SN/T 4624.9-2016
基本信息
标准号： SN/T 4624.9-2016
中文名称：入境环保用微生物菌剂检测方法第9部分:致泻大肠埃希氏菌
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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下载大小：5553248
相关标签： 入境 环保 微生物 菌剂 检测 方法 致泻 大肠 埃希氏
标准分类号
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出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4624.9-2016.Methods for examination of import microbial blends in the environmental
protection-Part 9 : Diarrheogenic Escherichia coli.
1范围
SN/T 4624.9规定了人境环保用微生物菌剂卫生学检验致泻大肠埃希氏菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR、实时荧光PCR检测方法
SN/T 4624.9适用于人境环保用微生物菌剂中致泻大肠埃希氏菌的检测和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3主要试剂和培养基
3.1实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。
3.2生理盐水:见附录 A中A.1。
3.3营 养肉汤:见A.2。
3.4 肠道菌增菌肉汤:见A.3。
3.5麦康凯琼脂:见A.4。
3.6 伊红美蓝琼脂:见A.5。
3.7 三糖铁琼脂:见A.6。
3.8 克氏双糖铁琼脂:见A.7。
3.9 糖发酵管(乳糖、鼠李糖.木糖和甘露醇):见A.8。
3.10赖氨酸脱羧酶试验培养基:见A.9。
protection-Part 9 : Diarrheogenic Escherichia coli.
1范围
SN/T 4624.9规定了人境环保用微生物菌剂卫生学检验致泻大肠埃希氏菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR、实时荧光PCR检测方法
SN/T 4624.9适用于人境环保用微生物菌剂中致泻大肠埃希氏菌的检测和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3主要试剂和培养基
3.1实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。
3.2生理盐水:见附录 A中A.1。
3.3营 养肉汤:见A.2。
3.4 肠道菌增菌肉汤:见A.3。
3.5麦康凯琼脂:见A.4。
3.6 伊红美蓝琼脂:见A.5。
3.7 三糖铁琼脂:见A.6。
3.8 克氏双糖铁琼脂:见A.7。
3.9 糖发酵管(乳糖、鼠李糖.木糖和甘露醇):见A.8。
3.10赖氨酸脱羧酶试验培养基:见A.9。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4624.9—2016
入境环保用微生物菌剂检测方法第9部分：致泻大肠埃希氏菌
Methods for examination of import microbial blends in the environmentalprotectionPart9:DiarrheogenicEscherichia coli2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
金屋责真伪
2017-03-01实施
SN/T4624《入境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分：第1部分：地衣芽孢杆菌；
第2部分：短小芽孢杆菌；
第3部分：巨大芽孢杆菌；
第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌；第5部分：β型溶血性链球菌：
第6部分：金黄色葡菊球菌；
第7部分：沙门氏菌；
第8部分：志贺氏菌；
第9部分：致泻大肠埃希氏菌：
第10部分：淡紫拟青霉：
第11部分：雅致小克银汉霉；
第12部分：哈茨木霉；
第13部分：黄孢原毛平革菌：
第14部分：焦曲霉；
第15部分：解淀粉芽孢杆菌；
第16部分：类产碱假单胞菌；
第17部分：恶臭假单胞菊。
本部分为SN/T4624的第9部分
本部分按照GB/T1.1—2C09给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局本部分主要起草人：李成铺、王秋艳、于丽、姜玲玲、康凯、王芳。SN/T4624.9-—2016
1范围
入境环保用微生物菌剂检测方法第9部分：致泻大肠埃希氏菌
SN/T4624.9—2016
SN/T4624的本部分规定了入境环保用微生物菌剂卫生学检验致泻大肠埃希氏菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR、实时荧光PCR检测方法本部分适用于人境环保用微生物菌剂中致泻大肠埃希氏菌的检测和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3主要试剂和培养基
实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格生理盐水：见附录A中A.1。
营养肉汤：见A.2。
肠道菌增菌肉汤：见A.3。
麦康凯琼脂：见A.4。
伊红美监琼脂：见A.5。
三糖铁琼脂：见A.6。
克氏双糖铁琼脂：见A.7。
糖发酵管（乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇）：见A.8赖氨酸脱羧酶试验培养基：见A.9尿素琼脂：见A.10。
氰化钾：见A.11。
蛋白陈水、靛基质试剂：见A.12。半固体琼脂：见A.13。
氧化酶试剂：见A.14。
3.16革兰氏染色液：见A.15
3.17致病性大肠埃希氏菌诊断血清、侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清、产肠毒素大肠埃希氏菌诊断血清、出血性大肠埃希氏菌诊断血清。3.18细菌基因组DNA提取试剂盒。3.19
TE缓冲液（pH8.0）：见A.16。
溶菌酶（10mg/mL）：见A.17。
蛋白酶K（20mg/mL）：见A.18。10%SDS：见A.19.
SN/T4624.9—2016
3mol/L乙酸钠：见A.20。
dNTP:dATPdTTP、dGTP、dCTP
TBE.见A.21。
TaqDNA聚合酶。
琼脂糖。
溴化艺锭。
DNA分子量标记：10obpDNAladder。4主要仪器和设备
电子天平（感量0.01g）。
恒温培养箱：36℃士1℃、42℃1℃。恒温水浴锅。
台式冷冻离心机（最高转速15.000r/min）。PCR扩增仪。
实时荧光PCR仪。
微量移液器和灭菌吸头：10L、20、200μL、1000μL。高压灭菌锅。
PCR超净工作台。
电泳仪。
核酸/蛋白分析仪，
凝胶成像系统
无菌培养Ⅲ：直径90mm。
5样品制备
以无菌操作取1g（mL）样品加到100mL生理盐水中混匀，从中移取25mL加入到225mL灭菌生理盐水中混匀。取样过程中，在样品旁边放置1个营养琼脂平板作为空白对照。形态学及生化、血清学鉴定
6.1增菌
无菌条件下，移取25mL上述样品匀液至盛有225mL肠道菌增菌肉汤的无菌均质袋内·用拍击式均质器拍打1min~2min.将上述样品勾液于42℃培养18h~24h。6.2分离
将增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美监琼脂平板，于36℃土1℃培养18h~24h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落6.3
生化鉴定
6.3.1自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂（TSI)或克氏双糖铁琼脂（KI。同时将这些培养物分别接种蛋白陈水，半固体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36℃培养过夜
TKAONKAca
SN/T4624.9—2016
2TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性，KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌。6.3.2
TSI底层不产酸，或H2S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。
6.4血清学鉴定
挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性人肠埃希氏菌O157血清做玻片凝集试验。当与某一种多价O而清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。致泻大肠埃希氏菌所包括的○抗原群见表1。如与某一个单价O血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。表1致泻大肠埃希氏菌所包括的0抗原群大肠埃希氏菌的种类
所包括的○抗原群
O26055O86O111ab 011401190125acO127O128ac014201580157
028ac029 0112ac011501240135013601430144015201640167060110150200250270630780850114011501250128ac01480149015901660167
制备O抗原悬液，稀释至与MacFarland3号比浊管相当的浓度。原效价为（I：160）（1：320）的O血清，用0.5%盐水稀释至1：40。稀释血清与抗原悬液在10mm×75mm试管内等量混合，做单管凝集试验。混勾后放于50℃水浴锅内，经16h后观察结果。如出现凝集，可证实为该0抗原。6.5
结果与报告
综合以上生化鉴定和血清学鉴定的结果，报告检出或未检出致泻大肠埃希氏菌。7分子生物学检测（选做项目）
7.1细菌模板DNA的提取
7.1.1直接提取法
取6.1中菌液2mL加到2ml无菌离心管中，10000r/min离心2min，尽量弃奔挣上清，沉淀加人TE100μL，10mg/mL溶菌酶100μl.37℃温育30min，12000r/min离心2min，沉淀加人TE缓冲液600μL重悬，再加人20mg/mL蛋白酶K25μL，55温育1h后沸水浴10min，12000r/min离心5min，取上清保存于一20℃保存以待检测7.1.2有机溶剂提取法
取6.1中菌液2mL加到2ml.无菌离心管中，10000r/min离心2min，弃上清，尽量弃净上清，沉淀加人TE缓冲液570L重悬，然后加人10mg/mL溶菌酶100μL,37℃温育30min，再加人10%SDS30uL，65℃温育10min，加人等体积的酚混勾，12000r/min离心10min，取上清移入一新离心管中，重复一次，两次酚抽提后取上清加等体积的酚/氯仿（1：1，体积比）混匀，12000r/min离心10min取上清再移入一新离心管中，加等体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/L乙酸钠，轻缓颠倒混匀，3
-TTKAONKAca
SN/T4624.9-—2016
12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用500uL75%乙醇洗两次，离心管开盖室温放置数分钟使乙醇浑发，加人100uL无菌水（预先加热至65℃有利于DNA溶解），一20℃保存以待检测。7.1.3试剂盒法
使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。7.2DNA质量检测
将提取的DNA用1.0%含溴化乙锭（或等效染料）的琼脂糖凝胶进行完整性检测。然后用核酸/蛋白分析仪分别在260nm和280nm下测定OD值，用于PCR反应的DNA纯度一般为1.6≤OD2%g/OD280≤2.0
DNA浓度（ng/uL）=ODaX50×核酸稀释倍数7.3PCR鉴定
引物序列
引物序列及扩增片段长度见表2。表2
致泻大肠埃希氏菌
肠侵袭性大肠埃希氏菌
肠致病性大肠埃希氏菌
产肠毒素大肠埃希氏菌
肠出血性大肠埃希氏菌
O157:H7
反应体系
PCR反应体系见表3。
引物来源
试剂名称
PCR扩增引物序列及扩增片段长度引物序列
5'-CTGGATGGTATGGTGAGG-3
GGAGGO
CAACAA TTA TTT CC-3
GGTCTGTATATTGGGCAGACC-3
GCC GCTTTA TCCAAC CTG GTA-3
TCCTTCATC
CTTTCAATGE
GCTTT-3
5-ATTGCGbzxZ.net
CTG AGGCCTE
5'-CGAGTA
CAT TGG CAT CGT G-3°
表3PCR反应体系
PCR反应体系
10XPCR缓冲液（含Mg+）
dNTP(10mmol/L)
TagDNA聚合酶（5U/μL）
正向引物和反向引物（10μmol/L）DNA模板（50ng~200ng）
双蒸水
各1.0μL
补至25.0
注：反应体系中各试剂的量可根据具休情况或不同的反应总体积进行适当调整4
扩增片段大小
-TTKAONIKAca
7.3.3PCR反应条件
SN/T 4624.9—2016
94℃预变性3min；94℃变性605.60℃退火60s，72℃延伸60s，进行35个循环：72℃延伸7min，4℃保存反应产物。
使用不同PCR仪，可对参数作适当调整。7.3.4空白对照、阴性对照和阳性对照设置阴性对照：非致泻大肠埃希氏菌DNA为模板。阳性对照：已知致泻大肠埃希氏菌的DNA或合有待测基因序列的质粒为模板A时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是PCR反应空白对照：设两个，一是提取DNA的空白对照（以水代替DNA模板）。7.3.5PCR扩增产物的电泳检测
用电泳缓冲液（0.5×TBE）制备2%琼脂糖凝胶：取5LPCR扩增产物，和1μL上样缓冲液混合，进行点样，DNAmarker(100bpDNAlaeer>做参照
60min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。7.3.6PCR扩增结果判定和报告
7.3.6.1对照结果
阳性对照：出现已知目的扩增条带阴性对照：未出现特征条带。
空白对照：术出现特征条带。
7.3.6.2结果判定和报告
对照实验结果正常，待测样品未出现已知告未检出致泻大肠埃希氏菌。
V/cm~5V/cm恒压电泳，电泳50min~的扩增条带，则可判定该样品PCR扩增结果为阴性，报对照实验结果正常，待测样品出现已知目的扩增条带，则可初步判定该样品PCR扩增结果为阳性，应依据第6章中生化鉴定和血清学鉴定对该菌进行步确认，最终结果以生化鉴定和血清学鉴定的检测结果为准，报告检出（或未检出）致泻大肠埃希氏菌。对照实验结果异常，本次待测样品的结果无效，应重新做实验，并排除污染因素。7.4实时荧光PCR鉴定
引物和探针序列
引物和探针序列见表4。其中探针的5端标记FAM，3端标记TAMRA。表4引物和探针序列
鉴定菌名称
出血性
大肠埃希氏菌
引物序列
5-TCCTCAGCTATAGGGTGCTTTTG-3
5'-ATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTAC-3探针序列
5'FAM-TATTTTTCCGAGTACATT
GGCATCGTGTGG TAMRA3'
TKAONKAca
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7.4.2实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表5。
表5实时荧光PCR反应体系
试剂名称
10×PCR缓冲液（含Mg+）
dNTPs(10 mmol/L)
TagDNA聚合酶5U/L）
正向引物利反向引物（20mol/L）探针（20μmo/1/L）
DNA模板
双蒸水
实时荧光PCR反应体系
补室25叫L
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整7.4.3实时荧光PCR反应参数
实时荧光PCR反应参数：37℃5min，95℃预变性3min：94℃变性5s，60℃退火延伸40s，同时收集FAM荧光信号，进行40个循环，4℃保存反应产物。使用不同实时荧光PCR仪，可对参数作适当调整。7.4.4空白对照，阴性对照和阳性对照设置阴性对照：非出血性大肠埃希氏菌DNA为模板。阳性对照：已知出血性大肠埃希氏菌的DNA或含有待测基因序列的质粒为模板。空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是实时荧光PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。7.4.5实时荧光PCR扩增结果判定和报告7.4.5.1对照结果
阴性对照：无扩增曲线：Ct值≥40.0。阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct值应30.0。空白对照：无扩增曲线：Ct值≥40.0。否则，检测视为无效。
7.4.5.2结果判定和报告
Ct值≥40.0，可判定该样品实时荧光PCR结果为阴性，报告未检出出血性大肠埃希氏菌，Ct值35.0，可初步判定该样品实时荧光PCR结果为阳性，应依据第6章中生化鉴定和血清学鉴定对该菌进行进一步确认，最终结果以生化鉴定和血清学鉴定的检测结果为准，报告检山(或未检出)出血性大肠埃希氏菌。35.0Ct值40.0.建议重做。再次扩增后的外源基因Ct值仍小于40，且曲线有明显的对数增长期，并且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定为阳性：再次扩增后外源基因Ct值大于或等于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，可判定为阴性。6
-iiKAoNiKAca
生理盐水
氯化钠
蒸馏水
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
1000mL
称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压火菌15min。A.2
营养肉汤
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
1000ml
SN/T4624.9—2016
在1000mL蒸馏水中分别加人10.0g蛋白陈，3.0g牛肉膏，5g氯化钠，溶解，调节pH至7.4,121℃高压灭菌15min。
肠道菌增菌肉汤
蛋白陈
葡萄糖
磷酸二氢钾
磷酸氢二钠
牛胆盐
蒸馏水
1000ml
在1000mL蒸馏水中分别加人10.0g蛋白陈，5.0g葡萄糖，20g牛胆盐，8g磷酸氢二钠，2.0g磷酸二氢钾，0.015g煌绿加热使溶解，校正pH于115℃高压灭菌15min7
SN/T4624.9—2016
麦康凯琼脂
蛋白陈
猪胆盐（或牛，羊胆盐）
氯化钠
0.5%中性红水溶液
0.01%结晶紫水溶液
蒸馏水
A.4.2制法
1000ml
将400mL蒸馅水中分别加人170蛋自陈3.0g陈，5.0g猪胆盐（或牛、羊胆盐），5.0g氯化钠，600mL蒸馏水溶解17.0g琼脂，加热济解，两液台合并，121℃高压火菌15min。临用时加热溶化琼脂，趁热加人10g乳糖，加入0.01%结晶紫水溶液和0.5%中性红水溶液摄匀后倾注平板。A.5
伊红美蓝琼脂
A.5.1成分
蛋白陈
磷酸二氢钾
0.65%伊红美蓝溶液
2%伊红Y溶液
蒸馏水
在1000mL蒸馏水中分别加人10.0g蛋白陈，2.0g磷酸氢二钾，17.0g琼脂，煮沸溶解，调节pH7.1,121℃高压灭菌15min，临用时加10g乳糖并加热溶化琼脂，冷却加人2%伊红Y溶液20mL和0.65%伊红美蓝溶液10mL，播匀后倾注平板A.6
三糖铁琼脂
A.6.1成分
蛋白陈
牛肉膏
葡萄糖
氯化钠
硫酸亚铁铵
硫代硫酸钠
0.2%酚红水溶液
蒸馏水
A.6.2制法
1000ml
SN/T4624.9—2016
在1000mL蒸馏水中分别加入20.0@蛋白陈.5.0g牛肉营.10.0g乳糖，10.0g蔗糖，1.0g葡萄
糖，5.0g氯化钠.0.2g硫酸亚铁铵FeNH2（SO.）6HO1.0.2g硫代硫酸钠，煮沸溶解，调节pH7.4，加入12.0g琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加人0.2%酚红水溶液12.5ml摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到较高的底层。121℃高压灭菌15min。放置高层斜面备用A.7
克氏双糖铁琼脂
A.7.1成分
蛋白陈
牛肉膏
酵母膏
葡萄糖
氯化钠
柠檬酸铁铵
硫代硫酸钠
0.2%酚红水溶液
蒸馏水
A.7.2制法
1000ml
先在1000mL蒸馏水中分别加入20.0g蛋白陈，3.0g牛肉膏，3.0g酵母膏，10.0g乳糖，1.0g葡萄糖，5.0g氯化钠，0.5g柠檬酸铁铵，0.5g硫代硫酸钠，溶解，调节pH7.4，加人12.0g琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加人0.2%酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到比较高的底层。121℃高压灭菌15min。放置高层斜面备用。糖发酵管（乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇）A.8
A.8.1成分
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
0.2%滇麝香草酚蓝溶液
SN/T4624.9—2016
磷酸氢二钠
蒸馏水
A.8.2制法
1000ml
先在1000mL蒸馏水中分别加人5.0g牛肉膏，10.0g蛋白陈，3.0g氯化钠，2.0g磷酸氢二钠[Na2HPO，·12H2O]12.0ml0.2%滇麝香草酚蓝溶液，上述成分配好后，按0.5%加人葡葡糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121℃高压灭菌15min。其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100ml,121℃高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5ml糖溶液加人于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。注：煎糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。
赖氨酸脱羧酶试验培养基
A.9.1成分
蛋白陈
酵母浸膏
葡萄糖
1.6%滇甲酚紫-乙醇溶液
L-氨基酸或DL-氨基酸
蒸馏水
A.9.2制法
0.5g/100ml或1.0g/100ml
1000mL
先在1000mL蒸馏水中分别加人5.0g蛋白陈，3.0g酵母浸膏，1.0g葡萄糖，1.6%滇甲酚紫乙醇溶液1mL，加热溶解后，分装每瓶100ml..分别加人各种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按0.5%加入，DL氨基酸按1%加人：再行校正pH至6.8。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，115℃高压灭菌10min。A.10
尿素琼脂
A.10.1成分
蛋白陈
磷酸二氢钾
葡萄糖
氯化钠
20%尿素溶液
0.4%酚红溶液
蒸谱水
A.10.2制法
1000mL
先在1000mL蒸馏水中分别加人1.0g蛋白陈，5.0g氯化钠，1.0g葡萄糖，2.0g磷酸二氢钾，0.4%酚红溶液，煮沸溶解，调节pH，加入20g琼脂，加热溶化，121℃高压灭菌15min。加入除菌过滤10
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中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
金屋责真伪
2017-03-01实施
SN/T4624《入境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分：第1部分：地衣芽孢杆菌；
第2部分：短小芽孢杆菌；
第3部分：巨大芽孢杆菌；
第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌；第5部分：β型溶血性链球菌：
第6部分：金黄色葡菊球菌；
第7部分：沙门氏菌；
第8部分：志贺氏菌；
第9部分：致泻大肠埃希氏菌：
第10部分：淡紫拟青霉：
第11部分：雅致小克银汉霉；
第12部分：哈茨木霉；
第13部分：黄孢原毛平革菌：
第14部分：焦曲霉；
第15部分：解淀粉芽孢杆菌；
第16部分：类产碱假单胞菌；
第17部分：恶臭假单胞菊。
本部分为SN/T4624的第9部分
本部分按照GB/T1.1—2C09给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局本部分主要起草人：李成铺、王秋艳、于丽、姜玲玲、康凯、王芳。SN/T4624.9-—2016
1范围
入境环保用微生物菌剂检测方法第9部分：致泻大肠埃希氏菌
SN/T4624.9—2016
SN/T4624的本部分规定了入境环保用微生物菌剂卫生学检验致泻大肠埃希氏菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR、实时荧光PCR检测方法本部分适用于人境环保用微生物菌剂中致泻大肠埃希氏菌的检测和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3主要试剂和培养基
实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格生理盐水：见附录A中A.1。
营养肉汤：见A.2。
肠道菌增菌肉汤：见A.3。
麦康凯琼脂：见A.4。
伊红美监琼脂：见A.5。
三糖铁琼脂：见A.6。
克氏双糖铁琼脂：见A.7。
糖发酵管（乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇）：见A.8赖氨酸脱羧酶试验培养基：见A.9尿素琼脂：见A.10。
氰化钾：见A.11。
蛋白陈水、靛基质试剂：见A.12。半固体琼脂：见A.13。
氧化酶试剂：见A.14。
3.16革兰氏染色液：见A.15
3.17致病性大肠埃希氏菌诊断血清、侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清、产肠毒素大肠埃希氏菌诊断血清、出血性大肠埃希氏菌诊断血清。3.18细菌基因组DNA提取试剂盒。3.19
TE缓冲液（pH8.0）：见A.16。
溶菌酶（10mg/mL）：见A.17。
蛋白酶K（20mg/mL）：见A.18。10%SDS：见A.19.
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3mol/L乙酸钠：见A.20。
dNTP:dATPdTTP、dGTP、dCTP
TBE.见A.21。
TaqDNA聚合酶。
琼脂糖。
溴化艺锭。
DNA分子量标记：10obpDNAladder。4主要仪器和设备
电子天平（感量0.01g）。
恒温培养箱：36℃士1℃、42℃1℃。恒温水浴锅。
台式冷冻离心机（最高转速15.000r/min）。PCR扩增仪。
实时荧光PCR仪。
微量移液器和灭菌吸头：10L、20、200μL、1000μL。高压灭菌锅。
PCR超净工作台。
电泳仪。
核酸/蛋白分析仪，
凝胶成像系统
无菌培养Ⅲ：直径90mm。
5样品制备
以无菌操作取1g（mL）样品加到100mL生理盐水中混匀，从中移取25mL加入到225mL灭菌生理盐水中混匀。取样过程中，在样品旁边放置1个营养琼脂平板作为空白对照。形态学及生化、血清学鉴定
6.1增菌
无菌条件下，移取25mL上述样品匀液至盛有225mL肠道菌增菌肉汤的无菌均质袋内·用拍击式均质器拍打1min~2min.将上述样品勾液于42℃培养18h~24h。6.2分离
将增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美监琼脂平板，于36℃土1℃培养18h~24h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落6.3
生化鉴定
6.3.1自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂（TSI)或克氏双糖铁琼脂（KI。同时将这些培养物分别接种蛋白陈水，半固体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36℃培养过夜
TKAONKAca
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2TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性，KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌。6.3.2
TSI底层不产酸，或H2S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。
6.4血清学鉴定
挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性人肠埃希氏菌O157血清做玻片凝集试验。当与某一种多价O而清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。致泻大肠埃希氏菌所包括的○抗原群见表1。如与某一个单价O血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。表1致泻大肠埃希氏菌所包括的0抗原群大肠埃希氏菌的种类
所包括的○抗原群
O26055O86O111ab 011401190125acO127O128ac014201580157
028ac029 0112ac011501240135013601430144015201640167060110150200250270630780850114011501250128ac01480149015901660167
制备O抗原悬液，稀释至与MacFarland3号比浊管相当的浓度。原效价为（I：160）（1：320）的O血清，用0.5%盐水稀释至1：40。稀释血清与抗原悬液在10mm×75mm试管内等量混合，做单管凝集试验。混勾后放于50℃水浴锅内，经16h后观察结果。如出现凝集，可证实为该0抗原。6.5
结果与报告
综合以上生化鉴定和血清学鉴定的结果，报告检出或未检出致泻大肠埃希氏菌。7分子生物学检测（选做项目）
7.1细菌模板DNA的提取
7.1.1直接提取法
取6.1中菌液2mL加到2ml无菌离心管中，10000r/min离心2min，尽量弃奔挣上清，沉淀加人TE100μL，10mg/mL溶菌酶100μl.37℃温育30min，12000r/min离心2min，沉淀加人TE缓冲液600μL重悬，再加人20mg/mL蛋白酶K25μL，55温育1h后沸水浴10min，12000r/min离心5min，取上清保存于一20℃保存以待检测7.1.2有机溶剂提取法
取6.1中菌液2mL加到2ml.无菌离心管中，10000r/min离心2min，弃上清，尽量弃净上清，沉淀加人TE缓冲液570L重悬，然后加人10mg/mL溶菌酶100μL,37℃温育30min，再加人10%SDS30uL，65℃温育10min，加人等体积的酚混勾，12000r/min离心10min，取上清移入一新离心管中，重复一次，两次酚抽提后取上清加等体积的酚/氯仿（1：1，体积比）混匀，12000r/min离心10min取上清再移入一新离心管中，加等体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/L乙酸钠，轻缓颠倒混匀，3
-TTKAONKAca
SN/T4624.9-—2016
12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用500uL75%乙醇洗两次，离心管开盖室温放置数分钟使乙醇浑发，加人100uL无菌水（预先加热至65℃有利于DNA溶解），一20℃保存以待检测。7.1.3试剂盒法
使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。7.2DNA质量检测
将提取的DNA用1.0%含溴化乙锭（或等效染料）的琼脂糖凝胶进行完整性检测。然后用核酸/蛋白分析仪分别在260nm和280nm下测定OD值，用于PCR反应的DNA纯度一般为1.6≤OD2%g/OD280≤2.0
DNA浓度（ng/uL）=ODaX50×核酸稀释倍数7.3PCR鉴定
引物序列
引物序列及扩增片段长度见表2。表2
致泻大肠埃希氏菌
肠侵袭性大肠埃希氏菌
肠致病性大肠埃希氏菌
产肠毒素大肠埃希氏菌
肠出血性大肠埃希氏菌
O157:H7
反应体系
PCR反应体系见表3。
引物来源
试剂名称
PCR扩增引物序列及扩增片段长度引物序列
5'-CTGGATGGTATGGTGAGG-3
GGAGGO
CAACAA TTA TTT CC-3
GGTCTGTATATTGGGCAGACC-3
GCC GCTTTA TCCAAC CTG GTA-3
TCCTTCATC
CTTTCAATGE
GCTTT-3
5-ATTGCGbzxZ.net
CTG AGGCCTE
5'-CGAGTA
CAT TGG CAT CGT G-3°
表3PCR反应体系
PCR反应体系
10XPCR缓冲液（含Mg+）
dNTP(10mmol/L)
TagDNA聚合酶（5U/μL）
正向引物和反向引物（10μmol/L）DNA模板（50ng~200ng）
双蒸水
各1.0μL
补至25.0
注：反应体系中各试剂的量可根据具休情况或不同的反应总体积进行适当调整4
扩增片段大小
-TTKAONIKAca
7.3.3PCR反应条件
SN/T 4624.9—2016
94℃预变性3min；94℃变性605.60℃退火60s，72℃延伸60s，进行35个循环：72℃延伸7min，4℃保存反应产物。
使用不同PCR仪，可对参数作适当调整。7.3.4空白对照、阴性对照和阳性对照设置阴性对照：非致泻大肠埃希氏菌DNA为模板。阳性对照：已知致泻大肠埃希氏菌的DNA或合有待测基因序列的质粒为模板A时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是PCR反应空白对照：设两个，一是提取DNA的空白对照（以水代替DNA模板）。7.3.5PCR扩增产物的电泳检测
用电泳缓冲液（0.5×TBE）制备2%琼脂糖凝胶：取5LPCR扩增产物，和1μL上样缓冲液混合，进行点样，DNAmarker(100bpDNAlaeer>做参照
60min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。7.3.6PCR扩增结果判定和报告
7.3.6.1对照结果
阳性对照：出现已知目的扩增条带阴性对照：未出现特征条带。
空白对照：术出现特征条带。
7.3.6.2结果判定和报告
对照实验结果正常，待测样品未出现已知告未检出致泻大肠埃希氏菌。
V/cm~5V/cm恒压电泳，电泳50min~的扩增条带，则可判定该样品PCR扩增结果为阴性，报对照实验结果正常，待测样品出现已知目的扩增条带，则可初步判定该样品PCR扩增结果为阳性，应依据第6章中生化鉴定和血清学鉴定对该菌进行步确认，最终结果以生化鉴定和血清学鉴定的检测结果为准，报告检出（或未检出）致泻大肠埃希氏菌。对照实验结果异常，本次待测样品的结果无效，应重新做实验，并排除污染因素。7.4实时荧光PCR鉴定
引物和探针序列
引物和探针序列见表4。其中探针的5端标记FAM，3端标记TAMRA。表4引物和探针序列
鉴定菌名称
出血性
大肠埃希氏菌
引物序列
5-TCCTCAGCTATAGGGTGCTTTTG-3
5'-ATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTAC-3探针序列
5'FAM-TATTTTTCCGAGTACATT
GGCATCGTGTGG TAMRA3'
TKAONKAca
SN/T4624.9—2016
7.4.2实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表5。
表5实时荧光PCR反应体系
试剂名称
10×PCR缓冲液（含Mg+）
dNTPs(10 mmol/L)
TagDNA聚合酶5U/L）
正向引物利反向引物（20mol/L）探针（20μmo/1/L）
DNA模板
双蒸水
实时荧光PCR反应体系
补室25叫L
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整7.4.3实时荧光PCR反应参数
实时荧光PCR反应参数：37℃5min，95℃预变性3min：94℃变性5s，60℃退火延伸40s，同时收集FAM荧光信号，进行40个循环，4℃保存反应产物。使用不同实时荧光PCR仪，可对参数作适当调整。7.4.4空白对照，阴性对照和阳性对照设置阴性对照：非出血性大肠埃希氏菌DNA为模板。阳性对照：已知出血性大肠埃希氏菌的DNA或含有待测基因序列的质粒为模板。空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是实时荧光PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。7.4.5实时荧光PCR扩增结果判定和报告7.4.5.1对照结果
阴性对照：无扩增曲线：Ct值≥40.0。阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct值应30.0。空白对照：无扩增曲线：Ct值≥40.0。否则，检测视为无效。
7.4.5.2结果判定和报告
Ct值≥40.0，可判定该样品实时荧光PCR结果为阴性，报告未检出出血性大肠埃希氏菌，Ct值35.0，可初步判定该样品实时荧光PCR结果为阳性，应依据第6章中生化鉴定和血清学鉴定对该菌进行进一步确认，最终结果以生化鉴定和血清学鉴定的检测结果为准，报告检山(或未检出)出血性大肠埃希氏菌。35.0Ct值40.0.建议重做。再次扩增后的外源基因Ct值仍小于40，且曲线有明显的对数增长期，并且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定为阳性：再次扩增后外源基因Ct值大于或等于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，可判定为阴性。6
-iiKAoNiKAca
生理盐水
氯化钠
蒸馏水
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
1000mL
称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压火菌15min。A.2
营养肉汤
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
1000ml
SN/T4624.9—2016
在1000mL蒸馏水中分别加人10.0g蛋白陈，3.0g牛肉膏，5g氯化钠，溶解，调节pH至7.4,121℃高压灭菌15min。
肠道菌增菌肉汤
蛋白陈
葡萄糖
磷酸二氢钾
磷酸氢二钠
牛胆盐
蒸馏水
1000ml
在1000mL蒸馏水中分别加人10.0g蛋白陈，5.0g葡萄糖，20g牛胆盐，8g磷酸氢二钠，2.0g磷酸二氢钾，0.015g煌绿加热使溶解，校正pH于115℃高压灭菌15min7
SN/T4624.9—2016
麦康凯琼脂
蛋白陈
猪胆盐（或牛，羊胆盐）
氯化钠
0.5%中性红水溶液
0.01%结晶紫水溶液
蒸馏水
A.4.2制法
1000ml
将400mL蒸馅水中分别加人170蛋自陈3.0g陈，5.0g猪胆盐（或牛、羊胆盐），5.0g氯化钠，600mL蒸馏水溶解17.0g琼脂，加热济解，两液台合并，121℃高压火菌15min。临用时加热溶化琼脂，趁热加人10g乳糖，加入0.01%结晶紫水溶液和0.5%中性红水溶液摄匀后倾注平板。A.5
伊红美蓝琼脂
A.5.1成分
蛋白陈
磷酸二氢钾
0.65%伊红美蓝溶液
2%伊红Y溶液
蒸馏水
在1000mL蒸馏水中分别加人10.0g蛋白陈，2.0g磷酸氢二钾，17.0g琼脂，煮沸溶解，调节pH7.1,121℃高压灭菌15min，临用时加10g乳糖并加热溶化琼脂，冷却加人2%伊红Y溶液20mL和0.65%伊红美蓝溶液10mL，播匀后倾注平板A.6
三糖铁琼脂
A.6.1成分
蛋白陈
牛肉膏
葡萄糖
氯化钠
硫酸亚铁铵
硫代硫酸钠
0.2%酚红水溶液
蒸馏水
A.6.2制法
1000ml
SN/T4624.9—2016
在1000mL蒸馏水中分别加入20.0@蛋白陈.5.0g牛肉营.10.0g乳糖，10.0g蔗糖，1.0g葡萄
糖，5.0g氯化钠.0.2g硫酸亚铁铵FeNH2（SO.）6HO1.0.2g硫代硫酸钠，煮沸溶解，调节pH7.4，加入12.0g琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加人0.2%酚红水溶液12.5ml摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到较高的底层。121℃高压灭菌15min。放置高层斜面备用A.7
克氏双糖铁琼脂
A.7.1成分
蛋白陈
牛肉膏
酵母膏
葡萄糖
氯化钠
柠檬酸铁铵
硫代硫酸钠
0.2%酚红水溶液
蒸馏水
A.7.2制法
1000ml
先在1000mL蒸馏水中分别加入20.0g蛋白陈，3.0g牛肉膏，3.0g酵母膏，10.0g乳糖，1.0g葡萄糖，5.0g氯化钠，0.5g柠檬酸铁铵，0.5g硫代硫酸钠，溶解，调节pH7.4，加人12.0g琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加人0.2%酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到比较高的底层。121℃高压灭菌15min。放置高层斜面备用。糖发酵管（乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇）A.8
A.8.1成分
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
0.2%滇麝香草酚蓝溶液
SN/T4624.9—2016
磷酸氢二钠
蒸馏水
A.8.2制法
1000ml
先在1000mL蒸馏水中分别加人5.0g牛肉膏，10.0g蛋白陈，3.0g氯化钠，2.0g磷酸氢二钠[Na2HPO，·12H2O]12.0ml0.2%滇麝香草酚蓝溶液，上述成分配好后，按0.5%加人葡葡糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121℃高压灭菌15min。其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100ml,121℃高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5ml糖溶液加人于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。注：煎糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。
赖氨酸脱羧酶试验培养基
A.9.1成分
蛋白陈
酵母浸膏
葡萄糖
1.6%滇甲酚紫-乙醇溶液
L-氨基酸或DL-氨基酸
蒸馏水
A.9.2制法
0.5g/100ml或1.0g/100ml
1000mL
先在1000mL蒸馏水中分别加人5.0g蛋白陈，3.0g酵母浸膏，1.0g葡萄糖，1.6%滇甲酚紫乙醇溶液1mL，加热溶解后，分装每瓶100ml..分别加人各种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按0.5%加入，DL氨基酸按1%加人：再行校正pH至6.8。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，115℃高压灭菌10min。A.10
尿素琼脂
A.10.1成分
蛋白陈
磷酸二氢钾
葡萄糖
氯化钠
20%尿素溶液
0.4%酚红溶液
蒸谱水
A.10.2制法
1000mL
先在1000mL蒸馏水中分别加人1.0g蛋白陈，5.0g氯化钠，1.0g葡萄糖，2.0g磷酸二氢钾，0.4%酚红溶液，煮沸溶解，调节pH，加入20g琼脂，加热溶化，121℃高压灭菌15min。加入除菌过滤10
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