SN/T 4624.16-2016
基本信息
标准号： SN/T 4624.16-2016
中文名称：入境环保用微生物菌剂检测方法第16部分:类产碱假单胞菌
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：3248548
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4624.16-2016.Methods for examination of import microbial blends in the environmental protection-Part 16 : Pseudomonas pseudoalcaligenes.
1范围
SN/T 4624.16规定了人境用环保微生物菌剂符合性检验类产碱假单胞菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR检测方法。
SN/T 4624.16适用于人境用环保微生物菌剂符合性类产碱假单胞菌检测和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3主要试剂和培养基
3.1实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。
3.2 营养琼脂:见附录A中A.1。
3.3 营养肉汤:见A.2。
3.4 革兰氏染色液:见A.3。
3.5 显色培养基:见A.4。
3.6 TE缓冲液(pH 8.0):见A.5。
3.7 琼脂糖。
3.8 溴化乙锭
3.9 DNA分子量标记:100 bp DNA ladder.
4主要仪器和设备
4.1 电子天平(感量0.01 g)。
1范围
SN/T 4624.16规定了人境用环保微生物菌剂符合性检验类产碱假单胞菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR检测方法。
SN/T 4624.16适用于人境用环保微生物菌剂符合性类产碱假单胞菌检测和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3主要试剂和培养基
3.1实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。
3.2 营养琼脂:见附录A中A.1。
3.3 营养肉汤:见A.2。
3.4 革兰氏染色液:见A.3。
3.5 显色培养基:见A.4。
3.6 TE缓冲液(pH 8.0):见A.5。
3.7 琼脂糖。
3.8 溴化乙锭
3.9 DNA分子量标记:100 bp DNA ladder.
4主要仪器和设备
4.1 电子天平(感量0.01 g)。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4624.16—2016
入境环保用微生物菌剂检测方法第16部分：类产碱假单胞菌
Methods for examination of import microbial blends in the environmentalprotection-Part 16:Pseudomonas pseudoalcaligenes2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分：第1部分：地衣芽孢杆菌；
第2部分：短小芽孢杆菌；
第3部分：巨大芽孢杆菌；
第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌；第5部分：β型溶血性链球菌；
第6部分：金黄色葡萄球菌；
第7部分：沙门氏菌；
第8部分：志贺氏菌：
第9部分：致泻大肠埃希氏菌；
第10部分：淡紫拟青霉；
第11部分：雅致小克银汉霉；
第12部分：哈茨木霉；
第13部分：黄孢原毛平革菌；
第14部分：焦曲；
第15部分：解淀粉芽孢杆菌；
第16部分：类产碱假单胞菌；此内容来自标准下载网
第17部分：恶臭假单胞菌。
本部分为SN/T4624的第16部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局本部分主要起草人：耿庆华、徐宜宏、刘瑜、于洋、峻微徽、韩宏乾、林颖、王芳SN/T4624.16——2016
1范围
入境环保用微生物菌剂检测方法第16部分：类产碱假单胞菌
SN/T4624.16—2016
SN/T4624的本部分规定了入境用环保微生物菌剂符合性检验类产碱假单胞菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR检测方法。
本部分适用于入境用环保微生物菌剂符合性类产碱假单胞菌检测和鉴定。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法主要试剂和培养基
实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。营养琼脂：见附录A中A.1。
营养肉汤：见A.2。
革兰氏染色液：见A.3。
显色培养基：见A.4。
TE缓冲液（pH8.0）：见A.5。
10×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4），200mmol/L氯化钾（KCl)，15mmol/L氯化镁（MgCl）。
dNTP:dATP,dTTP.dGTP,dCTP。
TBE：54gTris.27.5g硼酸，800mL去离子水溶解，20mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）定容至3.9
TagDNA聚合酶。
细菌基因组DNA提取试剂盒。
50XTAE缓冲液（pH8.5）：见A.6。3.12
3.13琼脂糖。
3.14溴化乙锭
3.15DNA分子量标记：100bpDNAladdcr。4主要仪器和设备
1电子天平（感量0.01g）。
SN/T4624.16--2016
4.2恒温培养箱：30℃±1℃.36℃±1℃。4.3恒温水浴锅。
台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。4.4
PCR扩增仪。
实时荧光PCR仪。
微量移液器和灭菌吸头：10μl、20uL、200μL、1000uL。高压灭菌锅。
PCR超净工作台。
电泳仪。
核酸/蛋白分析仪。
凝胶成像系统。
无菌培养Ⅲ：直径90mm。
5样品制备
5.1以无菌操作取1g（mL）样品加人到100mL生理盐水中混勺移取1环菌连续划线接种5个假单胞菌显色培养基平板，30℃士1℃培养24h，观察菌落形态特征，取样过程中，在样品旁边放置1个假单胞菌显色培养基平板作为空白对照5.2挑取平板上3个～5个单茵落进行形态学鉴定，并挑取符合形态学特征单菌落转营养琼脂平板纯培养，30℃土1℃培养18h~24h，再从纯培养平板上挑取菌落接种营养肉汤，恒温培养箱内增菌培养18h~24h进行生化鉴定以及分子生物学检测的模板DNA提取，6形态学鉴定
革兰氏染色
将5.2中平板上的菌落做涂片进行革兰氏染色，镜检。6.2形态特征
该菌在假单胞菌显色培养基上培养241形成圆形光滑、湿润黏稠、蓝绿色菌落。革兰氏染色为阴性.杆状，（0.7μm~0.8μm）×（1.2μm2.5μm）。7生化鉴定
7.1生化鉴定法
取5.2中菌液利用细菌微量生化鉴定管进行生化鉴定，每管加入菌液100uL。7.2生化特征
类产碱假单胞菌生化特征详见表1。2
rKAorKAca
精氨酸双水解酶
明胶液化
葡萄糖
D-核糖
D-木糖
L-鼠李糖
赤薛醇
8分子生物学检测
8.1细菌模板DNA的提取
8.1.1直接提取法
表1类产碱假单胞菌生化特征
SN/T 4624.16—2016
取5.2中菌液2mL加到2mlL无菌离心管中.10000/min离心2min，尽量弃净上清，沉淀加入TE100μL、10mg/mL溶菌酶100μl.37C温育30min.12000r/min离心2min，沉淀加人TE缓冲液600μL重悬，再加人15mg/mL蛋口酶K25μL.55C温育1h后沸水浴10min，12000r/min离心5min，取上清保存于一20℃保存以待检测8.1.2有机溶剂提取法
取5.2中菌液2mL加到2mL
无菌心管中
/mm离心2min，尽量弃净上清，沉淀加入.10000r
TE缓冲液570μL重悬，然后加人100mg/ml溶菌醛100μL，37℃温育30min，再加人10%SDS30μL，65℃温育10min，加人等体积的酚混勾，1次，两次酚抽提后取上清加等体积的酚/氧000r
min离
、10min.取上清移入一新离心管中，重复一，保积比
混勾：
移人一新离心管中，加等体积的无水乙尊，1/10体积的离心10min，弃上清，沉淀用500ul%乙醇洗两次
100L无菌水（预先加热至65℃有利子DNA溶解
8.1.3试剂盒法
/min离心10min，取上清再
乙酸钠，轻缓颠倒混匀，12000r/min高心管
放置数分钟使乙醇挥发，加人
开盖室温
20℃保存以待检测。
使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行8.2DNA质量检测
将提取的DNA用1.0%的琼脂糖凝胶（含溴化乙锭或等效染料)进行完整性检测。采用分光光度计法测定DNA的浓度和纯度。DNA浓度计算公式：DNA浓度（ng/μL）=OD260×50×核酸稀释倍数若ODz/ODz在1.8～2.0之间，表明DNA纯度较好，可用于PCR检测。8.3PCR鉴定
引物序列
引物序列及扩增片段长度见表2。KoNiKca
SN/T 4624.16—2016
PCR扩增
常规PCR
反应体系
引物来源
PCR反应体系见表3。
引物序列及扩增片段长度
引物序列（5°-3°）
gyrBUpl : 5'ACT GCT GTC GGGGAT ACC GAC GGT 3'gyrBLoW1:5'AACTTCTTCGCCAGACCTTCGGCT3表3PCR反应体系
试剂名称
10XPCR缓冲液（含Mg）
dNTP(2.5 mmol/L)
TagDNA聚合酶（5U/μL)
正向引物和反向引物（25pmol/μL）DNA模板（50ng~200ng）
双蒸水
PCR反应体系
补至25μL
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整3PCR反应条件
扩增片段大小
94℃预变性1min；94℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸15s.进行30个循环；72℃延伸5min。使用不同PCR仪，可对参数作适当调整。8.3.4空白对照、阴性对照和阳性对照设置阴性对照用非类产碱假单胞菌DNA为模板：阳性对照用已知类产碱假单胞菌的DNA（参见附录B）或含有待测基因序列的质粒为模板：空白对照共设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。8.3.5PCR扩增产物的电泳检测
用电泳缓冲液（0.5×TBE）制备2%琼脂糖凝胶，取5uLPCR扩增产物和1μL上样缓冲液混合，进行点样，DNAmarker（100bpDNAladder）做参照。3V/cm~5V/cm恒压电泳，电泳50min~60 min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。8.3.6PCR扩增结果判定
8.3.6.1对照结果
阳性对照：出现455bp的扩增条带，阴性对照：未出现特征条带。
空白对照：未出现特征条带。
-rKAONTKAca
8.3.6.2检测结果
SN/T4624.162016
对照实验结果正常，待测样品出现455bp扩增条带，则可判定该样品PCR扩增结果为阳性。对照实验结果正常，待测样品未出现455bp扩增条带，则可判定该样品PCR扩增结果为阴性。对照实验结果异常，本次待测样品的结果无效，应重新做实验，并排除污染因素。9结果报告
当形态学鉴定、生化鉴定、分了生物学检测结果符合时，报告检出类产碱假单胞菌当形态学鉴定、生化鉴定、分子生物学检测不符合时，建议重做：仍有不符合时，报告未检出类产碱假单胞菌
-KAoNIKAca
SN/T4624.16—2016
营养琼脂
A.1.1成分
熊糖（CH22On）
蛋白陈
磷酸氢二钾（K,HPO,）
硫酸镁（MgSO.7H,O)
抗坏血酸
蒸馏水
A.1.2制法
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
1000ml
将以上成分混合加热溶化，调节pH至7.27.4，120℃高压灭菌20
营养肉汤NB
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
A.2.2制法
将以上成分混合加热溶化后.校正pH值，分装烧瓶，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。A.3
革兰氏染色液
结晶紫染色液
A.3.1.1成分
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
A.3.1.2制法
将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合6
-KAoNrKAca
革兰氏碘液
碘化钾
蒸馏水
A.3.2.2制法
SN/T4624.16-—2016
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.3.3
沙黄复染液
A.3.3.1成分
95%乙醇
蒸馏水
将沙黄溶解于乙醇中，然后加人蒸馏水A.4
假单胞菌显色培养基
蛋白陈、酵母浸出物
蒸馅水
2制法
1000mL
将以上成分混合加热溶化，调节pH至7.5士0.2。5TE缓冲液（pH8.0）
A.5.1成分
1mol/LTris-盐酸(pH8.0)
500mmol/LEDTA(pH 8.0)
蒸馏水
A.5.2制法
分装后121℃高压灭菌15min。
SN/T4624.16—2016
50×TAE缓冲液（pH8.5）
NaEDTA·2HO
冰醋酸
0.05mol/LEDTA
2制法
在800mI.的去离子水中加人242gTris和37.2gNaEDTA·2H.O，充分搅拌溶解。加人57.1mL的醋酸，充分混勾。加去离了水定容至1L，调节pH至8.5，室温保存。8
（资料性附录）
类产碱假单胞菌基因序列（GenBankAB039439.1）SN/T4624.16-—2016
ccggcggcctgcacggtgtgggtgtctcggiggtcaatgccctctccaaggagctggtactgaccatccgccgtagcggtaagatctgggaacagacctatgtgcatggtgtgccgcaagcccccctgactgctgtcggggataccgacggtaccggcacgcaaatccacttcaagccctccgaagaaaccttcgccaacatccacttcagctgggacatcctggccaagcgtctgcgcgaactgtccttccteaactccggcgtggggattctgctgcgtgatgaacgcaecggcaaggaagagctgttcaagtacgagggcggcctgaaagccttcgttgagtacctgaacaccaacaagaccgtagtcaaccaggtattccacttcagigigcagcgtgaagaagacgglgltggtgtcgaagtcgccctgcagtggaacgacagtttcaacgagaacatcctctgcttcaccaacaacattccccagcgtgacggtggtactcacctggcgggcttccgctctgccctcacccgacacctgaacaactacatcgaagccgaaggtctggcgaagaagttcaaggtcgccaccaccggtgacgatgcccgtgaaggcctgactgcaattatctcggtcaaggtgccggacccgaaattcagctcgcagaccaaggataagctggtctccagcgaggtgaagaccgcggtcgagcaggagatgggcaagtactttgccgacttcctgctggaaaaccccaacgaagccaaggctgtggtcggcaagatgatcgatgcagcacgtgcccgtgaagcagcgcgtaaggcgcgtgagatgacccgccgcaagggggcgctggacatcgccgggctgcceggcaaactggccgac
SN/T4624.16-2016
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
入境环保用微生物菌剂检测方法第16部分：类产碱假单胞菌
SN/T4624.16—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010）68533533
网址spe.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880X12301/16印张1字数20千字2017年11月第一版2017年11月第一次印刷印数1—500
书号：155066·2-32279定价18.00元
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入境环保用微生物菌剂检测方法第16部分：类产碱假单胞菌
Methods for examination of import microbial blends in the environmentalprotection-Part 16:Pseudomonas pseudoalcaligenes2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分：第1部分：地衣芽孢杆菌；
第2部分：短小芽孢杆菌；
第3部分：巨大芽孢杆菌；
第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌；第5部分：β型溶血性链球菌；
第6部分：金黄色葡萄球菌；
第7部分：沙门氏菌；
第8部分：志贺氏菌：
第9部分：致泻大肠埃希氏菌；
第10部分：淡紫拟青霉；
第11部分：雅致小克银汉霉；
第12部分：哈茨木霉；
第13部分：黄孢原毛平革菌；
第14部分：焦曲；
第15部分：解淀粉芽孢杆菌；
第16部分：类产碱假单胞菌；此内容来自标准下载网
第17部分：恶臭假单胞菌。
本部分为SN/T4624的第16部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局本部分主要起草人：耿庆华、徐宜宏、刘瑜、于洋、峻微徽、韩宏乾、林颖、王芳SN/T4624.16——2016
1范围
入境环保用微生物菌剂检测方法第16部分：类产碱假单胞菌
SN/T4624.16—2016
SN/T4624的本部分规定了入境用环保微生物菌剂符合性检验类产碱假单胞菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR检测方法。
本部分适用于入境用环保微生物菌剂符合性类产碱假单胞菌检测和鉴定。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法主要试剂和培养基
实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。营养琼脂：见附录A中A.1。
营养肉汤：见A.2。
革兰氏染色液：见A.3。
显色培养基：见A.4。
TE缓冲液（pH8.0）：见A.5。
10×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4），200mmol/L氯化钾（KCl)，15mmol/L氯化镁（MgCl）。
dNTP:dATP,dTTP.dGTP,dCTP。
TBE：54gTris.27.5g硼酸，800mL去离子水溶解，20mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）定容至3.9
TagDNA聚合酶。
细菌基因组DNA提取试剂盒。
50XTAE缓冲液（pH8.5）：见A.6。3.12
3.13琼脂糖。
3.14溴化乙锭
3.15DNA分子量标记：100bpDNAladdcr。4主要仪器和设备
1电子天平（感量0.01g）。
SN/T4624.16--2016
4.2恒温培养箱：30℃±1℃.36℃±1℃。4.3恒温水浴锅。
台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。4.4
PCR扩增仪。
实时荧光PCR仪。
微量移液器和灭菌吸头：10μl、20uL、200μL、1000uL。高压灭菌锅。
PCR超净工作台。
电泳仪。
核酸/蛋白分析仪。
凝胶成像系统。
无菌培养Ⅲ：直径90mm。
5样品制备
5.1以无菌操作取1g（mL）样品加人到100mL生理盐水中混勺移取1环菌连续划线接种5个假单胞菌显色培养基平板，30℃士1℃培养24h，观察菌落形态特征，取样过程中，在样品旁边放置1个假单胞菌显色培养基平板作为空白对照5.2挑取平板上3个～5个单茵落进行形态学鉴定，并挑取符合形态学特征单菌落转营养琼脂平板纯培养，30℃土1℃培养18h~24h，再从纯培养平板上挑取菌落接种营养肉汤，恒温培养箱内增菌培养18h~24h进行生化鉴定以及分子生物学检测的模板DNA提取，6形态学鉴定
革兰氏染色
将5.2中平板上的菌落做涂片进行革兰氏染色，镜检。6.2形态特征
该菌在假单胞菌显色培养基上培养241形成圆形光滑、湿润黏稠、蓝绿色菌落。革兰氏染色为阴性.杆状，（0.7μm~0.8μm）×（1.2μm2.5μm）。7生化鉴定
7.1生化鉴定法
取5.2中菌液利用细菌微量生化鉴定管进行生化鉴定，每管加入菌液100uL。7.2生化特征
类产碱假单胞菌生化特征详见表1。2
rKAorKAca
精氨酸双水解酶
明胶液化
葡萄糖
D-核糖
D-木糖
L-鼠李糖
赤薛醇
8分子生物学检测
8.1细菌模板DNA的提取
8.1.1直接提取法
表1类产碱假单胞菌生化特征
SN/T 4624.16—2016
取5.2中菌液2mL加到2mlL无菌离心管中.10000/min离心2min，尽量弃净上清，沉淀加入TE100μL、10mg/mL溶菌酶100μl.37C温育30min.12000r/min离心2min，沉淀加人TE缓冲液600μL重悬，再加人15mg/mL蛋口酶K25μL.55C温育1h后沸水浴10min，12000r/min离心5min，取上清保存于一20℃保存以待检测8.1.2有机溶剂提取法
取5.2中菌液2mL加到2mL
无菌心管中
/mm离心2min，尽量弃净上清，沉淀加入.10000r
TE缓冲液570μL重悬，然后加人100mg/ml溶菌醛100μL，37℃温育30min，再加人10%SDS30μL，65℃温育10min，加人等体积的酚混勾，1次，两次酚抽提后取上清加等体积的酚/氧000r
min离
、10min.取上清移入一新离心管中，重复一，保积比
混勾：
移人一新离心管中，加等体积的无水乙尊，1/10体积的离心10min，弃上清，沉淀用500ul%乙醇洗两次
100L无菌水（预先加热至65℃有利子DNA溶解
8.1.3试剂盒法
/min离心10min，取上清再
乙酸钠，轻缓颠倒混匀，12000r/min高心管
放置数分钟使乙醇挥发，加人
开盖室温
20℃保存以待检测。
使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行8.2DNA质量检测
将提取的DNA用1.0%的琼脂糖凝胶（含溴化乙锭或等效染料)进行完整性检测。采用分光光度计法测定DNA的浓度和纯度。DNA浓度计算公式：DNA浓度（ng/μL）=OD260×50×核酸稀释倍数若ODz/ODz在1.8～2.0之间，表明DNA纯度较好，可用于PCR检测。8.3PCR鉴定
引物序列
引物序列及扩增片段长度见表2。KoNiKca
SN/T 4624.16—2016
PCR扩增
常规PCR
反应体系
引物来源
PCR反应体系见表3。
引物序列及扩增片段长度
引物序列（5°-3°）
gyrBUpl : 5'ACT GCT GTC GGGGAT ACC GAC GGT 3'gyrBLoW1:5'AACTTCTTCGCCAGACCTTCGGCT3表3PCR反应体系
试剂名称
10XPCR缓冲液（含Mg）
dNTP(2.5 mmol/L)
TagDNA聚合酶（5U/μL)
正向引物和反向引物（25pmol/μL）DNA模板（50ng~200ng）
双蒸水
PCR反应体系
补至25μL
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整3PCR反应条件
扩增片段大小
94℃预变性1min；94℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸15s.进行30个循环；72℃延伸5min。使用不同PCR仪，可对参数作适当调整。8.3.4空白对照、阴性对照和阳性对照设置阴性对照用非类产碱假单胞菌DNA为模板：阳性对照用已知类产碱假单胞菌的DNA（参见附录B）或含有待测基因序列的质粒为模板：空白对照共设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以等体积水代替样品），二是PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。8.3.5PCR扩增产物的电泳检测
用电泳缓冲液（0.5×TBE）制备2%琼脂糖凝胶，取5uLPCR扩增产物和1μL上样缓冲液混合，进行点样，DNAmarker（100bpDNAladder）做参照。3V/cm~5V/cm恒压电泳，电泳50min~60 min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。8.3.6PCR扩增结果判定
8.3.6.1对照结果
阳性对照：出现455bp的扩增条带，阴性对照：未出现特征条带。
空白对照：未出现特征条带。
-rKAONTKAca
8.3.6.2检测结果
SN/T4624.162016
对照实验结果正常，待测样品出现455bp扩增条带，则可判定该样品PCR扩增结果为阳性。对照实验结果正常，待测样品未出现455bp扩增条带，则可判定该样品PCR扩增结果为阴性。对照实验结果异常，本次待测样品的结果无效，应重新做实验，并排除污染因素。9结果报告
当形态学鉴定、生化鉴定、分了生物学检测结果符合时，报告检出类产碱假单胞菌当形态学鉴定、生化鉴定、分子生物学检测不符合时，建议重做：仍有不符合时，报告未检出类产碱假单胞菌
-KAoNIKAca
SN/T4624.16—2016
营养琼脂
A.1.1成分
熊糖（CH22On）
蛋白陈
磷酸氢二钾（K,HPO,）
硫酸镁（MgSO.7H,O)
抗坏血酸
蒸馏水
A.1.2制法
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
1000ml
将以上成分混合加热溶化，调节pH至7.27.4，120℃高压灭菌20
营养肉汤NB
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
A.2.2制法
将以上成分混合加热溶化后.校正pH值，分装烧瓶，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。A.3
革兰氏染色液
结晶紫染色液
A.3.1.1成分
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
A.3.1.2制法
将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合6
-KAoNrKAca
革兰氏碘液
碘化钾
蒸馏水
A.3.2.2制法
SN/T4624.16-—2016
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.3.3
沙黄复染液
A.3.3.1成分
95%乙醇
蒸馏水
将沙黄溶解于乙醇中，然后加人蒸馏水A.4
假单胞菌显色培养基
蛋白陈、酵母浸出物
蒸馅水
2制法
1000mL
将以上成分混合加热溶化，调节pH至7.5士0.2。5TE缓冲液（pH8.0）
A.5.1成分
1mol/LTris-盐酸(pH8.0)
500mmol/LEDTA(pH 8.0)
蒸馏水
A.5.2制法
分装后121℃高压灭菌15min。
SN/T4624.16—2016
50×TAE缓冲液（pH8.5）
NaEDTA·2HO
冰醋酸
0.05mol/LEDTA
2制法
在800mI.的去离子水中加人242gTris和37.2gNaEDTA·2H.O，充分搅拌溶解。加人57.1mL的醋酸，充分混勾。加去离了水定容至1L，调节pH至8.5，室温保存。8
（资料性附录）
类产碱假单胞菌基因序列（GenBankAB039439.1）SN/T4624.16-—2016
ccggcggcctgcacggtgtgggtgtctcggiggtcaatgccctctccaaggagctggtactgaccatccgccgtagcggtaagatctgggaacagacctatgtgcatggtgtgccgcaagcccccctgactgctgtcggggataccgacggtaccggcacgcaaatccacttcaagccctccgaagaaaccttcgccaacatccacttcagctgggacatcctggccaagcgtctgcgcgaactgtccttccteaactccggcgtggggattctgctgcgtgatgaacgcaecggcaaggaagagctgttcaagtacgagggcggcctgaaagccttcgttgagtacctgaacaccaacaagaccgtagtcaaccaggtattccacttcagigigcagcgtgaagaagacgglgltggtgtcgaagtcgccctgcagtggaacgacagtttcaacgagaacatcctctgcttcaccaacaacattccccagcgtgacggtggtactcacctggcgggcttccgctctgccctcacccgacacctgaacaactacatcgaagccgaaggtctggcgaagaagttcaaggtcgccaccaccggtgacgatgcccgtgaaggcctgactgcaattatctcggtcaaggtgccggacccgaaattcagctcgcagaccaaggataagctggtctccagcgaggtgaagaccgcggtcgagcaggagatgggcaagtactttgccgacttcctgctggaaaaccccaacgaagccaaggctgtggtcggcaagatgatcgatgcagcacgtgcccgtgaagcagcgcgtaaggcgcgtgagatgacccgccgcaagggggcgctggacatcgccgggctgcceggcaaactggccgac
SN/T4624.16-2016
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
入境环保用微生物菌剂检测方法第16部分：类产碱假单胞菌
SN/T4624.16—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010）68533533
网址spe.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880X12301/16印张1字数20千字2017年11月第一版2017年11月第一次印刷印数1—500
书号：155066·2-32279定价18.00元
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