SN/T 4624.13-2016.Methods for examination of import microbial blends in the environmental protection-Part 13 : Phanerochaete chrysos porium.
1范围
SN/T 4624.13规定了入境环保用微生物菌剂符合性检验黄孢原毛平革菌的形态学鉴定、PCR检测方法。
SN/T 4624.13适用于人境环保用微生物菌剂符合性检验黄孢原毛平革菌检测和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682。分析实验室用水规格和试验方法
3主要试剂和培养基
3.1 实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。
3.2 马铃薯葡萄糖琼脂:见附录A中A.1。
3.3 马铃薯葡萄糖肉汤:见A.2。
3.4 CTAB缓冲液:见A.3。
3.5 蛋白酶K。
3.6 Tris饱和酚。
3.7三氯甲烷。
3.8 异戊醇。
3.9 异丙醇。
3.10 TE缓冲液(pH8.0):见A.4。
4主要仪器和设备
4.1 电子天平(感量0.01 g)。
4.2恒 温培养箱:28°C±1 °C。
4.3 恒温振荡器:28°C±1 °C。
4.4恒 温水浴锅。
4.5台 式冷冻离心机(最高转速15 000 r/ min)。
4.6 PCR超净工作台。
4.7 PCR 扩增仪。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4624.13-—2016
入境环保用微生物菌剂检测方法第13部分：黄孢原毛平革菌
Methods for examination of import microbial blends in the environmentalprotectionPart 13:Phanerochaete chrysosporium2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
入境环保用微生物菌剂检测方法第13部分：黄孢原毛平革菌
SV/T4624.13-2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：(010)68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16
2017年11月第一版
印张0.75
字数18千字
2017年11月第一次印刷
印数1-500
书号：155066·232287
定价16.00元
SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分：第1部分：地衣芽孢杆菌；
第2部分：短小芽孢杆菌：
第3部分：巨大芽孢杆菌；
第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌：第5部分：β型溶血性链球菌；
第6部分：金黄色葡萄球菌；
第7部分：沙门氏菌；
第8部分：志贺氏菌；
第9部分：致泻大肠埃希氏菌；
第10部分：淡紫拟青霉；
第11部分：雅致小克银汉霉；
第12部分：哈茨木霉；
第13部分：黄孢原毛平革菌；
第14部分：焦曲霉：
第15部分：解淀粉芽孢杆菌：
第16部分：类产碱假单胞菌；
第17部分：恶臭假单胞菌。
本部分为SN/T4624的第13部分
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本部分主要起草人：李俊环、李妹、付海滨、吴渺渺、王芳、贾金生、李成铺SN/T 4624.13—2016
入境环保用微生物菌剂检测方法第13部分：黄孢原毛平革菌
SN/T-4624的本部分规定了人境环PCR检测方法。
SN/T4624.13—2016
青孢原毛平革菌的形态学鉴定、本部分适用于入境环保用微生物菌剂符合性检验黄孢抱原毛平革菌检测和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件·仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3主要试剂和培养基
实验用水应符合GB/T6682中
马铃薯葡萄糖琼脂：见附录A中A1马铃薯葡萄糖肉汤：见A.2。
CTAB缓冲液：见A.3。
蛋白酶K。
Tris饱和酚。
三氯甲烷。
异戊醇。
异丙醇。
TE缓冲液（pH8.0）：见A.4。
3.1110×PCR缓冲液200mmol/LTris-HCl(pH8.4），200mmol/L氯化钾（KCl)15mmol/L氯化镁(MgCl,)。
dNTP:dATP,dTTP,dGTP,dCTP
TBE：54gTris，27.5g硼酸，800mL去离子水溶解，20mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）定容至1LTaqDNA聚合酶。
真菌基因组DNA提取试剂盒。
50XTAE缓冲液（pH8.5）：见A.5。琼脂糖。
溴化乙锭。
DNA分子量标记：100bpDNAladder。液氮。
HTIKAONr KAca
SN/T4624.13—2016
4主要仪器和设备
4.1电子天平（感量0.01g）。
2恒温培养箱：28℃±1℃。
恒温振荡器：28℃±1℃。
恒温水浴锅。
5台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。PCR超净工作台。
PCR扩增仪。
微量移液器和灭菌吸头：10μl.、20μL、200μL、1000μL。高压灭菌锅。
电泳仪装置。
核酸/蛋白分析仪。
凝胶成像系统。
陶瓷研钵。
无菌培养m：直径90mm。
灭菌三角烧瓶：500mL、250ml.。接种棒、镍铬丝。
Eppendorf管和PCR反应管。
显微镜：物镜10×~100×。
5样品制备
5.1无菌操作取1g（mL）样品加人到100mL无菌水中混匀，移取1环菌连续划线接种5个PDA平板，28℃土1℃培养5d，观察琼脂平板上的菌落特征。取样过程中，在样品旁边放置1个PDA平板作为空白对照。
5.2挑取单菌落划线接种在PDA平板上，28℃士1℃条件下培养5d～10d，得到纯化的菌株，进行形态学鉴定。
5.3挑取符合形态学特征单菌落转接马铃薯葡葡糖液体培养基中，28℃土1℃条件下180r/min振荡培养5d~10d，获得菌丝体。
形态学鉴定
6.1培养性状
黄孢原毛平革菌在PDA平板上菌落5d长满平血.白色，毡状，致密。6.2形态特征
取已纯化的菌株镜检。菌丝多隔，多分枝。分生孢子梗简单或总状分枝顶端产生芽生分生孢子，分生孢子近球形、椭圆形、倒梨形，无色，稍粗糙，（7.5μm~10μm）×（4um-~6.5um）。有厚垣孢子。2
-TKAoNIKAca
7分子生物学检测
7.1模板DNA的提取
7.1.1直接提取法
SN/T4624.13—2016
取5.3中菌液过滤抽干收集菌丝，取0.1g菌丝于液氮中研磨至粉末状，收集粉末于1.5mL离心管中，加入500μLCTAB缓冲液（其中含0.1g蛋白酶K）混匀.65℃水浴1h；13000r/min离心5min~10min：保留上清液：加500ulTris饱和酚：三氯甲烷：异戊醇（体积为25：24：1）混匀.13000r/min离心5min~10min，保留上清液：加500μL三氯甲烷：异戊醇（体积为24：1）混勾，13000r/min离心5min～10min，保留上清液；加入1mL异内醇混勾，-70℃下放置1h，或一20℃过夜；13000r/min离心30min，可见DNA沉淀；70%乙醇冲洗DNA沉淀，室温干燥用50uL~100LTE溶解DNA，置于一20℃下保存备用。Www.bzxZ.net
7.1.2试剂盒法
使用商品化的真菌基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。选择商品化试剂盒的原则是所提取的DNA质量好并且提取率高。7.1.3DNA质量检测
将提取的DNA用1.0%的琼脂糖凝胶（含溴化乙锭或等效染料)进行完整性检测。采用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。DNA浓度计算公式：DNA浓度（ng/μL）=OD26oX50X核酸稀释倍数若OD260/OD28在1.8～2.0之间，表明DNA纯度较好，可用于PCR检测。7.2PCR检测
引物序列
引物序列及扩增片段长度见表1。表1引物序列及扩增片段长度
PCR扩增
常规PCR
7.2.2反应体系
PCR反应体系见表2。
试剂名称
引物来源
Pchr-F
10×PCR缓冲液（含Mg+）
dNTP(2.5 mmol/L)
引物序列（5'-3'）
GAGCATCCTCTGATGCTTT
TCCTCCGCTTATTGATATGC
表2PCR反应体系
PCR反应体系
扩增片段大小
-TTKAONTKAca
SN/T4624.13—2016
试剂名称
TagDVA聚合酶（5U/μL）
正向引物（25pmol/L）
反向引物（25pmol/μL）
DNA模板
表2（续）
PCR反应体系
补至25μ
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整7.2.3PCR反应条件
94℃预变性4min：94℃变性30s，57℃退火30s.72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸7min。
使用不同PCR仪，可对参数作适
当调整
空白对照、阴性对照和阳性对照设置7.2.4
阴性对照：非黄孢原毛平革菌DNA为模板阳性对照：已知黄孢原毛平革菌的DNA（参见附录B）或含有待测基因序列的质粒为模板：空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空自对照（以等体积水代替样品），二是PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）7.2.5PCR扩增产物的电泳检测
用电泳缓冲液（0.5×TBE）制备1%琼脂糖凝胶，取5μI.PCR扩增产物，和1uL上样缓冲液混合：进行点样，DNAmarker(10obpDNAladder)做参照
60min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存7.2.6PCR扩增结果判定
对照结果
阴性对照、阳性对照、空白对照结果应满足下列要求：阳性对照：出现500bp的扩增条带；阴性对照：未出现特征条带；
空白对照：未出现特征条带。
否则，检测视为无效。
检测结果
在阴性对照、阳性对照、空白对照均正常的情况下：一5V/cm恒压电泳，电泳50min~
待测样品出现500bp扩增条带，可判定该样品PCR扩增结果为阳性；待测样品未出现500bp扩增条带，可判定该样品PCR扩增结果为阴性。对照实验结果异常，本次待测样品的结果无效，应重新做实验，并排除污染因素。4
rrKAoNikAca
8结果报告
当形态学试验，PCR检测试验结果均符合时报告检出黄孢原毛平革菌。SN/T4624.13—2016
当形态学试验、实时荧光PCR检测试验出现不符合结果时，建议重做。仍不符合时，报告未检出黄孢原毛平革菌
-KAoNiKAca
SN/T4624.13—2016
马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（PDA）A.1
马铃薯提取液
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
取去皮马铃薯300g.切成小块，加1000mL蒸馏水，煮沸10min~20min1，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000mL
A.1.2其他成分
葡萄糖
A.1.3制法
将以上两组成分混合加热溶化，分装后·pH自然，121℃高压灭菌20min。A.2
马铃薯-葡萄糖液体培养基
马铃薯提取液
取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000mL煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000mL。A.2.2其他成分
葡萄糖
3制法
将以上两组成分混合加热溶化，pH自然，121℃高压灭菌15minCTAB缓冲液
A.3.1成分
氯化钠（NaCI)
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)
1 mol/L Tris HCI(pH8.0)
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
去离子水
A.3.2制法
将以上成分混合溶化，用去离子水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min6
TE缓冲液
Tris碱
NazEDTA·2H,O
去离子水
A.4.2制法
1000ml
SN/T4624.13—2016
在800mL去离子水中，依次加入以上成分，调节pH至8.0.用去离子水定容到1L，分装后121℃高压灭菌15min。
50×TAE缓冲液
冰醋酸
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
去离子水
A.5.2制法
将以上成分混合溶化，用去离子水定容至1000mL，121℃高压灭菌15minaSN/T 4624.13—2016
acgatgtcta
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SN/T4624.13-2016
附录B
（资料性附录）
黄孢原毛平革菌基因序列（GenBankJx501294）gcggrgastk
cteggggcat
cggtagaaga
aacgcttcag
cggatctett
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gagcalgcct
cttggacttg
tgagtgtaac
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cgtggtcgtg
ttgacatctg
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