SN/T 4624.12-2016.Methods for examination of import microbial blends in the environmental protection-Part 12 : Trichoderma harzianum.
1范围
SN/T 4624.12规定了入境环保用微生物菌剂符合性检验哈茨木霉的形态学鉴定、实时荧光PCR检测方法。
SN/T 4624.12适用于人境环保用微生物菌剂符合性检验哈茨木霉检测和鉴定
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件,凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3主要试剂和培养基
3.1实验 用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。
3.2 马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(PDA):见附录A中A.1。
3.3 马铃薯-葡萄糖液体培养基:见A.2。
3.4 CTAB缓冲液:见A.3。
3.5 蛋白酶K。
3.6 Tris 饱和苯酚。
3.7三氯甲 烷。
3.8 异戊醇。
4主要设备和材料.
4.1电子天平(感量0.01 g)。
4.2恒温培养箱:25℃±1℃。
4.3 恒温振荡器:25℃±1℃。
4.4恒 温水浴锅。
4.5 台式冷冻离心机(最高转速15 000 r/min)。
4.6 PCR 超净工作台。
4.7实时荧光PCR仪。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4624.12—2016
入境环保用微生物菌剂检测方法第12部分：哈茨木霉
Methods for examination of import microbial blends in the environmentalprotection-Part 12:Trichoderma harzianum2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
入境环保用微生物菌剂检测方法第12部分：哈茨木霉
SN/T4624.12—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010)68533533
网址spc.nct.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×1230
2017年11月第一版
字数18千字
2017年11月第一次印刷
印数1-500
书号：155066：2-32286
定价16.00
SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分：第1部分：地衣芽孢杆菌；
第2部分：短小芽孢杆菌；
第3部分：巨大芽孢杆菌；
第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌；第5部分：β型溶血性链球菌；
第6部分：金黄色葡萄球菌；
第7部分：沙门氏菌；
第8部分：志贺氏菌；
第9部分：致泻大肠埃希氏菌；
第10部分：淡紫拟青霉；
第11部分：雅致小克银汉霉；
第12部分：哈茨木霉；
第13部分：黄孢原毛平革菌；
第14部分：焦曲霉；
第15部分：解淀粉芽孢杆菌；
第16部分：类产碱假单胞菌：
一第17部分：恶臭假单胞菌。
本部分为SN/T4624的第12部分
本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4624.122016
本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、吉林出入境检验检疫局。本部分主要起草人：张莹、刘阳、裴程程、张震宇、吴洁元、杨曼慧、王芳1范围
入境环保用微生物菌剂检测方法第12部分：哈茨木霉
SN/T 4624.12—2016
SN/T4624的本部分规定了人境环保用微生物菌剂符合性检验哈茨木霉的形态学鉴定、实时荧光PCR检测方法。
本部分适用于人境环保用微生物菌剂符合性检验哈茨木霉检测和鉴定2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3
主要试剂和培养基
实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（PDA)：见附录A中A.马铃薯-葡萄糖液体培养基：见A.2CTAB缓冲液：见A.3
蛋白酶K。
Tris 饱和苯酚。
三氯甲烷。
异戊醇。
异丙醇。
TE缓冲液(pH8.0)：见A.4。
70%乙醇。
溴化乙锭。
DNA分子量标记：1000bpDNAladder。3.14
琼脂糖。
50XTAE缓冲液（pH8.5)：见A.5。RealMasterMix(2.5X，含ROX内参染料）。20xProbe Enhancer Solutione
液氮。
4主要设备和材料
4.1电子天平（感量0.01g）。
4.2恒温培养箱：25℃土1℃。
-iKAoNiKAca
SN/T4624.12—2016
4.3恒温振荡器：25℃±1℃。
恒温水浴锅。
台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。5PCR超净工作台。
实时荧光PCR仪
微量移液器和灭菌吸头：10mL、20uL、200uL、1000μl.。高压灭菌锅。
电泳仪装置
核酸/蛋白分析仪。
凝胶成像系统。
陶瓷研钵。
无菌培养m：直径90mm。
5灭菌三角烧瓶：500mL，250mL。4.15
6接种棒、镍铬丝。
Eppendorf管和PCR反应管。
显微镜：物镜10×～100×。
5样品制备
5.1以无菌操作取1g（mL）样品加人到100mL无菌水中混匀，移取1环菌液连续划线接种5个PDA平板，25℃土1℃条件下培养3d~5d取样过程中，在样品芳边放置1个PDA平板作为空白对照。5.2挑取单菌落划线接种在PDA平板上，25℃士1℃条件下培养3d~5d，得到纯化的菌株，进行形态学鉴定。
5.3挑取符合形态学特征单菌落转入马铃薯-葡萄糖液体培养基中，25℃士1℃条件下180r/min振荡培养5d～7d,获得菌丝体
形态学鉴定
6.1培养性状
哈茨木霉在PDA平板上生长迅速，25℃接种PDA培养3d，菌落生长直径可达8cm，平铺，气生菌丝茂盛，大量菌丝聚集在一起呈白色毛絮状，背面产生浅黄绿色素。产孢区可以布满整个平板，在PDA培养基上孢子常呈同心圆状分布，且孢子聚集在一起形成产孢，分生孢子团浅黄绿色。产孢簇为颗粒状或粉状，颜色起初水绿色，后迅速转为黑绿色6.2形态特征
菌丝透明，菌丝壁光滑。分生孢子梗纤细透明，壁光滑，直或者波曲，宽2.0um～5.0m，长度多数较短，15um100μm，分枝多；分生孢子梗复杂分枝，下部分枝长，上部分枝较短，初级分枝几乎呈直角，或稍微向顶方向弯曲，常2个～~3个旋涡状排列，向基部逐渐变长，二次分枝复杂，2个～4个呈旋涡状排列。瓶梗烧瓶形，多3个~5个簇生，未端瓶梗细长，（5um～13um）×（2.5um~3.8μm）。分生孢子近球形，浅绿色，光滑或稍粗糙，2.1um~3.3μm。2
TT'KAONIKAca
7分子生物学检测
模板DNA的提取
直接提取法
SN/T4624.12—2016
取5.3中菌液过滤抽干收集菌丝，取0.1g菌丝于液氮中研磨至粉末状，置于1.5mL离心管，加入500μlCTAB缓冲液（其中含0.1g蛋白酶K）混匀，65℃水浴1h13000r/min离心5min~10min，保留上清液：加500μLTris饱和酚：三氯甲烷：异戊醇（体积为25：24：1）混勾，13000r/min离心5min~10min，保留上清液；加500uL三氯甲烷：异戊醇（体积为24：1）混匀，13000r/min离心5min~10min，保留上清液：加入1ml异丙醇混勺，一70℃下放置1h，或一20℃过夜；13000r/min离心30min，可见DNA沉淀；70%乙醇冲洗DNA沉淀，室温干燥；用50μL～100μLTE溶解DNA，置于一20℃下保存备用。
7.1.2试剂盒法
使用商品化的真菌基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。选择商品化试剂盒的原则是所提取的DNA质量好并且得率高。7.1.3DNA质量检测
将提取的DNA用1.0%含溴化乙锭（或等效染料)的琼脂糖凝胶进行完整性检测。采用分光光度法测定DNA的浓度和纯度，DNA浓度计算公式：DNA浓度（ng/μL）=OD2caX50X核酸稀释倍数若OD26/OD2a在1.8~2.0之间，表明DNA纯度较好，可用于实时荧光PCR检测。7.2实时荧光PCR鉴定
7.2.1引物和探针序列
引物和探针序列见表1。其中探针的5端标记FAM,3'端标记TAMRA。表1引物和探针序列
哈茨木霉
引物序列
5'-GATGATCCGAACAAGCGATTG-3
5'-GTGAATCTCGCAGTGGGTGTAC-3
实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表2。
探针序列
5'FAM-AGACCAAGACGAACCCGACAACCCA-TAMRA3实时荧光PCR反应体系
试剂名称
2.5XReal Master Mix
正向引物（20pmol/μL）
实时荧光PCR反应体系
-KAoNrKAca
SN/T4624.12-2016
试剂名称
反向引物（20pmol/μL）
探针（3pmol/μL）
20X Probe Enhancer solution
DNA模板
表2（续）
实时荧光PCR反应体系
补充至25
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整7.2.3实时荧光PCR反应参数
实时荧光PCR反应参数见表3。
实时荧光PCR反应参数
注：使用不同实时荧光PCR仪，可对参数作适当调整
7.2.4空白对照、阴性对照和阳性对照设置阴性对照：非哈茨木霉DNA为模板；时间
起始模板变性
PCR循环中模板变性
阳性对照：已知哈茨木需的DNA（参见附录B)或含有待测基因序列的质粒为模板；空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取穿白对照（以等体积水代替样品），二是实时荧光PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）7.2.5
实时荧光PCR扩增结果判定
7.2.5.1对照结果
阴性对照、阳性对照、空白对照结果应满足下列要求：阴性对照：无扩增曲线，Cl值含40.0：阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct值应<30.0；空白对照：无扩增曲线，Ct值≥40.0。否则，检测视为无效。
7.2.5.2结果判定
在阴性对照、阳性对照、空白对照均正常的情况下：-Ct值≥40.0，可判定该样品实时荧光PCR结果为阴性；4
riiKAoNirKAca
一Ct值≤35.0，可判定该样品实时荧光PCR结果为阳性；SN/T4624.12—2016
—35.0当形态学试验、实时荧光PCR检测试验结果均符合时，报告检出哈茨木霉。当形态学试验、实时荧光PCR检测试验出现不符合结果时，建议重做。仍不符合时，报告未检出哈茨木霉。
iiKAoNiKAca
SN/T4624.12—2016
马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（PDA）马铃薯提取液
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
取去皮马铃薯300g，切成小块，加1000mL蒸馏水，煮沸10min~20min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000ml。
其他成分
葡萄糖
A.1.3制法
将以上两组成分混合加热溶化，分装后·pH自然，121℃高压灭菌20min。A.2
马铃薯-葡萄糖液体培养基
马铃薯提取液
取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000mL.。
其他成分
葡萄糖
将以上两组成分混合加热溶化，pH自然，121℃高压灭菌15min。CTAB缓冲液
A3.1成分
氯化钠（VaCI）
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)
0.5mo1/LEDTA(pH8.0)
去离子水
SN/T4624.12-—2016
将以上成分混合溶化，用去离子水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min。A.4
TE缓冲液
Tris碱
NazEDTA·2H,0
去离子水
1000ml
在800mL去离子水中，依次加人以上成分，调节pH至8.0，用去离子水定容到1L，分装后121℃高压灭菌15min。
50×TAE缓冲液
冰醋酸
0.5mol/LEDTA(pH值8.0)
去离子水
2制法
800mlL
将以上成分混合溶化.用去离子水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min。SN/T 4624.12—2016
1 ttgcatgggtwwW.bzxz.Net
cacttcaace
附录B
（资料性附录）
哈茨木霉基因序列（GenBankKF501571.1）catacctgag acgtgcgtga
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agaccctaag
gaagtctctc
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cctcatgcta
cacttggtga
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accaggttct
attcgagacc
gitcacagga
catagattgg
gggagggatt gatcgctggt
gagacggccatgatgctgac
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