SN/T 4624.8-2016
基本信息
标准号： SN/T 4624.8-2016
中文名称：入境环保用微生物菌剂检测方法第8部分:志贺氏菌
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
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标准简介
SN/T 4624.8-2016.Methods for examination of import microbial blends in the environmental
protection-Part 8 :Shigella.
1范围
SN/T 4624.8规定了人境环保用微生物菌剂卫生学检验志贺氏菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR、实时荧光PCR检测方法。
SN/T 4624.8适用于人境环保用微生物菌剂卫生学检验志贺氏菌的检测和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3主要试剂和培养基
3.1 实验用水:应符合GB/T 6682中一级水的规格。
3.2 生理盐水:见附录A中A.1。
3.3志 贺氏菌增菌肉汤新生霉素:见A.2。
3.4麦 康凯(MAC)琼脂:见A.3。
3.5木糖赖氨酸脱氧胆酸盐(XLD)琼脂:见A.4。
3.6 志贺氏菌显色培养基:见A.5。
3.7 三糖铁(TSI)琼脂:见A.6。
3.8 营养琼脂斜面:见A.7。
3.9 半固体琼脂:见A.8。
3.10葡萄糖铵培养基:见A.9。
3.11 尿素琼脂:见A.10。
3.12 β-半乳糖苷酶培养基:见A.11。
3.13氨基酸脱羧酶试验培养基:见A.12。
3.14糖发酵管:见A.13。
3.15西蒙氏柠檬酸盐培养基:见A.14。
3.16蛋白胨水、靛基质试剂:见A.15。
3.17志贺氏菌属诊断血清。
3.18生化鉴定试剂盒。
protection-Part 8 :Shigella.
1范围
SN/T 4624.8规定了人境环保用微生物菌剂卫生学检验志贺氏菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR、实时荧光PCR检测方法。
SN/T 4624.8适用于人境环保用微生物菌剂卫生学检验志贺氏菌的检测和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3主要试剂和培养基
3.1 实验用水:应符合GB/T 6682中一级水的规格。
3.2 生理盐水:见附录A中A.1。
3.3志 贺氏菌增菌肉汤新生霉素:见A.2。
3.4麦 康凯(MAC)琼脂:见A.3。
3.5木糖赖氨酸脱氧胆酸盐(XLD)琼脂:见A.4。
3.6 志贺氏菌显色培养基:见A.5。
3.7 三糖铁(TSI)琼脂:见A.6。
3.8 营养琼脂斜面:见A.7。
3.9 半固体琼脂:见A.8。
3.10葡萄糖铵培养基:见A.9。
3.11 尿素琼脂:见A.10。
3.12 β-半乳糖苷酶培养基:见A.11。
3.13氨基酸脱羧酶试验培养基:见A.12。
3.14糖发酵管:见A.13。
3.15西蒙氏柠檬酸盐培养基:见A.14。
3.16蛋白胨水、靛基质试剂:见A.15。
3.17志贺氏菌属诊断血清。
3.18生化鉴定试剂盒。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4624.8—2016
入境环保用微生物菌剂检测方法第8部分：志贺氏菌
Methods for examination of import microbial blends in the environmentalprotection-Part8.Shigella
2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分：第1部分：地衣芽孢杆菌；
第2部分：短小芽孢杆菌；
第3部分：巨大芽孢杆菌；
第4部分：嗜酸氧化业铁硫杆菌；第5部分：β型溶血性链球菌：
第6部分：金黄色葡萄球菌；
第7部分：沙门氏菌；
第8部分：志贺氏菌；
第9部分：致泻大肠埃希氏菌；
第10部分：淡紫拟青霉；
第11部分：雅致小克银汉霉；
第12部分：哈茨木霉；
第13部分：黄孢原毛平革菌；
第14部分：焦曲霉；
第15部分：解淀粉芽孢杆菌：
第16部分：类产碱假单胞菌；
第17部分：恶臭假单胞菌。
本部分为SN/T4624的第8部分
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：王金玲、栾慎顺、钟钰、于丽、金学典、王芳。SN/T-4624.8—2016
1范围
入境环保用微生物菌剂检测方法第8部分：志贺氏菌
SN/T4624.8—2016
SN/T4624的本部分规定了人境环保用微生物菌剂卫生学检验志贺氏菌的形态学鉴定、生化鉴定，普通PCR，实时荧光PCR检测方法。本部分适用于人境环保用微生物菌剂卫生学检验志贺氏菌的检测和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3主要试剂和培养基
实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。3.1
生理盐水：见附录A中A.1。
志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见A.2。麦康凯（MAC)琼脂：见A.3。
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐(XLD)琼脂：见A.4。志贺氏菌显色培养基：见A.5。
三糖铁（TSI）琼脂：见A.6。
营养琼脂斜面：见A.7。
半固体琼脂：见A.8。
葡萄糖铵培养基：见A.9。
尿素琼脂：见A.10。
3-半乳糖苷酶培养基：见A.11。氨基酸脱羧酶试验培养基：见A.12。糖发酵管：见A.13。
西蒙氏柠檬酸盐培养基：见A.14。蛋白陈水、靛基质试剂：见A.15。志贺氏菌属诊断血清。
生化鉴定试剂盒。
TE缓冲液(pH8.0)：见A.16。
溶菌酶（10mg/mL）：见A.17。
蛋白酶K(20mg/mL）：见A.18
10%SDS.见A.19。
SN/T 4624.8—2016
3mol/LZ酸钠：见A.20
dNTP:dATPdTTP.dGTP、dCTP
TBE.见A.21。
Taq DNA聚合酶。
细菌基因组DNA提取试剂盒。
琼脂糖。
溴化乙锭。
DNA分子量标记：100bpDNAladder。4主要仪器和设备Www.bzxZ.net
4.1电子天平（感量0.01g）
4.2恒温培养箱：36℃±1℃。
恒温水浴锅。
台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）4.4
PCR扩增仪。
4.6实时荧光PCR仪。
微量移液器和灭菌吸头：10L、20L、200uL、1000L4.8
高压灭菌锅。
PCR超净工作台。
电泳仪。
核酸/蛋白分析仪。
凝胶成像系统。
无菌培养m：直径90mm
5样品制备
以无菌操作取1g（mL）样品加人到100mL生理盐水中混匀，从中移取25mL加入到225mL灭菌生理盐水中混勾。取样过程中，在样品旁边放置16形态学及生化鉴定
6.1增菌
营养琼脂平板作为空白对照。
将上述样品匀液吸取25mL，接种于225mL志贺氏菌增菌肉汤中，经41.5℃士1℃厌氧培养16h20h
6.2分离
取增菌后的志贺氏菌增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36℃土1℃培养20h～24h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h再进行观察。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表1。2
-TTKAONIKAca
选择性琼脂平板
MAC琼脂
XLD琼脂
志贺氏菌显色培养基
3生化、血清学鉴定
初步生化鉴定
表1志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征志贺氏菌的菌落特征
无色至浅粉红色，半透明光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐粉红色至尤色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐按照显色培养基的说明进行判定SN/T4624.8-2016
6.3.1.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落分别接种TSI、半固体和营养琼脂斜面各一管，置36℃土1℃培养20h-24h，分别观察结果。6.3.1.2凡是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸（发醛葡萄糖，不发酵乳糖，燕糖）、不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体）、不产硫化氢、半固体管中无动力的菌株，挑取其6.3.1.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验和血清学分型。6.3.2生化试验及附加生化试验
6.3.2.1生化试验
用6.3.1.1中已培养的营养琼脂斜面国，进
生化试验，即β-半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验。除朱内氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌13型的鸟氨酸阳性，宋内氏菌和痢疾志贺氏菌验志贺氏菌属的培养物均为阴性结果志贺氏菌相似，必要时还需加
做靛基
验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性料凝集，仍不得判定为志贺氏菌属。生化反应
B-半乳糖苷酶
赖氨酸脱羧酶
鸟氨酸脱酶
水杨苷
七叶苔
靛基质
甘露醇
棉子糖
型、鲍氏
志贺氏菌13型β-半乳糖首酶为阳性以外，其余生化试另外
于福氏志贺氏菌6
型的生化特性和痫疾志贺氏菌或鲍氏、甘露醇、棉子
甘油试验
也可做革兰氏染色检查和氧化酶试生
化反应不符合的菌株.即使能与某种志贺氏菌分型血清发生志贺氏菌属生化特性见表
忘贺氏菌属四个
A群：剩疾志
详的生化特征
B群：福氏志贺氏菌
群：鲍氏志贺氏菌
D群：宋内氏志贺氏菌
注：+表示阳性；一表示阴性：一/十表示多数阴性：十/一表示多数阳性；（+）表示迟缓阳性：d表示有不同生化型。痫疾志贺氏菌1型和鲍氏志贺氏菌13型为阳性。5鲍氏志贺氏菌13型为鸟氮酸阳性福氏志贺氏菌4型和福氏志贺氏菌6型常见甘解醇阴性变种3
TTKAONKAca
SN/T4624.8—2016
6.3.2.2附加生化试验
由于某些不活泼的大肠埃希氏菌（anaerogenicE.coli）、A-D（Alkalescens-Disparbiotypes碱性-异型)菌的部分生化特征与志贺氏菌相似，并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集；因此前面生化实验符合志贺氏菌属生化特性的培养物还需另加葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐、黏液酸盐试验（36℃培养24h～48h)。志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D菌的生化特性区别见表3。表3志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D菌的生化特性区别生化反应
葡萄糖铵
西蒙氏柠檬酸盐
黏液酸盐
A群：刺疾
志贺氏菌
B群：福氏
志贺氏菌
C群：鲍氏
志贺氏菌
注1：十表示阳性：一表示阴性：d表示有不同生化型D群：米内氏
志贺氏菌
大肠埃希氏菌
A-D菌
注2：在葡萄糖铵，西蒙氏柠檬酸盐、黏液酸盐试验三项反应中志贺氏菌一般为阴性，而不活泼的大肠埃希氏菌、A-ID(碱性-异型）菌至少有一项反应为阳性：6.3.2.3
如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据6.3.1.2的初步判断结果，用6.3.1.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。6.3.3血清学鉴定
6.3.3.1抗原的准备
志贺氏菌属没有动力，所以没有鞭毛抗原。志贺氏菌属主要有菌体（O）抗原。菌体O抗原又可分为型和群的特异性抗原。
一般采用1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。注1：一些志贺氏菌如果因为K抗原的存在而不出现凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水做成浓菌液，100℃煮沸15min60min去除K抗原后再检查。注2：D群志贺氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株，与其他志贺氏菌群抗原不存在交叉反应。与肠杆菌科不同，宋内氏志贺氏菌粗糙型菌株不一定会自凝。宋内氏志贺氏菌没有K抗原。6.3.3.2凝集反应
在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取一环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑色背景进行观察，如果抗血清中出现凝结成块的颗粒，面且生理盐水中没有发生自凝现象，那么凝集反应为阳性。如果生理盐水中出现凝集，视作为自凝。这时，应挑取同一培养基上的其他菌落继续进行试验。如果待测菌的生化特征符合志贺氏菌属生化特征，而其血清学试验为阴性的话，则参照6.3.3.1注1进行试验。
6.3.3.3血清学分型（选做项目）先用四种志贺氏菌多价血清检查，如果呈现凝集，则再用相应各群多价血清分别试验。先用B群-TKAONKAca
SN/T4624.8—2016
福氏志贺氏菌多价血清进行实验，如呈现凝集，再用其群和型因子血清分别检查。如果B群多价血清不凝集，则用D群宋内氏志贺氏菌血清进行实验，如呈现凝集，则用其I相和Ⅱ相血清检查，如果B、D群多价血清都不凝集，则用A群疾志贺氏菌多价血清及1~12各型因子血清检查，如果上述三种多价血清都不凝集，可用C群鲍氏志贺氏菌多价检查，并进一步用1~18各型因子血清检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原鉴别见表4。表4福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原的鉴别表型和亚型
型抗原
群抗原
(3.4).6.7,8
注：十表示凝集，一表示不凝集，（）表示有或无。6.4
结果报告
在群因子血清中的凝集
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告1g（mL）样品中检出（或未检出）志贺氏菌。分子生物学检测（选做项目）
细菌模板DNA的提取
7.1.1直接提取法
取6.1中菌液2mL加到2mL无菌离心管中，10000r/min离心2min，尽量奔净上清，沉淀加入TE100μL、10mg/mL溶菌酶100μL，37℃温育30min，12000r/min离心2min，沉淀加人TE缓冲液600μL重悬，再加人20mg/mL蛋白酶K25μL，55℃温育1h后沸水浴10min，12000r/min离心5min，取上清保存于一20℃保存以待检测7.1.2有机溶剂提取法
取6.1中菌液2mL加到2ml.无菌离心管中，10000r/min离心2min，弃上清，尽量充净上清，沉5
-TiKAONIKAca
SN/T4624.8—2016
淀加人TE缓冲液570μL重悬，然后加人10mg/mL溶菌酶100μL37℃温育30min.再加人10%SDS30μL，65℃温育10min，加人等体积的酚混匀，12000r/min离心10min，取上清移人一新离心管中，重复一次，两次酚抽提后取上清加等体积的酚/氯仿（1：1体积比）混匀，12000r/min离心10min取上清再移入一新离心管中，加等体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/L.乙酸钠，轻缓颠倒混勺，12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用500μL75%乙醇洗两次，离心管开盖室温放置数分钟使乙醇挥发，加人100uL无菌水（预先加热至65℃有利于DNA溶解），一20℃保存以待检测。7.1.3
试剂盒法
使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。7.2DNA质量检测
将提取的DNA用1.0%含溴化乙锭（或等效染料）的琼脂糖凝胶进行完整性检测。然后用核酸/蛋白分析仪分别在260nm和280nm下测定OD值，用于PCR反应的DNA纯度一般为1.6≤OD%/OD22.0
DNA浓度（ng/μL）=OD2
X50×核酸稀释倍数
3PCR方法
引物序列
引物序列及扩增片段长度见表5
表5引物序列及扩增片段长
PCR扩增
常规PCR
反应体系
引物来源
PCR反应体系见表6。
试剂名称
10×PCR缓冲液（含Mg）
dNTP(10mmol/L)
TaqDVA聚合酶（5U/μL）
正向引物和反向引物（10umol/）DNA模板（50ng~200ng）
双蒸水
升物序列
ACCGCCTTTCCGATACCGT
CGGTCAGCCAGCCTCTGAGAGTAC
表6PCR反应体系
PCR反应体系
各1.0μL
补至25.0μL
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整7.3.3PCR反应条件
扩增片段大小
95℃预变性5min；95℃变性15s，65℃退火30s.72℃延伸305，进行35个循环：72℃延伸6
-TKAONIKAca
5min，4C保存反应产物：
使用不同PCR仪，可对参数作适当调整。7.3.4空白对照、阴性对照和阳性对照设置阴性对照：非志贺氏菌DNA为模板。阳性对照：已知志贺氏菌的DNA或含有待测基因序列的质粒为模板。SN/T4624.8—2016
空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。7.3.5PCR扩增产物的电泳检测
用电泳缓冲液（0.5×TBE）制备2%琼脂糖凝胶，取5LPCR扩增产物与1uL上样缓冲液混合，进行点样，DNAmarker（100bpDNAladder）做参照。3V/cm~5V/cm恒压电泳，电泳50min~60min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。7.3.6PCR扩增结果判定和报告
7.3.6.1对照结果
阳性对照：出现629bp的扩增条带。阴性对照：未出现特征条带。
空白对照：未出现特征条带。
7.3.6.2结果判定和报告
1629bp扩增条带.则可判定该样品PCR扩增结果为阴性，报对照实验结果正常，待测样品未出现告1g(mL)样品中未检出志贺氏菌。对照实验结果正常，待测样品出现629bp扩增条带，则可初步判定该样品PCR扩增结果为阳性，应依据6生化和血清学鉴定对该菌进行进步确认，最终结果以形态学和生理生化鉴定的检测结果为准，报告1g（mI）样品中检出（或未检出）志贺氏菌对照实验结果异常，本次待测样品的结果无效，应重新做实验，并排除污染因素。7.4实时荧光PCR方法
7.4.1引物和探针序列
引物和探针序列见表7。其中探针的5端标记FAM.3'端标记TAMRA。表7引物和探针序列
鉴定菌名称
志贺氏菌
引物序列
5'-CGCAATACCTCCGGATTCC-3\
5'-TCCGCAGAGGCACTGAGTT-3
7.4.2实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表8。
探针序列
5'FAM-AACAGGTCGCTGCATGG
CTGGAA-TAMRA3'
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试剂名称
10×PCR缓冲液（含Mg+）
dVTP(10 μmol/L)
TaQDNA聚合酶（5U/μL)
正向引物和反向引物（10μmol/L）探针
DNA模板
双蒸水
3实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系
各1.0μL
补至20μL
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整7.4.3实时荧光PCR反应参数
实时荧光PCR反应参数：37℃5min，95℃预变性3min；94C变性5s，60℃退火延伸40s，同时收集FAM荧光信号，进行40个循环，4℃保存反应产物。使用不同实时荧光PCR仪，可对参数作适当调整。7.4.4空白对照、阴性对照和阳性对照设置阴性对照：非志贺氏菌DNA为模板；阳性对照：已知志贺氏菌的DNA或含有待测基因序列的质粒为模板；空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是实时荧光PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。7.4.5实时荧光PCR扩增结果判定和报告7.4.5.1对照结果
阴性对照：无扩增曲线；Ct值≥40.0；阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct值应30.0：空白对照：无扩增曲线：Ct值≥40.0；否则，检测视为无效。
7.4.5.2结果判定和报告
Ct值≥40.0，可判定该样品实时荧光PCR结果为阴性，报告1g（mL）样品中未检出志贺氏菌Ct值≤35.0，可初步判定该样品实时荧光PCR结果为阳性：应依据6生化和血清学鉴定对该菌进行进一步确认，最终结果以形态学和生化鉴定的检测结果为准，报告1g（mL）样品中检出（或未检出）志贺氏菌。
35.0Ct<40.0.建议重做。再次扩增后的外源基因Ct值仍小于40.0，且曲线有明显的对数增长期，并且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定为阳性；再次扩增后外源基因Ct值大于40.0，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，可判定为阴性。8
生理盐水
A.1.1成分
氯化钠
蒸馏水
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
1000mL
称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。A.2
志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素
A.2.1志贺氏菌增菌肉汤
A.2.1.1成分
胰蛋白陈
葡萄糖
磷酸氢二钾
磷酸二氢钾
氯化钠
吐温80（Tween80)
蒸馏水
A.2.1.2制法
1000mL
SN/T4624.8—2016
将以上成分混合加热溶解，冷却至25℃左右校正pH至7.0土0.2，分装适当的容器，121℃灭菌15min。取出后冷却至50℃～55℃，加入除菌过滤的新生霉素溶液（0.5μg/ml），分装225mL备用。注：如不立即使用，在2℃～8℃条件下可储存一个月。A.2.2新生霉素溶液
A.2.2.1成分
新生霉素
蒸馏水
A.2.2.2制法
1000mL
将新生霉素溶解于蒸馏水中，用0.22μm过滤膜除菌，如不立即使用，在2℃～8℃条件下可储存一个月。
A.2.3临用时每225mL志贺氏菌增菌肉汤（A.2.1)加人5mL新生霉素溶液（A2.2)，混匀。A.3
麦康凯（MAC）琼脂
蛋白陈
SN/T4624.8—2016
3号胆盐
氟化钠
中性红
结晶紫
蒸馏水
A.3.2制法
将以上成分混合加热溶解，冷却至25冷却至45℃～50℃，倾注平板。注：如不立即使用，在2℃~~8℃条件下可储存2周A.4木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂A.4.1
酵母宫
L-赖氨酸
脱氧胆酸钠
氯化钠
硫代硫酸钠
柠檬酸铁铵
蒸馏水
2制法
1000mL
分装，121℃高压灭菌15min。
除酚红和琼脂外，将其他成分加人400mL蒸馏水中，煮沸溶解，校正pH至7.4土0.2。另将琼脂加入600mL蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至50℃～55℃倾注平血。
注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备，第二天使用。使用前必须去除平板表面上的水珠，在37℃55℃温度下，琼脂面向下，平板盖亦向下烘下。另外如配制好的培养基不立即使用，在2℃8℃条件下可储存2周。5志贺氏菌显色培养基
A.5.1制法
参见志贺氏菌显色培养基使用说明书。10
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入境环保用微生物菌剂检测方法第8部分：志贺氏菌
Methods for examination of import microbial blends in the environmentalprotection-Part8.Shigella
2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分：第1部分：地衣芽孢杆菌；
第2部分：短小芽孢杆菌；
第3部分：巨大芽孢杆菌；
第4部分：嗜酸氧化业铁硫杆菌；第5部分：β型溶血性链球菌：
第6部分：金黄色葡萄球菌；
第7部分：沙门氏菌；
第8部分：志贺氏菌；
第9部分：致泻大肠埃希氏菌；
第10部分：淡紫拟青霉；
第11部分：雅致小克银汉霉；
第12部分：哈茨木霉；
第13部分：黄孢原毛平革菌；
第14部分：焦曲霉；
第15部分：解淀粉芽孢杆菌：
第16部分：类产碱假单胞菌；
第17部分：恶臭假单胞菌。
本部分为SN/T4624的第8部分
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：王金玲、栾慎顺、钟钰、于丽、金学典、王芳。SN/T-4624.8—2016
1范围
入境环保用微生物菌剂检测方法第8部分：志贺氏菌
SN/T4624.8—2016
SN/T4624的本部分规定了人境环保用微生物菌剂卫生学检验志贺氏菌的形态学鉴定、生化鉴定，普通PCR，实时荧光PCR检测方法。本部分适用于人境环保用微生物菌剂卫生学检验志贺氏菌的检测和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3主要试剂和培养基
实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。3.1
生理盐水：见附录A中A.1。
志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见A.2。麦康凯（MAC)琼脂：见A.3。
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐(XLD)琼脂：见A.4。志贺氏菌显色培养基：见A.5。
三糖铁（TSI）琼脂：见A.6。
营养琼脂斜面：见A.7。
半固体琼脂：见A.8。
葡萄糖铵培养基：见A.9。
尿素琼脂：见A.10。
3-半乳糖苷酶培养基：见A.11。氨基酸脱羧酶试验培养基：见A.12。糖发酵管：见A.13。
西蒙氏柠檬酸盐培养基：见A.14。蛋白陈水、靛基质试剂：见A.15。志贺氏菌属诊断血清。
生化鉴定试剂盒。
TE缓冲液(pH8.0)：见A.16。
溶菌酶（10mg/mL）：见A.17。
蛋白酶K(20mg/mL）：见A.18
10%SDS.见A.19。
SN/T 4624.8—2016
3mol/LZ酸钠：见A.20
dNTP:dATPdTTP.dGTP、dCTP
TBE.见A.21。
Taq DNA聚合酶。
细菌基因组DNA提取试剂盒。
琼脂糖。
溴化乙锭。
DNA分子量标记：100bpDNAladder。4主要仪器和设备Www.bzxZ.net
4.1电子天平（感量0.01g）
4.2恒温培养箱：36℃±1℃。
恒温水浴锅。
台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）4.4
PCR扩增仪。
4.6实时荧光PCR仪。
微量移液器和灭菌吸头：10L、20L、200uL、1000L4.8
高压灭菌锅。
PCR超净工作台。
电泳仪。
核酸/蛋白分析仪。
凝胶成像系统。
无菌培养m：直径90mm
5样品制备
以无菌操作取1g（mL）样品加人到100mL生理盐水中混匀，从中移取25mL加入到225mL灭菌生理盐水中混勾。取样过程中，在样品旁边放置16形态学及生化鉴定
6.1增菌
营养琼脂平板作为空白对照。
将上述样品匀液吸取25mL，接种于225mL志贺氏菌增菌肉汤中，经41.5℃士1℃厌氧培养16h20h
6.2分离
取增菌后的志贺氏菌增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36℃土1℃培养20h～24h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h再进行观察。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表1。2
-TTKAONIKAca
选择性琼脂平板
MAC琼脂
XLD琼脂
志贺氏菌显色培养基
3生化、血清学鉴定
初步生化鉴定
表1志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征志贺氏菌的菌落特征
无色至浅粉红色，半透明光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐粉红色至尤色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐按照显色培养基的说明进行判定SN/T4624.8-2016
6.3.1.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落分别接种TSI、半固体和营养琼脂斜面各一管，置36℃土1℃培养20h-24h，分别观察结果。6.3.1.2凡是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸（发醛葡萄糖，不发酵乳糖，燕糖）、不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体）、不产硫化氢、半固体管中无动力的菌株，挑取其6.3.1.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验和血清学分型。6.3.2生化试验及附加生化试验
6.3.2.1生化试验
用6.3.1.1中已培养的营养琼脂斜面国，进
生化试验，即β-半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验。除朱内氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌13型的鸟氨酸阳性，宋内氏菌和痢疾志贺氏菌验志贺氏菌属的培养物均为阴性结果志贺氏菌相似，必要时还需加
做靛基
验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性料凝集，仍不得判定为志贺氏菌属。生化反应
B-半乳糖苷酶
赖氨酸脱羧酶
鸟氨酸脱酶
水杨苷
七叶苔
靛基质
甘露醇
棉子糖
型、鲍氏
志贺氏菌13型β-半乳糖首酶为阳性以外，其余生化试另外
于福氏志贺氏菌6
型的生化特性和痫疾志贺氏菌或鲍氏、甘露醇、棉子
甘油试验
也可做革兰氏染色检查和氧化酶试生
化反应不符合的菌株.即使能与某种志贺氏菌分型血清发生志贺氏菌属生化特性见表
忘贺氏菌属四个
A群：剩疾志
详的生化特征
B群：福氏志贺氏菌
群：鲍氏志贺氏菌
D群：宋内氏志贺氏菌
注：+表示阳性；一表示阴性：一/十表示多数阴性：十/一表示多数阳性；（+）表示迟缓阳性：d表示有不同生化型。痫疾志贺氏菌1型和鲍氏志贺氏菌13型为阳性。5鲍氏志贺氏菌13型为鸟氮酸阳性福氏志贺氏菌4型和福氏志贺氏菌6型常见甘解醇阴性变种3
TTKAONKAca
SN/T4624.8—2016
6.3.2.2附加生化试验
由于某些不活泼的大肠埃希氏菌（anaerogenicE.coli）、A-D（Alkalescens-Disparbiotypes碱性-异型)菌的部分生化特征与志贺氏菌相似，并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集；因此前面生化实验符合志贺氏菌属生化特性的培养物还需另加葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐、黏液酸盐试验（36℃培养24h～48h)。志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D菌的生化特性区别见表3。表3志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D菌的生化特性区别生化反应
葡萄糖铵
西蒙氏柠檬酸盐
黏液酸盐
A群：刺疾
志贺氏菌
B群：福氏
志贺氏菌
C群：鲍氏
志贺氏菌
注1：十表示阳性：一表示阴性：d表示有不同生化型D群：米内氏
志贺氏菌
大肠埃希氏菌
A-D菌
注2：在葡萄糖铵，西蒙氏柠檬酸盐、黏液酸盐试验三项反应中志贺氏菌一般为阴性，而不活泼的大肠埃希氏菌、A-ID(碱性-异型）菌至少有一项反应为阳性：6.3.2.3
如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据6.3.1.2的初步判断结果，用6.3.1.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。6.3.3血清学鉴定
6.3.3.1抗原的准备
志贺氏菌属没有动力，所以没有鞭毛抗原。志贺氏菌属主要有菌体（O）抗原。菌体O抗原又可分为型和群的特异性抗原。
一般采用1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。注1：一些志贺氏菌如果因为K抗原的存在而不出现凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水做成浓菌液，100℃煮沸15min60min去除K抗原后再检查。注2：D群志贺氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株，与其他志贺氏菌群抗原不存在交叉反应。与肠杆菌科不同，宋内氏志贺氏菌粗糙型菌株不一定会自凝。宋内氏志贺氏菌没有K抗原。6.3.3.2凝集反应
在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取一环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑色背景进行观察，如果抗血清中出现凝结成块的颗粒，面且生理盐水中没有发生自凝现象，那么凝集反应为阳性。如果生理盐水中出现凝集，视作为自凝。这时，应挑取同一培养基上的其他菌落继续进行试验。如果待测菌的生化特征符合志贺氏菌属生化特征，而其血清学试验为阴性的话，则参照6.3.3.1注1进行试验。
6.3.3.3血清学分型（选做项目）先用四种志贺氏菌多价血清检查，如果呈现凝集，则再用相应各群多价血清分别试验。先用B群-TKAONKAca
SN/T4624.8—2016
福氏志贺氏菌多价血清进行实验，如呈现凝集，再用其群和型因子血清分别检查。如果B群多价血清不凝集，则用D群宋内氏志贺氏菌血清进行实验，如呈现凝集，则用其I相和Ⅱ相血清检查，如果B、D群多价血清都不凝集，则用A群疾志贺氏菌多价血清及1~12各型因子血清检查，如果上述三种多价血清都不凝集，可用C群鲍氏志贺氏菌多价检查，并进一步用1~18各型因子血清检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原鉴别见表4。表4福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原的鉴别表型和亚型
型抗原
群抗原
(3.4).6.7,8
注：十表示凝集，一表示不凝集，（）表示有或无。6.4
结果报告
在群因子血清中的凝集
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告1g（mL）样品中检出（或未检出）志贺氏菌。分子生物学检测（选做项目）
细菌模板DNA的提取
7.1.1直接提取法
取6.1中菌液2mL加到2mL无菌离心管中，10000r/min离心2min，尽量奔净上清，沉淀加入TE100μL、10mg/mL溶菌酶100μL，37℃温育30min，12000r/min离心2min，沉淀加人TE缓冲液600μL重悬，再加人20mg/mL蛋白酶K25μL，55℃温育1h后沸水浴10min，12000r/min离心5min，取上清保存于一20℃保存以待检测7.1.2有机溶剂提取法
取6.1中菌液2mL加到2ml.无菌离心管中，10000r/min离心2min，弃上清，尽量充净上清，沉5
-TiKAONIKAca
SN/T4624.8—2016
淀加人TE缓冲液570μL重悬，然后加人10mg/mL溶菌酶100μL37℃温育30min.再加人10%SDS30μL，65℃温育10min，加人等体积的酚混匀，12000r/min离心10min，取上清移人一新离心管中，重复一次，两次酚抽提后取上清加等体积的酚/氯仿（1：1体积比）混匀，12000r/min离心10min取上清再移入一新离心管中，加等体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/L.乙酸钠，轻缓颠倒混勺，12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用500μL75%乙醇洗两次，离心管开盖室温放置数分钟使乙醇挥发，加人100uL无菌水（预先加热至65℃有利于DNA溶解），一20℃保存以待检测。7.1.3
试剂盒法
使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。7.2DNA质量检测
将提取的DNA用1.0%含溴化乙锭（或等效染料）的琼脂糖凝胶进行完整性检测。然后用核酸/蛋白分析仪分别在260nm和280nm下测定OD值，用于PCR反应的DNA纯度一般为1.6≤OD%/OD22.0
DNA浓度（ng/μL）=OD2
X50×核酸稀释倍数
3PCR方法
引物序列
引物序列及扩增片段长度见表5
表5引物序列及扩增片段长
PCR扩增
常规PCR
反应体系
引物来源
PCR反应体系见表6。
试剂名称
10×PCR缓冲液（含Mg）
dNTP(10mmol/L)
TaqDVA聚合酶（5U/μL）
正向引物和反向引物（10umol/）DNA模板（50ng~200ng）
双蒸水
升物序列
ACCGCCTTTCCGATACCGT
CGGTCAGCCAGCCTCTGAGAGTAC
表6PCR反应体系
PCR反应体系
各1.0μL
补至25.0μL
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整7.3.3PCR反应条件
扩增片段大小
95℃预变性5min；95℃变性15s，65℃退火30s.72℃延伸305，进行35个循环：72℃延伸6
-TKAONIKAca
5min，4C保存反应产物：
使用不同PCR仪，可对参数作适当调整。7.3.4空白对照、阴性对照和阳性对照设置阴性对照：非志贺氏菌DNA为模板。阳性对照：已知志贺氏菌的DNA或含有待测基因序列的质粒为模板。SN/T4624.8—2016
空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。7.3.5PCR扩增产物的电泳检测
用电泳缓冲液（0.5×TBE）制备2%琼脂糖凝胶，取5LPCR扩增产物与1uL上样缓冲液混合，进行点样，DNAmarker（100bpDNAladder）做参照。3V/cm~5V/cm恒压电泳，电泳50min~60min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。7.3.6PCR扩增结果判定和报告
7.3.6.1对照结果
阳性对照：出现629bp的扩增条带。阴性对照：未出现特征条带。
空白对照：未出现特征条带。
7.3.6.2结果判定和报告
1629bp扩增条带.则可判定该样品PCR扩增结果为阴性，报对照实验结果正常，待测样品未出现告1g(mL)样品中未检出志贺氏菌。对照实验结果正常，待测样品出现629bp扩增条带，则可初步判定该样品PCR扩增结果为阳性，应依据6生化和血清学鉴定对该菌进行进步确认，最终结果以形态学和生理生化鉴定的检测结果为准，报告1g（mI）样品中检出（或未检出）志贺氏菌对照实验结果异常，本次待测样品的结果无效，应重新做实验，并排除污染因素。7.4实时荧光PCR方法
7.4.1引物和探针序列
引物和探针序列见表7。其中探针的5端标记FAM.3'端标记TAMRA。表7引物和探针序列
鉴定菌名称
志贺氏菌
引物序列
5'-CGCAATACCTCCGGATTCC-3\
5'-TCCGCAGAGGCACTGAGTT-3
7.4.2实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表8。
探针序列
5'FAM-AACAGGTCGCTGCATGG
CTGGAA-TAMRA3'
SN/T4624.8—2016
试剂名称
10×PCR缓冲液（含Mg+）
dVTP(10 μmol/L)
TaQDNA聚合酶（5U/μL)
正向引物和反向引物（10μmol/L）探针
DNA模板
双蒸水
3实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系
各1.0μL
补至20μL
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整7.4.3实时荧光PCR反应参数
实时荧光PCR反应参数：37℃5min，95℃预变性3min；94C变性5s，60℃退火延伸40s，同时收集FAM荧光信号，进行40个循环，4℃保存反应产物。使用不同实时荧光PCR仪，可对参数作适当调整。7.4.4空白对照、阴性对照和阳性对照设置阴性对照：非志贺氏菌DNA为模板；阳性对照：已知志贺氏菌的DNA或含有待测基因序列的质粒为模板；空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是实时荧光PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。7.4.5实时荧光PCR扩增结果判定和报告7.4.5.1对照结果
阴性对照：无扩增曲线；Ct值≥40.0；阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct值应30.0：空白对照：无扩增曲线：Ct值≥40.0；否则，检测视为无效。
7.4.5.2结果判定和报告
Ct值≥40.0，可判定该样品实时荧光PCR结果为阴性，报告1g（mL）样品中未检出志贺氏菌Ct值≤35.0，可初步判定该样品实时荧光PCR结果为阳性：应依据6生化和血清学鉴定对该菌进行进一步确认，最终结果以形态学和生化鉴定的检测结果为准，报告1g（mL）样品中检出（或未检出）志贺氏菌。
35.0Ct<40.0.建议重做。再次扩增后的外源基因Ct值仍小于40.0，且曲线有明显的对数增长期，并且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定为阳性；再次扩增后外源基因Ct值大于40.0，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，可判定为阴性。8
生理盐水
A.1.1成分
氯化钠
蒸馏水
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
1000mL
称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。A.2
志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素
A.2.1志贺氏菌增菌肉汤
A.2.1.1成分
胰蛋白陈
葡萄糖
磷酸氢二钾
磷酸二氢钾
氯化钠
吐温80（Tween80)
蒸馏水
A.2.1.2制法
1000mL
SN/T4624.8—2016
将以上成分混合加热溶解，冷却至25℃左右校正pH至7.0土0.2，分装适当的容器，121℃灭菌15min。取出后冷却至50℃～55℃，加入除菌过滤的新生霉素溶液（0.5μg/ml），分装225mL备用。注：如不立即使用，在2℃～8℃条件下可储存一个月。A.2.2新生霉素溶液
A.2.2.1成分
新生霉素
蒸馏水
A.2.2.2制法
1000mL
将新生霉素溶解于蒸馏水中，用0.22μm过滤膜除菌，如不立即使用，在2℃～8℃条件下可储存一个月。
A.2.3临用时每225mL志贺氏菌增菌肉汤（A.2.1)加人5mL新生霉素溶液（A2.2)，混匀。A.3
麦康凯（MAC）琼脂
蛋白陈
SN/T4624.8—2016
3号胆盐
氟化钠
中性红
结晶紫
蒸馏水
A.3.2制法
将以上成分混合加热溶解，冷却至25冷却至45℃～50℃，倾注平板。注：如不立即使用，在2℃~~8℃条件下可储存2周A.4木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂A.4.1
酵母宫
L-赖氨酸
脱氧胆酸钠
氯化钠
硫代硫酸钠
柠檬酸铁铵
蒸馏水
2制法
1000mL
分装，121℃高压灭菌15min。
除酚红和琼脂外，将其他成分加人400mL蒸馏水中，煮沸溶解，校正pH至7.4土0.2。另将琼脂加入600mL蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至50℃～55℃倾注平血。
注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备，第二天使用。使用前必须去除平板表面上的水珠，在37℃55℃温度下，琼脂面向下，平板盖亦向下烘下。另外如配制好的培养基不立即使用，在2℃8℃条件下可储存2周。5志贺氏菌显色培养基
A.5.1制法
参见志贺氏菌显色培养基使用说明书。10
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。