SN/T 4624.17-2016
基本信息
标准号： SN/T 4624.17-2016
中文名称：入境环保用微生物菌剂检测方法第17部分:恶臭假单胞菌
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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下载大小：3547842
相关标签： 入境 环保 微生物 菌剂 检测 方法 恶臭 单胞菌
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4624.17-2016.Methods for examination of import microbial blends in the environmental protection-Part 17 : Pseudomonas putida.
1范围
SN/T 4624.17规定了人境环保用微生物菌剂符合性检验恶臭假单胞菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR检测方法。
SN/T 4624.17适用于人境环保用微生物菌剂恶臭假单胞菌检测和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3主要试剂和培养基
3.1实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。
3.2 营养琼脂:见附录A中A.1。
3.3 营养肉汤:见A.2。
3.4 革兰氏染色液:见A.3。
3.5淀粉水解培养基:见 A.4.
3.6 显色培养基:见A.5。
3.7 TE缓冲液(pH 8.0):见A.6。
3.8 Taq DNA聚合酶。
3.9 细菌基因组DNA提取试剂盒。
3.1050X TAE缓冲液(pH 8.5):见A.7。
3.11琼脂糖。
3.12溴化乙锭。
3.13 DNA分子量标记:100 bp DNA ladder。
4主要仪器和设备
4.1电子天平(感量0.01 g)。
1范围
SN/T 4624.17规定了人境环保用微生物菌剂符合性检验恶臭假单胞菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR检测方法。
SN/T 4624.17适用于人境环保用微生物菌剂恶臭假单胞菌检测和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3主要试剂和培养基
3.1实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。
3.2 营养琼脂:见附录A中A.1。
3.3 营养肉汤:见A.2。
3.4 革兰氏染色液:见A.3。
3.5淀粉水解培养基:见 A.4.
3.6 显色培养基:见A.5。
3.7 TE缓冲液(pH 8.0):见A.6。
3.8 Taq DNA聚合酶。
3.9 细菌基因组DNA提取试剂盒。
3.1050X TAE缓冲液(pH 8.5):见A.7。
3.11琼脂糖。
3.12溴化乙锭。
3.13 DNA分子量标记:100 bp DNA ladder。
4主要仪器和设备
4.1电子天平(感量0.01 g)。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4624.17—2016
入境环保用微生物菌剂检测方法第17部分：恶臭假单胞菌
Methods for examination of import microbial blends in the environmentalprotection-Part 17:Pseudomonas putida2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分：第1部分：地衣芽孢杆菌：
第2部分：短小芽孢杆菌；
第3部分：巨大芽孢杆菌；
第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌；第5部分：β型溶血性链球菌；
第6部分：金黄色葡萄球菌；
第7部分：沙门氏菌；
第8部分：志贺氏菌：
第9部分：致泻大肠埃希氏菌；
第10部分：淡紫拟青霉；
第11部分：雅致小克银汉霉；
第12部分：哈茨木霉；
第13部分：黄孢原毛平革菌；
第14部分：焦曲每；
第15部分：解淀粉芽孢杆菌；
第16部分：类产碱假单胞菌；
第17部分：恶臭假单胞菌。
本部分为SN/T4624的第17部分
本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。SN/T 4624.17—2016
本部分主要起草人：耿庆华、徐宜宏、孙铭英、于洋、唆微微、韩宏乾、林颖、王芳。1范围
入境环保用微生物菌剂检测方法第17部分：恶臭假单胞菌
SN/T4624.17-2016
SN/T4624的本部分规定了人境环保用微生物菌剂符合性检验恶臭假单胞菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR检测方法。
本部分适用于入境环保用微生物菌剂恶臭假单胞菌检测和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3主要试剂和培养基
实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。3.1
营养琼脂：见附录A中A.1。
营养肉汤：见A.2。
革兰氏染色液：见A.3。
淀粉水解培养基：见A.4。
显色培养基：见A.5。
TE缓冲液（pH8.0)：见A.6
10×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4），200mmol/L氯化钾（KCl），15mmol/L氯化3.8
镁（MgCl）
9dNTP:dATP、dTTP、dGTP、dCTP3.9
3.10TBE：54gTris，27.5g硼酸，800mL去离子水溶解，20mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）定容至1L。
TaqDNA聚合酶。
细菌基因组DNA提取试剂盒。
50XTAE缓冲液（pH8.5)：见A.7。3.14
琼脂糖。
溴化乙锭。
DNA分子量标记：100bpDNAladder。4主要仪器和设备
4.1电子天平（感量0.01g）。
SN/T4624.17—2016
恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃、41℃±1℃。4.2
恒温水浴锅。
台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。4.5PCR扩增仪，
4.6微量移液器和灭菌吸头：10μL、20μL、200L、1000ul。4.7高压灭菌锅。
4.8PCR超净工作台。
4.9电泳仪。
核酸/蛋白分析仪。
凝胶成像系统。
无菌培养Ⅲl：直径90mm。
5样品制备
5.1以无菌操作取1g（mlL.）样品加入到100mL生理盐水中混勾：移取1环菌连续划线接种5个假单胞菌显色培养基平板，30℃士1℃培养24h，观察菌落形态特征。取样过程中，在样品旁边放置1个假单胞菌显色培养基平板作为空白对照5.2.挑取平板上3个～5个单菌落进行形态学鉴定，并挑取符合形态学特征单菌落转营养琼脂平板纯培养，30℃±1℃培养18h~24h，再商落接种营养肉汤，恒温培养箱内增菌培养18h～24h进行生化鉴定以及分子生物学检测的模板DNA提取6形态学鉴定
6.1革兰氏染色
革兰氏染色，镜检。
将5.2中平板上的菌落做涂片进行桌6.2形态学特征
该菌在假单胞菌显色培养基上培养24h形成圆形光滑、湿润黏稠、蓝绿色菌落。革兰氏染色为阴性，杆状，(0.7um~1.1μm）×(2.0μm4.0mLo
生化鉴定
7.1生化鉴定法
取5.2中菌液利用细菌微量生化鉴定管进行生化鉴定，每管加入菌液100uL。7.2生化特征
恶臭假单胞菌生化特征详见表1。2
rKAONiKAca
鉴定项目
氧化酶
精氨酸双水解酶
β-苯丙氨酸
反硝化
明胶液化
淀粉水解
8分子生物学检测
8.1细菌模板DNA的提取
8.1.1直接提取法
表1恶奥假单胞菌生化特征
SN/T4624.17—2016
恶臭假单胞菌
取5.2中菌液2mL加到2mL无菌离心管中，10000r/min离心2min，尽量弃净上清，沉淀加人TE100pL、10mg/mL溶菌酶100uL，37℃温育30min,12000r/min离心2min，沉淀加人TE缓冲液600μL重悬，再加人15mg/ml蛋白酶K25μL，55℃温育1h后沸水浴10min，12000r/min离心5min，取上清保存于一20℃保存以待检测8.1.2有机溶剂提取法
取5.2中菌液2mL加到2mL无菌离心管中，10000r/min离心2min，尽量弃净上清，沉淀加人TE缓冲液570uL.重悬，然后加人10mg/mL溶菌酶100L，37
65℃温育10min，加人等体积的酚分混匀.12000r/min
高心10
温育30min，再加人10%SDS30μL，min，取
清移人一新离心管中，重复一
次，两次酚抽提后取上清加等体积的酚/氯仿（1：1.保积比）混匀，12000r/min离心10min，取上清再移人一新离心管中，加等体积的无水乙1/10体积的3mol/L乙酸钠，轻缓颠倒混匀，12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用500μL的75%乙醇洗两次，离心管开盖室温放置数分钟使乙醇挥发，加人100μL无菌水（预先加热至65℃有利于DNA溶解），一20℃保存以待检测。8.1.3试剂盒法
使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。8.2DNA质量检测
将提取的DNA用1.0%的琼脂糖凝胶（含溴化乙锭或等效染料）进行完整性检测。采用分光光度计法测定DNA的浓度和纯度。DNA浓度计算公式：DNA浓度（ng/μL）=ODz×50×核酸稀释倍数若OD2/OD2在1.82.0之间，表明DNA纯度较好，可用于PCR检测。3
KAoNiKAca
SN/T4624.17—2016
8.3PCR鉴定
引物序列
引物序列及扩增片段长度见表2。表2引物序列及扩增片段长度
PCR扩增
常规PCR
8.3.2反应体系
引物来源
PCR反应体系见表3。
引物序列（5'-3）
5'CTGCATCATGGCCGGTGACAACATTT35'GTC GCA TGG CTG TCG GTC TTCAGATC 3'表3PCR反应体系
试剂名称
10×PCR缓冲液（含Mg*+）
dNTP(2.5mmol/L)
TaqDNA聚合（5U/μL)
正向引物和反向引物（25pmol/μL）DNA模板（50ng~200ng）
双蒸水
PCR反应体系
各1.0μL
补至25μL
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整8.3.3PCR反应条件
扩增片段大小
94℃预变性1min；94℃变性15s，61℃退火15s，72℃延伸15s，进行35个循环；72℃延伸5min。使用不同PCR仪，可对参数作适当调整。8.3.4空白对照、阴性对照和阳性对照设置阴性对照用非恶臭假单胞菌DNA为模板：阳性对照用已知恶臭假单胞菌的DNA（参见附录B）或含有待测基因序列的质粒为模板；空白对照共设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。8.3.5PCR扩增产物的电泳检测
用电泳缓冲液（0.5×TBE）制备2%琼脂糖凝胶，取5μLPCR扩增产物和1μL上样缓冲液混合，进行点样，DNAmarker（100bpDNAladder）做参照。3V/cm~5V/cm恒压电泳，电泳50min~60min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。4
-iikAoNiKAca
8.4PCR扩增结果判定
对照结果
阳性对照：出现161bp的扩增条带；阴性对照：未出现特征条带；
空白对照：未出现特征条带。
8.4.2检测结果
SN/T4624.17—2016
对照实验结果正常，待测样品出现161bp扩增条带，则可判定该样品PCR扩增结果为阳性；对照实验结果正常，待测样品未出现161bp扩增条带，则可判定该样品PCR扩增结果为阴性；对照实验结果异常，本次待测样品的结果无效，应重新做实验，并排除污染因素9
结果报告
当形态学鉴定、生化鉴定、分子生物学检测结果符合时，报告检出恶臭假单胞菌；当形态学鉴定、生化鉴定、分子生物学检测不符合时，建议重做：仍有不符合时，报告未检出恶臭假单胞菌。
KAoNiKAca
SN/T4624.17—2016
营养琼脂
A.1.1成分
蔗糖（CHaOu）免费标准bzxz.net
蛋白陈
磷酸氢二钾（K,HPO）
硫酸镁（MgSO4·7H,O)
抗坏血酸
蒸馏水
A.1.2制法
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
1000ml
将以上成分混合加热溶化，调节pH至7.2~7.4，120高压灭菌20min。
营养肉汤NB
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
A.2.2制法
将以上成分混合加热溶化后，校正pH，分装烧瓶，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。3革兰氏染色液
结晶紫染色液
A.3.1.1成分
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。HTKAONTKAca
A.3.2革兰氏碘液
A.3.2.1成分
碘化钾
蒸馏水
A.3.2.2制法
SN/T4624.17-2016
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振择待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.3.3沙黄复染液
A.3.3.1成分
95%乙醇
蒸馏水
2制法
将沙黄溶解于乙醇中，然后加入蒸馏水。A.4淀粉水解培养基
A.4.1成分
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
可溶性淀粉
蒸馏水
A.4.2制法
用少量水先将可溶性淀粉溶解，其他成分溶化在蒸馏水中，校正pH值，115℃高压灭菌15min。A.4.3
试验方法
将细菌划线接种于可溶性淀粉琼脂平板上，在37℃培养24h。取出平板，在菌落处滴加碘液少许，观察。培养基呈深蓝色，说明淀粉未被水解，即淀粉酶阴性。能水解淀粉的细菌其菌落周围有透明的环(即淀粉酶阳性）。
假单胞菌显色培养基
A.5.1成分
蛋白陈、酵母浸出物
SN/T4624.17—2016
蒸馏水
A.5.2制法
1000mL
将以上成分混合加热溶化，调节pH至7.5土0.2。A.6
TE缓冲液（pH8.0）
1mol/LTris-盐酸（pH8.0)
500 mmol/LEDTA(pH8.0)
蒸馏水
A.6.2制法
分装后121℃高压灭菌15min。
50×TAE缓冲液（pH8.5）
NaEDTA·2H20
冰醋酸
0.05mol/LEDTA
A.7.2制法
1000ml
在800mL的去离子水中加人242gTris和37.2gNazEDTA·2HzO，充分搅拌溶解。加人57.1mL的醋酸，充分混。加去离子水定容至1L，调节pH至8.5，室温保存。8
（资料性附录）
恶臭假单胞菌基因序列（GenBankAJ414224）SN/T4624.17—2016
cagcaaatcgttaccctgacttacccgcacatcggcaacaccggcaccacgccggaagacgccgagtccaaccgcgtatggtctgccggcctggtcatccgtgacctgccactggtggcgagcaactggcgtaacacgatgtccctgtccgactacctgaaagccaacaatgiggtggctatcgccggtatcgacacccgccgcctgacgcgcatcctgcgtgagaaaggcgcgcagaacggctgcatcatggccggtgacaacatttccgaagaagcggccattgcagcagcgcgcggcttcccgggcttgaagggcatggacctggcaaaagtcgtcagcaccaaagagcaatacgaatggcgctgactgtctgggatctgaagaccgacagccatgcgaccatcgatgccagcgaactgccgcaccacgtcgtagcctacgactacggtgtcaaggtcaacatcctgcgcalgctggtcgagcgcggttgccgcgtgaccgtggtgccggcgcaaaccccggccgccgatgtgctggcgctgaatccggatggcgtgttcctgtccaacggcccgggtgaccctgagccttgcgactacgcgatccaggcgatcaaggaa
SN/T4624.17-2016
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
入境环保用微生物菌剂检测方法第17部分：恶臭假单胞菌
SN/T4624.17-2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010）68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880X12301/16印张1字数20千字2017年11月第一版2017年11月第一次印刷印数1—500
书号：155066·2-32278
定价18.00元
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入境环保用微生物菌剂检测方法第17部分：恶臭假单胞菌
Methods for examination of import microbial blends in the environmentalprotection-Part 17:Pseudomonas putida2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分：第1部分：地衣芽孢杆菌：
第2部分：短小芽孢杆菌；
第3部分：巨大芽孢杆菌；
第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌；第5部分：β型溶血性链球菌；
第6部分：金黄色葡萄球菌；
第7部分：沙门氏菌；
第8部分：志贺氏菌：
第9部分：致泻大肠埃希氏菌；
第10部分：淡紫拟青霉；
第11部分：雅致小克银汉霉；
第12部分：哈茨木霉；
第13部分：黄孢原毛平革菌；
第14部分：焦曲每；
第15部分：解淀粉芽孢杆菌；
第16部分：类产碱假单胞菌；
第17部分：恶臭假单胞菌。
本部分为SN/T4624的第17部分
本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。SN/T 4624.17—2016
本部分主要起草人：耿庆华、徐宜宏、孙铭英、于洋、唆微微、韩宏乾、林颖、王芳。1范围
入境环保用微生物菌剂检测方法第17部分：恶臭假单胞菌
SN/T4624.17-2016
SN/T4624的本部分规定了人境环保用微生物菌剂符合性检验恶臭假单胞菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR检测方法。
本部分适用于入境环保用微生物菌剂恶臭假单胞菌检测和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3主要试剂和培养基
实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。3.1
营养琼脂：见附录A中A.1。
营养肉汤：见A.2。
革兰氏染色液：见A.3。
淀粉水解培养基：见A.4。
显色培养基：见A.5。
TE缓冲液（pH8.0)：见A.6
10×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4），200mmol/L氯化钾（KCl），15mmol/L氯化3.8
镁（MgCl）
9dNTP:dATP、dTTP、dGTP、dCTP3.9
3.10TBE：54gTris，27.5g硼酸，800mL去离子水溶解，20mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）定容至1L。
TaqDNA聚合酶。
细菌基因组DNA提取试剂盒。
50XTAE缓冲液（pH8.5)：见A.7。3.14
琼脂糖。
溴化乙锭。
DNA分子量标记：100bpDNAladder。4主要仪器和设备
4.1电子天平（感量0.01g）。
SN/T4624.17—2016
恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃、41℃±1℃。4.2
恒温水浴锅。
台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。4.5PCR扩增仪，
4.6微量移液器和灭菌吸头：10μL、20μL、200L、1000ul。4.7高压灭菌锅。
4.8PCR超净工作台。
4.9电泳仪。
核酸/蛋白分析仪。
凝胶成像系统。
无菌培养Ⅲl：直径90mm。
5样品制备
5.1以无菌操作取1g（mlL.）样品加入到100mL生理盐水中混勾：移取1环菌连续划线接种5个假单胞菌显色培养基平板，30℃士1℃培养24h，观察菌落形态特征。取样过程中，在样品旁边放置1个假单胞菌显色培养基平板作为空白对照5.2.挑取平板上3个～5个单菌落进行形态学鉴定，并挑取符合形态学特征单菌落转营养琼脂平板纯培养，30℃±1℃培养18h~24h，再商落接种营养肉汤，恒温培养箱内增菌培养18h～24h进行生化鉴定以及分子生物学检测的模板DNA提取6形态学鉴定
6.1革兰氏染色
革兰氏染色，镜检。
将5.2中平板上的菌落做涂片进行桌6.2形态学特征
该菌在假单胞菌显色培养基上培养24h形成圆形光滑、湿润黏稠、蓝绿色菌落。革兰氏染色为阴性，杆状，(0.7um~1.1μm）×(2.0μm4.0mLo
生化鉴定
7.1生化鉴定法
取5.2中菌液利用细菌微量生化鉴定管进行生化鉴定，每管加入菌液100uL。7.2生化特征
恶臭假单胞菌生化特征详见表1。2
rKAONiKAca
鉴定项目
氧化酶
精氨酸双水解酶
β-苯丙氨酸
反硝化
明胶液化
淀粉水解
8分子生物学检测
8.1细菌模板DNA的提取
8.1.1直接提取法
表1恶奥假单胞菌生化特征
SN/T4624.17—2016
恶臭假单胞菌
取5.2中菌液2mL加到2mL无菌离心管中，10000r/min离心2min，尽量弃净上清，沉淀加人TE100pL、10mg/mL溶菌酶100uL，37℃温育30min,12000r/min离心2min，沉淀加人TE缓冲液600μL重悬，再加人15mg/ml蛋白酶K25μL，55℃温育1h后沸水浴10min，12000r/min离心5min，取上清保存于一20℃保存以待检测8.1.2有机溶剂提取法
取5.2中菌液2mL加到2mL无菌离心管中，10000r/min离心2min，尽量弃净上清，沉淀加人TE缓冲液570uL.重悬，然后加人10mg/mL溶菌酶100L，37
65℃温育10min，加人等体积的酚分混匀.12000r/min
高心10
温育30min，再加人10%SDS30μL，min，取
清移人一新离心管中，重复一
次，两次酚抽提后取上清加等体积的酚/氯仿（1：1.保积比）混匀，12000r/min离心10min，取上清再移人一新离心管中，加等体积的无水乙1/10体积的3mol/L乙酸钠，轻缓颠倒混匀，12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用500μL的75%乙醇洗两次，离心管开盖室温放置数分钟使乙醇挥发，加人100μL无菌水（预先加热至65℃有利于DNA溶解），一20℃保存以待检测。8.1.3试剂盒法
使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。8.2DNA质量检测
将提取的DNA用1.0%的琼脂糖凝胶（含溴化乙锭或等效染料）进行完整性检测。采用分光光度计法测定DNA的浓度和纯度。DNA浓度计算公式：DNA浓度（ng/μL）=ODz×50×核酸稀释倍数若OD2/OD2在1.82.0之间，表明DNA纯度较好，可用于PCR检测。3
KAoNiKAca
SN/T4624.17—2016
8.3PCR鉴定
引物序列
引物序列及扩增片段长度见表2。表2引物序列及扩增片段长度
PCR扩增
常规PCR
8.3.2反应体系
引物来源
PCR反应体系见表3。
引物序列（5'-3）
5'CTGCATCATGGCCGGTGACAACATTT35'GTC GCA TGG CTG TCG GTC TTCAGATC 3'表3PCR反应体系
试剂名称
10×PCR缓冲液（含Mg*+）
dNTP(2.5mmol/L)
TaqDNA聚合（5U/μL)
正向引物和反向引物（25pmol/μL）DNA模板（50ng~200ng）
双蒸水
PCR反应体系
各1.0μL
补至25μL
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整8.3.3PCR反应条件
扩增片段大小
94℃预变性1min；94℃变性15s，61℃退火15s，72℃延伸15s，进行35个循环；72℃延伸5min。使用不同PCR仪，可对参数作适当调整。8.3.4空白对照、阴性对照和阳性对照设置阴性对照用非恶臭假单胞菌DNA为模板：阳性对照用已知恶臭假单胞菌的DNA（参见附录B）或含有待测基因序列的质粒为模板；空白对照共设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。8.3.5PCR扩增产物的电泳检测
用电泳缓冲液（0.5×TBE）制备2%琼脂糖凝胶，取5μLPCR扩增产物和1μL上样缓冲液混合，进行点样，DNAmarker（100bpDNAladder）做参照。3V/cm~5V/cm恒压电泳，电泳50min~60min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。4
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8.4PCR扩增结果判定
对照结果
阳性对照：出现161bp的扩增条带；阴性对照：未出现特征条带；
空白对照：未出现特征条带。
8.4.2检测结果
SN/T4624.17—2016
对照实验结果正常，待测样品出现161bp扩增条带，则可判定该样品PCR扩增结果为阳性；对照实验结果正常，待测样品未出现161bp扩增条带，则可判定该样品PCR扩增结果为阴性；对照实验结果异常，本次待测样品的结果无效，应重新做实验，并排除污染因素9
结果报告
当形态学鉴定、生化鉴定、分子生物学检测结果符合时，报告检出恶臭假单胞菌；当形态学鉴定、生化鉴定、分子生物学检测不符合时，建议重做：仍有不符合时，报告未检出恶臭假单胞菌。
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SN/T4624.17—2016
营养琼脂
A.1.1成分
蔗糖（CHaOu）免费标准bzxz.net
蛋白陈
磷酸氢二钾（K,HPO）
硫酸镁（MgSO4·7H,O)
抗坏血酸
蒸馏水
A.1.2制法
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
1000ml
将以上成分混合加热溶化，调节pH至7.2~7.4，120高压灭菌20min。
营养肉汤NB
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
A.2.2制法
将以上成分混合加热溶化后，校正pH，分装烧瓶，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。3革兰氏染色液
结晶紫染色液
A.3.1.1成分
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。HTKAONTKAca
A.3.2革兰氏碘液
A.3.2.1成分
碘化钾
蒸馏水
A.3.2.2制法
SN/T4624.17-2016
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振择待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.3.3沙黄复染液
A.3.3.1成分
95%乙醇
蒸馏水
2制法
将沙黄溶解于乙醇中，然后加入蒸馏水。A.4淀粉水解培养基
A.4.1成分
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
可溶性淀粉
蒸馏水
A.4.2制法
用少量水先将可溶性淀粉溶解，其他成分溶化在蒸馏水中，校正pH值，115℃高压灭菌15min。A.4.3
试验方法
将细菌划线接种于可溶性淀粉琼脂平板上，在37℃培养24h。取出平板，在菌落处滴加碘液少许，观察。培养基呈深蓝色，说明淀粉未被水解，即淀粉酶阴性。能水解淀粉的细菌其菌落周围有透明的环(即淀粉酶阳性）。
假单胞菌显色培养基
A.5.1成分
蛋白陈、酵母浸出物
SN/T4624.17—2016
蒸馏水
A.5.2制法
1000mL
将以上成分混合加热溶化，调节pH至7.5土0.2。A.6
TE缓冲液（pH8.0）
1mol/LTris-盐酸（pH8.0)
500 mmol/LEDTA(pH8.0)
蒸馏水
A.6.2制法
分装后121℃高压灭菌15min。
50×TAE缓冲液（pH8.5）
NaEDTA·2H20
冰醋酸
0.05mol/LEDTA
A.7.2制法
1000ml
在800mL的去离子水中加人242gTris和37.2gNazEDTA·2HzO，充分搅拌溶解。加人57.1mL的醋酸，充分混。加去离子水定容至1L，调节pH至8.5，室温保存。8
（资料性附录）
恶臭假单胞菌基因序列（GenBankAJ414224）SN/T4624.17—2016
cagcaaatcgttaccctgacttacccgcacatcggcaacaccggcaccacgccggaagacgccgagtccaaccgcgtatggtctgccggcctggtcatccgtgacctgccactggtggcgagcaactggcgtaacacgatgtccctgtccgactacctgaaagccaacaatgiggtggctatcgccggtatcgacacccgccgcctgacgcgcatcctgcgtgagaaaggcgcgcagaacggctgcatcatggccggtgacaacatttccgaagaagcggccattgcagcagcgcgcggcttcccgggcttgaagggcatggacctggcaaaagtcgtcagcaccaaagagcaatacgaatggcgctgactgtctgggatctgaagaccgacagccatgcgaccatcgatgccagcgaactgccgcaccacgtcgtagcctacgactacggtgtcaaggtcaacatcctgcgcalgctggtcgagcgcggttgccgcgtgaccgtggtgccggcgcaaaccccggccgccgatgtgctggcgctgaatccggatggcgtgttcctgtccaacggcccgggtgaccctgagccttgcgactacgcgatccaggcgatcaaggaa
SN/T4624.17-2016
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
入境环保用微生物菌剂检测方法第17部分：恶臭假单胞菌
SN/T4624.17-2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010）68533533
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中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880X12301/16印张1字数20千字2017年11月第一版2017年11月第一次印刷印数1—500
书号：155066·2-32278
定价18.00元
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