，加人500uLCTAB缓冲液（其中含0.1g蛋白酶K）混勾，65℃水浴1h；13000r/min离心5min~10min，保留上清液：加500μl.Tris饱和酚：三氯甲烷：异戊醇（体积为25：24：1）混勾，13000r/min离心5min~10min，保留上清液：加500μL三氯甲烷：异戊醇（体积为24：1）混匀，13000r/min离心5min~10min，保留上清液，加人1mL异丙醇混匀，一70℃下放置1h，或一20℃过夜：13000r/min离心30min，可见DNA沉淀；70%乙醇冲洗DNA沉淀，空温干燥用50μL~~100μLTE溶解DNA，置于一20℃下保存备用。
试剂盒法
使用商品化的真菌基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。选择商品化试剂盒的原则是所提取的DNA质量好并且提取率高。DNA质量检测
将提取的DNA用1.0%的琼脂糖凝胶（含溴化乙锭或等效染料）进行完整性检测采用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。DNA浓度计算公式：DNA浓度（ng/uL)=OD2X50×核酸稀释倍数若OD260/OD280在1.82.0之间，表明DNA纯度较好，可用于实时荧光PCR检测实时荧光PCR鉴定
引物和探针序列
引物和探针序列见表1。其中探针的5端标记FAM,3端标记TAMRA。引物和探针序列
引物序列
雅致小克5'-TCCCTTGGGAAGGATGCA-35'-CCAGGCTACATTTCCTCTATTTTTTT -3银汉霉
实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表2。
试剂名称
2.5X Real Master Mix
正向引物（20pmol/μL）
反向引物（20pmol/μL）
探针（3pmol/μL）
20XProbeEnhancer solution
DNA模板
探针序列
5‘FAM-TTGCCTGCTATGTATGCCAGCGACA-TAMRA3实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系
补充至25μL
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。3
TTTKAONIKAca
SN/T 4624.11—2016
实时荧光PCR反应参数
实时荧光PCR反应参数见表3。
表3实时荧光PCR反应参数
注：使用不同实时荧光PCR仪，可对参数作适当调整。7.2.4空白对照、阴性对照和阳性对照设置阴性对照：非雅致小克银汉霉DNA为模板：时间
起始模板变性
PCR循坏中模板变性
阳性对照：已知雅致小克银汉霉的DNA（参见附录B)或含有待测基因[序列的质粒为模板；空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是实时荧光PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）7.2.5实时荧光PCR扩增结果判定7.2.5.1对照结果
阴性对照、阳性对照、空白对照结果应满足下列要求：阴性对照：无扩增曲线，Ct值≥400，阳性对照：出现典型的扩增曲线.Ct值应30.0
空白对照：无扩增曲线，Ct值≥40.0否则，检测视为无效。
7.2.5.2结果判定
在阴性对照、阳性对照，空白对照均正常的情况下：Ct值≥40.0，可判定该样品实时荧光PCR结果为阴性；-Ct值≤35.0，可判定该样品实时荧光PCR结果为阳性：35.0Ct值<40.0，建议重做。再次扩增后的目标基因Ct值仍小于40.0，且曲线有明显的对数增长期，并且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定为阳性；再次扩增后目标基因C1值大于或等于40.0，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，可判定为阴性8结果报告
当形态学试验、实时荧光PCR检测试验结果均符合时，报告检出雅致小克银汉霉。当形态学试验、实时荧光PCR检测试验出现不符合结果时，建议重做。仍不符合时，报告未检出雅致小克银汉霉。
rKAoNrKAca
马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（PDA）A.1.1
马铃薯提取液
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
SN/T4624.11—2016
取去皮马铃薯300g，切成小块加1000ml蒸溜水，煮沸10min~20min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000mL。
A.1.2其他成分
葡萄糖
A.1.3制法
将以上两组成分混合加热溶化，分装后，pH值自然，121℃高压灭菌20min。A.2
马铃薯-葡萄糖液体培养基
马铃薯提取液
取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000mL煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000mL。A.2.2其他成分
葡萄糖
将以上两组成分混合加热溶化，pH值自然，121℃高压灭菌15min。CTAB缓冲液
氯化钠（NaCI)
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)
1mol/LTris-HCl(pH8.0)
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
去离子水
A.3.2制法
将以上成分混合溶化，用去离子水定容至1000ml，121℃高压灭菌15min。5
TiKAoNiKAca
SN/T4624.11—2016
TE缓冲液
Tris碱
Na,EDTA·2H,O
去离子水
A.4.2制法
1000mL
在800mL去离子水中，依次加入以上成分，调节pH至8.0，用去离子水定容到1L，分装后121℃离压灭菌15min。
50XTAE缓冲液
冰醋酸
0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)
去离子水
2制法
将以上成分混合溶化，用去离子水定容至1.000mL，121℃高压灭菌15min。iYKAoNiKAca
（资料性附录）
雅致小克银汉霉基因序列（GenBankJN206602.1）1 gcggaggaaa agaaaataac aatgattccc ctagtaacgg cgagigaaga61 caaagttgga
acctggtggg catagctcac ccggattgta aactaaagtt121 ttagtcagcc
181ctttggcctg
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SN/T4624.11-2016
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SN/T4624.11-2016
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
入境环保用微生物菌剂检测方法第11部分：雅致小克银汉霉
SN/T4624.11—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010）68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
2017年11月第一版bzxZ.net
印张0.75
字数16千字
2017年11月第一次印刷
印数1-500
书号：155066：2-32285
定价16.00元
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