SN/T 4624.7-2016.Methods for examination of import microbial blends in the environmental
protection-Part 7 :Salmonella.
1范围
SN/T 4624.7规定了人境环保用微生物菌剂卫生学检验沙门氏菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR、实时荧光PCR检测方法。
SN/T 4624.7适用于人境环保用微生物菌剂卫生学检验沙门氏菌的检测和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注8期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
3主要试剂和培养基
3.1 实验用水:应符合GB/T 6682中一级水的规格。
3.2 生理盐水:见附录A中A.1
3.3四 硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液:见A.2。
3.4亚 硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液:见A.3
3.5亚 硫酸铋(BS)琼脂:见A.4。
3.6木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂:见A.5。
3.7沙门氏菌属显色培养基。
3.8三糖铁(TSI)琼脂:见A.6。
3.9蛋白胨水、靛基质试剂:见A.7。
3.10 尿素琼脂(pH 7.2):见A.8。
3.11 氰化钾(KCN)培养基:见A.9。
3.12赖 氨酸脱羧酶试验培养基:见A.10。
3.13 邻硝基酚βD半乳糖苷(ONPG)培养基:见A.11。
3.14半固体琼脂:见A.12。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4624.72016
入境环保用微生物菌剂检测方法第7部分：沙门氏菌
Methods for examination of import microbial blends in the environmentalprotectionPart7:Salmonella
2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
入境环保用微生物菌剂检测方法第7部分：沙门氏菌
SN/T4624.7—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010)68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×1230
2017年12月第一版
字数36千字
2017年12月第一次印刷
印数1-500
书号：155066·2-32402
定价21.00元
SN/T4624≤人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分：第1部分：地衣芽孢杆菌；
第2部分：短小芽孢杆菌；
第3部分：巨大芽孢杆菌；
第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌；第5部分：β型溶血性链球菌
第6部分：金黄色葡萄球菌；
第7部分：沙门氏菌；
第8部分：志贺氏菌；
第9部分：致泻大肠埃希氏菌；
第10部分：淡紫拟青霉；
第11部分：雅致小克银汉；
第12部分：哈茨木霉；
第13部分：黄孢原毛平革菌；
第14部分：焦曲霉；
第15部分：解淀粉芽孢杆菌：
第16部分：类产碱假单胞菌：
第17部分：恶臭假单胞菌。
本部分为SN/T4624的第7部分。
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局，本部分主要起草人：王金玲、栾慎顺、刘瑜、钟钰、刘莹、李靓、王芳。SN/T4624.7-—2016
1范围
入境环保用微生物菌剂检测方法第7部分：沙门氏菌
SN/T4624.7—2016
SN/T4624的本部分规定了人境环保用微生物菌剂卫生学检验沙门氏菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR，实时荧光PCR检测方法本部分适用于入境环保用微生物菌剂卫生学检验沙门氏菌的检测和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的乱是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3主要试剂和培养基
实验用水：应符合GB/T6682中
生理盐水：见附录A中
四硫磺酸钠煌绿（TTB）
增菌液
级水的规格
亚硒酸盐胱氨酸（SC)
增菌液：
亚硫酸铋(BS)琼脂：见
(XLD）琼脂：
木糖赖氨酸脱氧胆盐
沙门氏菌属显色培养
三糖铁（TSI)琼脂：见
蛋白陈水、靛基质试剂：见
尿素琼脂（pH7.2）：见A.8。
氰化钾（KCN）培养基：见A.9
赖氨酸脱羧酶试验培养基：见A.10。A
邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培养基：见A.11。半固体琼脂：见A.12。
丙二酸钠培养基：见A.13。下载标准就来标准下载网
沙门氏菌O和H诊断血清。
生化鉴定试剂盒。
TE缓冲液（pH8.0)：见A.14。
溶菌酶（10mg/mL）：见A.15。
蛋白酶K（20mg/mL）：见A.16。10%SDS.见A.17。
3mol/L乙酸钠：见A.18。
-TTKAONKAca
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dNTP:dATP、dTTP,dGTP,dCTP。
TBE：见A.19。
TagDNA聚合酶。
细菌基因组DNA提取试剂盒。
琼脂糖。
溴化乙锭。
DNA分子量标记：100bpDNAladder。主要仪器和设备
电子天平（感量0.01g）。
恒温培养箱：36℃土142℃士1℃。恒温水浴锅。
台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。PCR扩增仪。
实时荧光PCR仪。
微量移液器和灭菌吸头：10μL、20μL、200μL、1000μL。高压灭菌锅。
PCR超净工作台。
电泳仪。
核酸/蛋白分析仪。
凝胶成像系统。
无菌培养血：直径90mm。
样品制备
以无菌操作取1g（mL)样品加人到100mL生理盐水中混勾，从中移取25mL加人到225mL灭菌生理盐水中混勾。取样过程中，在样品旁边放置1个营养琼脂平板作为空白对照。形态学及生化、血清学鉴定
6.1增菌
将上述样品勾液吸取1mL，接种于10mLTTB内，于42℃士1℃培养18h～24h。同时，另取1mL，接种于10mLSC内，于36℃1℃培养18h24h。6.2
2分离
无菌条件下，用接种环分别取8.1增菌液1环，划线接种于个BS琼脂平板，于36℃+1℃培养40h~48h，和一个XLD琼脂平板（或沙门氏菌显色培养基）于36℃十1℃分别18h~24h观察各个平板上生长的菌落。各个平板上的菌落特征见表1。-fiKAONiKAca
选择性琼脂平板
BS琼脂
XLD琼脂
沙门氏菌属显色培养基
6.3生化鉴定
表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征沙门氏菌
SN/T4624.7—2016
菌落为黑色金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色：有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变
菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落：有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心按照显色培养基的说明进行判定自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂、赖氨酸脱羧酶6.3.1
试验培养基和营养琼脂平板，于36℃士1℃培养18h24h，必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见下表2。表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂
硫化氢
赖氨酸脱羧酶试验
培养基
注：K：产碱；A：产酸；十：阳性；一：阴性；十（一），多数阳性，少数阴性；+/一：阳性或阴性。初步判断
可疑沙门氏菌属
可疑沙门氏菌属
可疑沙门氏菌属
非沙门氏菌
非沙门氏菌
6.3.2接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白陈水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN)培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种，于36℃十1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于2℃~5℃或室温保留24h，以备必要时复查。沙门氏菌属生化反应初步鉴别表表3
反应序号
硫化氢
靛基质
注：十：阳性：一：阴性；十/一，阳性或阴性。pH7.2
氰化钾
赖氨酸脱羧酶
6.3.3反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾、赖氨酸脱羧酶三项中有一项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有两项异常，为非沙门氏菌3
-TTKAONIKAca
SN/T4624.7—2016
pH7.2尿素
氟化钾（KCN）
注：十表示阳性：一表示阴性。表4沙门氏菌属生化反应初步鉴别表颗赖氨酸脱羧酶
判定结果
甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）+
沙门氏菌IV或V（要求符合本群特殊化特性）沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）6.3.4反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基转阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果时判定。6.3.5反应序号A3：补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌。同时赖氢酸脱毅酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
6.3.6必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴表5沙门氏菌属各生化群的鉴别
卫矛醇
山梨醇
丙二酸盐
氰化钾
注：十表示阳性；一表示阴性。1
6.3.7如选择生化鉴定试剂盒或全自：动微生
物生化鉴定系统，可根据
6.3.1的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适化鉴定系统进行鉴定。
6.4血清学鉴定
6.4.1抗原的准备
#的菌悬液，使用
生化鉴定试剂盒或全自动微生物生一般采用1.5%琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原。0型血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2.5%～3%）培养基上再检查：如果是由于Vi抗原的存在而阻止了0凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，丁酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.7%~0.8%半固体琼脂平板的中央，侯菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3%~~0.4%半固体琼脂的小玻管1次～2次，自远端取菌培养后再检查
6.4.20抗原的鉴定
用A～F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝集者为粗糙形菌株，不能分型
被A~F多价0血清凝集者，依次用04：03、010；07；08：09；02和011因子血清做凝集试验。4
KAONTKAca
SN/T4624.7-—2016
根据试验结果，判定0群。被03、010血清凝集的菌株，再用010、015、034、019单因子血清做凝集试验，根据试验结果，判定0群。被03.010血清凝集的菌株，再用010、015、034、019单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有单因子血清的要用两个○复合因子血清进行核对，不被AF多价O血清凝集者，先用57种或163种沙门氏菌因子血清中的9种多价O血清检验查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定○群。每种多价○血清所包括的○因子如下：
O多价1A，B.CD,E，F群（并包括6,14群）0多价213,16，1718,21群
28.30,35,38,39群
0多价3
0多价4
0多价5
40,41,42,43群
44，45,47，48群
0多价6
50515253群
0多价7
0多价8
0多价9
55565758群
59,60.61,62群
6365,66,67群
6.4.3H抗原的鉴定
不常见的菌型，先用8种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血
清所包括的各种H因子血清逐一检查，以确定第1相和第2相的H抗原。8种多价血清所包括的H因子如下：
H多价1a,b,c,d
H多价2ch，cnx,enz15,fg.gms，gpu.gp.gqmt，gz51H多价3k,r，y,z,z10,lv,lw,lz13,1z28.lz40H多价41,2;1,5;1.6,1,7;z6
H多价5z4z23,z4z24,z4z32,z29，235,z36,z38z39,z4l,z42,z44
H多价6
z52,z53,z54,z55
H多价7
z56.z57.z60.z61.z62
H多价8
每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。
检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的，可在琼脂斜面上移种1代～2代后再检查。如仍只检出一个相的H抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。位相变异试验方法如下：
小玻管法：将半固体管（每管约1mL~2mL）在酒精灯上溶化并冷至50℃，取已知相的H因子血清0.05mL～0.1mL，加人于溶化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内，侯凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花以放琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的尝试应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清1：200～1：800的量加。小倒管法：将两端开口的小玻管（下端开口要留一个缺口，不要平齐）放在半固体管内，小玻管的上端高于培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化冷至50℃，挑取因子血清1环，加入小5
iKAoNiKAca
SN/T4624.7—2016
套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，侯凝固后，将待检菌株接种于小套管的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取勤务检查，或转种1%软琼脂斜面，于37℃培养后再做凝集试验。
简易平板法：将0.35%~0.4%半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清1环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。
6.4.4Vi抗原的鉴定
用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌，都柏林沙门氏菌。
6.4.5菌型的判定
根据血清学分型鉴定的结果，判定菌型。6.5结果与报告
综合以上生化鉴定和血清学鉴定的结果，报告1g（mL）样品中检出（或未检出）沙门氏菌。7
分子生物学检测（选做项自）
7.1细菌模板DNA的提取
7.1.1直接提取法
取6.1中菌液2mL加到2mL无菌离心管中，10000r/min离心2min，尽量弃净上清，沉淀加人TE100μL、10mg/mL溶菌酶100μL，37C温育30min，12000r/min离心2min，沉淀加人TE缓冲液600uL重悬，再加人20mg/mL蛋白酶K25uL，55℃温育1h后沸水浴10min，12000r/min离心5min，取上清保存于一20℃保存以待检测。7.1.2有机溶剂提取法
取6.1中菌液2mL加到2mL无菌离心管中，10000r/min离心2min，弃上清，尽量弃净上清，沉淀加人TE缓冲液570uL重悬，然后加入10mg/mL溶菌嗨100μL，37℃温育30min，再加人10%SDS30μL65℃温育10min，加人等体积的酚混勾，12000r/min离心10min，取上清移人一新离心管中，重复一次，两次酚抽提后取上清加等体积的酚/氯仿（1：1，体积比）混勾，12000r/min离心10min，取上清再移人一新离心管中，加等体积的无水乙醇，1/10体积的3mo1/L乙酸钠，轻缓颠倒混勾，12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用500uL75%乙醇洗两次，离心管开盖室温放置数分钟使乙醇挥发，加人100μL无菌水（预先加热至65℃有利于DNA溶解），一20℃保存以待检测。7.1.3试剂盒法
使用商品化的细菌基因组DVA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。7.2DNA质量检测
将提取的DNA用1.0%含溴化乙锭（或等效染料）的琼脂糖凝胶进行完整性检测。然后用核酸/蛋白分析仪分别在260nm和280nm下测定OD值，用于PCR反应的DNA纯度一般为1.6≤OD25g/OD202.0
7.3PCR方法
引物序列
DNA浓度（ng/μL）=OD26o×50×核酸稀释倍数引物序列及扩增片段长度见表6。引物序列及扩增片段长度
PCR扩增
常规PCR
反应体系
引物来源
PCR反应体系见表7。
试剂名称
10XPCR缓冲液（含Mg+）
dNTP(10mmol/L)
TagDNA聚合酶（5U/μL）
正向引物和反向引物（10(μmol/L）DNA模板（50ng~200ng）
双蒸水
引物序列
SN/T4624.7—2016
扩增片段大小
5-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-35'-TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C-3'表7PCR反应体系
PCR反应体系
补至25.0L
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。7.3.3
PCR反应条件
95℃预变性5min：95℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸308，进行35个循环；72℃延伸7min，4℃保存反应产物。
使用不同PCR仪，可对参数作适当调整7.3.4空白对照、阴性对照和阳性对照设置阴性对照：非沙门氏菌DNA为模板。阳性对照：已知沙门氏菌的DNA或含有待测基因序列的质粒为模板。空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。7.3.5PCR扩增产物的电泳检测
用电泳缓冲液（0.5×TBE)制备2%琼脂糖凝胶，取5μLPCR扩增产物，与1μL上样缓冲液混合，进行点样，DNAmarker（100bpDNAladder）做参照。3V/cm~5V/cm恒压电泳，电泳50min~60min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。SN/T 4624.7—2016
7.3.6PCR扩增结果判定和报告
7.3.6.1对照结果
阳性对照：出现284bp的扩增条带：阴性对照：未出现特征条带；
空白对照：未出现特征条带。
7.3.6.2结果判定和报告
对照实验结果正常，待测样品未出现284bp扩增条带，则可判定该样品PCR扩增结果为阴性，报告1g(mL)样品中未检出沙门氏菌。对照实验结果正常，待测样品出现284bp扩增条带，则可初步判定该样品PCR扩增结果为阳性，
应依据第6章生化、血清学鉴定对该菌进行进一步确认，最终结果以生化鉴定未和血清学鉴定的检测结果
为准，报告1g(mL）样品中检出（或未检出）沙门氏菌。对照实验结果异常，本次待测样品的结果无效，应重新做实验，并排除污染因素。实时荧光PCR方法
引物和探针序列
引物和探针序列见表8。其中探针的5°端标记FAM,3°端标记TAMRA表8引物和探针序列
鉴定菌名称
沙门氏菌
引物序
5'-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3
5'-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG3
7.4.2实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表9。
试剂名称
10XPCR缓冲液（含Mg+）
dNTPs(10 mmal/L)
TaqDNA聚合酶（5U/μL)
正向引物和反向引物(10(μmol/L)）探针（20pmol/L）
DNA模板
双蒸水
探针序列
TCTTAAACGGCGGTGT
5FAMCATTT
CTTTCCCTTA
实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系
各1.0μL
补至25μL
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整8
7.4.3实时荧光PCR反应参数
SN/T4624.7-2016
实时荧光PCR反应参数：37℃5min，95℃预变性3min；94℃变性5s.60℃退火延伸40s，同时收集FAM荧光信号，进行40个循环，4℃保存反应产物。使用不同实时荧光PCR仪，可对参数作适当调整7.4.4空白对照、阴性对照和阳性对照设置阴性对照：非沙门氏菌DNA为模板；阳性对照：已知沙门氏菌的DNA或含有待测基因序列的质粒为模板；空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是实时荧光PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）7.4.5实时荧光PCR扩增结果判定和报告7.4.5.1对照结果
阴性对照：无扩增曲线：Ct值≥40.0：阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct值应30.0；空白对照：无扩增曲线：Ct值≥40.0：否则，检测视为无效。
7.4.5.2结果判定和报告
Ct值≥40.0，可判定该样品实时荧光PCR结果为阴性，报告1gmL）样品中未检出沙门氏菌。结果为阳性，应依据第6章中生化、血清学鉴定对该Ct值≤35.0.可初步判定该样品实时荧光PCR
菌进行进一步确认，最终结果以生化鉴定和血清学鉴定的检测结果为准·报告1g（mL）样品中检出（或未检出）沙门氏菌。
35.040，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常9
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