SN/T 1919-2016
基本信息
标准号： SN/T 1919-2016
中文名称：猪细小病毒病检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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下载大小：4510655
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 1919-2016.Quarantine protocol for porcine parvovirus infection.
1范围
SN/T 1919规定了猪细小病毒病临床诊断.病毒分离、血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验.胶体金试验、聚合酶链式反应、荧光聚合酶链式反应的技术要求。
SN/T 1919适用于猪细小病毒病的诊断、进出口检疫及流行病学调查等。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的引用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T 18088出人境动物检疫采样
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
PPV :猪细小病毒(Porcine Parvovirus)
PBS:磷酸盐缓冲溶液(Phosphate Buffer Saline)
HA:血凝试验( Hemagglutination)
HI:血凝抑制试验( Hemagglutination Inhibition)
HAU:血凝单位( Hemagglutination Unit)
OD值:光密度值(Optical Density)
ELISA :酶联免疫吸附试验( Enzyme -linked Immunosorbent Assay)
PCR :聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)
荧光PCR :荧光聚合酶链式反应( Real-time-PCR)
4试剂
4.1猪细小病毒抗原 、核酸、阳性血清、阴性血清。
4.2敏感细胞系:PK-15 或ST细胞。
4.3细胞生长 液、维持液、胰酶、Hanks液。
4.4青霉素 、链霉素。
1范围
SN/T 1919规定了猪细小病毒病临床诊断.病毒分离、血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验.胶体金试验、聚合酶链式反应、荧光聚合酶链式反应的技术要求。
SN/T 1919适用于猪细小病毒病的诊断、进出口检疫及流行病学调查等。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的引用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T 18088出人境动物检疫采样
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
PPV :猪细小病毒(Porcine Parvovirus)
PBS:磷酸盐缓冲溶液(Phosphate Buffer Saline)
HA:血凝试验( Hemagglutination)
HI:血凝抑制试验( Hemagglutination Inhibition)
HAU:血凝单位( Hemagglutination Unit)
OD值:光密度值(Optical Density)
ELISA :酶联免疫吸附试验( Enzyme -linked Immunosorbent Assay)
PCR :聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)
荧光PCR :荧光聚合酶链式反应( Real-time-PCR)
4试剂
4.1猪细小病毒抗原 、核酸、阳性血清、阴性血清。
4.2敏感细胞系:PK-15 或ST细胞。
4.3细胞生长 液、维持液、胰酶、Hanks液。
4.4青霉素 、链霉素。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1919-—2016
代替SN/T1874—2007、SN/T1919—2007猪细小病毒病检疫技术规范
Quarantine protocol for porcine parvovirus infection2016-06-28发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局bzxz.net
2017-02-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T1919—2016
本标准代替SN/T1874—2007《猪细小病毒病聚合酶链反应操作规程》和SN/T1919—2007《猪细小病毒病红细胞凝集抑制试验操作规程》。本标准与SN/T1874—2007和SN/T1919—2007相比，主要技术差异如下：增加了临床诊断和病毒分离方法；-增加了酶联免疫吸附试验；
增加了胶体金试验：
一增加了荧光聚合酶链式反应。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国广西出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：鱼海琼、蔡先全、程珏益、罗长保、赵吟、田纯见、盘宝进、邓艳、柏建山。本标准所代替标准历次版本发布情况为：-SN/T1874—2007;
-SN/T1919—2007。
iiKAoNniKAca
HiiKAoNiKAca
1范围
猪细小病毒病检疫技术规范
SN/T1919—2016
本标准规定了猪细小病毒病临床诊断、病毒分离、血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验、胶体金试验、聚合酶链式反应，荧光聚合酶链式反应的技术要求。本标准适用于猪细小病毒病的诊断、进出口检疫及流行病学调查等，2规范性引用文件
下列文件对于本文件的引用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T18088
3缩略语
出人境动物检疫采样
下列缩略语适用于本文件。
PPV：猪细小病毒（PorcineParvovirus）PBS磷酸盐缓冲溶液（PhosphateBufferSaline）HA：血凝试验（Hemagglutination）HI：血凝抑制试验（HemagglutinationInhibition）HAU：血凝单位（HemagglutinationUnit）OD值：光密度值（OpticalDensity）ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedImmunosorbentAssay）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）荧光-PCR：荧光聚合酶链式反应（Real-time-PCR）4试剂
猪细小病毒抗原、核酸、阳性血清、阴性血清。敏感细胞系：PK-15或ST细胞。
细胞生长液、维持液、胰酶、Hanks液。青霉素、链霉素。
磷酸盐缓冲溶液。
红细胞悬液。
RNA酶。
DNA抽提试剂盒。
蛋白酶K。
TaqDNA聚合酶。
100 bp DNA Marker.
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SN/T1919—2016
dNTP混合物及相应10X缓冲液，
设备与材料
5.1CO，培养箱。
5.2酶标仪。
396孔V型板。
5.4生物安全柜。
5显微镜。
5.6微量移液器。
高速冷冻离心机。
3PCR仪。
9水平凝胶电泳槽。
电泳仪。
凝胶成像系统。
荧光定量PCR仪。
临床诊断
疫病概况
猪细小病毒病是由PPV引起的一种猪紧殖障碍病，该病主要表现为胚胎和胎儿的感染和死亡，特别是初产母猪发生死胎、畸形胎和木乃伊胎，但母猪本身无明显的症状。其病原特征、流行病学情况参见A.1。
2病理变化
猪细小病毒病可以引起母猪子宫内膜、胎盘病理变化。感染的胎儿表现不同程度的发育障碍和生长不良，部检异常变化，参见A.2。3与其他易混淆疾病的鉴别
猪细小病毒病通常需要和猪繁殖与呼吸综合征、猪衣原体病、猪伪狂犬病感染猪群进行鉴别诊断，主要区别参见A.3。
6.4结果判定
根据该病的临床症状、病理变化和流行病学作出初步诊断，进一步确诊应根据GB/T18088采集样品进行实验室检测。
实验室检测
病毒分离
7.1.1细胞培养
用细胞瓶或细胞板培养PK-15细胞或ST细胞单层，可采用原代细胞培养或传代细胞培养，培养过程参见B.1.B.2，推荐使用传代细胞。2
HiiKAoNi KAca
7.1.2待检病料的接种
病料处理
SN/T1919—2016
无菌采取初产母猪的流产胎儿木乃伊胎的实质器官如心，肝，牌，肺，肾，去掉表面的筋膜，剪碎，加人Hanks液，用研钵研碎，制成1：5～1：10的悬液，加人1%青、链霉素溶液（10000U/mL），4℃过夜处理。冻融3次，2500r/min离心10min，除去细胞碎片，上清液用直径为0.22μm的一次性滤器过滤除菌，滤液置一20℃保存备用。7.1.2.2病料接种
胰酶消化PK-15或ST细胞后，同时按照1：10比例加人已处理好的病料，或者待次日倾倒瓶内的营养液，加人已处理好的病料，37℃吸附1h，其间每隔15min播摇一次。加人细胞维持液，37℃培养3d～6d，每天观察是否出现细胞病变，同时培养正常细胞作为对照。7.1.3结果判定
病料接种细胞后，若3d一6d内，细胞发生圆缩和溶解，出现弥慢性颗粒样变化，直至细胞破碎。细小病毒可在核内形成包涵体，稀疏地分布在核内，则可认为细胞出现病变，可初判为疑似病毒，推荐进一步应用其他病原检测方法进行证实。否则，需盲传三代，仍无病变可判为病毒分离阴性，但推荐进一步应用其他病原检测试验证实。7.2血凝抑制试验
7.2.1方法原理
猪细小病毒抗原能凝集豚鼠的红细胞，若被检血清中含有猪细小病毒抗体，则该抗体和抗原结合形成抗原抗体复合物，从而抑制抗原对豚鼠红细胞的凝集作用，红细胞凝集抑制的程度和抗体的量成正比。
7.2.2材料准备
无菌采集被检血清5mL，自然凝固后无菌分离血清，分装，冷藏保存。抗凝采集健康豚鼠血液，使用PBS(见C.1)制备红细胞悬液（见C.2)。7.2.3HA试验
抗原稀释
取96孔V型板，按2倍稀释度依次稀释抗原，即1：2、1：4.1：1024。每孔加稀释液25μL。
于A1孔加抗原25μL，吹打均匀后移取25μL至第A2孔，吹打均勾再移取25μL至A3孔，依次稀释，最后A10孔弃掉25μL。
每孔加稀释液25μL，振荡15s。2添加红细胞悬液
吸取7.2.2中制备好的0.5%红细胞悬液，加至稀释好的抗原孔，每孔加25μL，振荡30s，置室温1h判定结果并作记录（见表C.1)。3
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SN/T1919—2016
红细胞凝集程度的判定
红细胞均匀平铺于孔内.100%凝集，判为“+十十+”；红细胞均匀平铺于孔内，但边缘有下滑皱缩，75%凝集，判为“十十十”；红细胞聚集于孔底，四周有小凝集块，50%凝集，判为*十十”；红细胞聚集于孔底，边缘不整齐或有小凝集，25%凝集，判为”十”；红细胞聚集于孔底，边缘整齐光滑，稀释液清亮，无凝集，判为*一”7.2.3.4HA效价计算
能使孔内红细胞完全凝集的抗原最高稀释倍数为该抗原的HA效价.代表1个HAU。根据表C.1结果，该抗原的HA效价为1：128.即1个HAU为1：128。7.2.4HI试验
7.2.4.1血清稀释
取96孔V型板，按2倍稀释度依次稀释血清.即1：2、1：4..1：1024。每孔加稀释液25μL。
A1孔加被检血清25μL，吹打均勾后移取25μL至第A2孔.吹打均勾再移取25μL至A3孔，依次稀释.最后A10孔弃掉25μL
阳性血清同被检血清一样稀释(见表C.2)。7.2.4.2添加抗原
每孔加4HAU抗原25μL，振荡15s.置4℃作用6h或室温作用1h，3添加红细胞悬液
每孔加0.5%红细胞悬液25μL.振荡30s，置室温作用1h。7.2.4.4对照
设已知阳性血清、阴性血清、抗原对照、红细胞对照，加样见表C.3，设抗原回归，加样见表C.4。7.2.5结果判定
7.2.5.1对照
在抗原、红细胞、阴、阳性血清及抗原回归对照均成立的情况下才可进行结果判定。抗原对照孔和阴性血清对照孔应出现凝集现象，阳性血清对照应出现凝集抑制现象。7.2.5.2凝集抑制价
红细胞凝集程度的判定同7.2.3.3。能使红细胞凝集完全抑制的最高血清稀释倍数为其HI效价，表C.2中被检血清HI效价为1：32。7.2.5.3结果判定
不出现凝集抑制现象的，可判为血凝抗体阴性。出现凝集抑制现象的，记录每份样品的HI效价。根据检疫要求给定的阴，阳性临界滴度值判断被检血清的HI效价是否为血避凝抑制试验结果阳性或血凝抑制试验结果阴性。
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7.3酶联免疫吸附试验
7.3.1方法原理
SN/T1919—2016
试剂盒微孔板上包被有PPV抗原，将被检血清加至微孔板上，作用一定时间，若样本中存在PPV抗体，则样本中针对病毒的特异性抗体与微孔板上的抗原结合。待加人过氧化物酶标记的特异性单克隆抗体并作用一段时间后，该单克隆抗体不能和已包被在板上的抗原结合，洗板，加人能使过氧化物酶显色的底物溶液，在酶标仪一定波长下，阳性样品孔将没有颜色反应，反之则有颜色反应，样品中抗体的量和酶标孔中颜色变化成反比。7.3.2检测步骤
7.3.2.1材料准备
所有试剂需提前从冰箱取出.恢复至室温。不同试剂盒依据各自说明书进行相应加样和结果判定步骤。
7.3.2.2加样
按试剂盒要求比例稀释被检血清及阴、阳性对照血清，每孔加人100μL，阴、阳性对照加双孔，被检血清建议加双孔，37℃作用30min，7.3.2.3加酶标记的单克隆抗体
计算好试验所需酶标物的体积，用相应的稀释液按比例要求稀释酶标记的单克隆抗体浓缩液，现配现用，每孔加50μL，轻拍板，使孔内液体混匀，37℃作用30min。7.3.2.4洗板
用蒸馏水按比例稀释PBS浓缩液至1×PBS洗液，甩去孔内液体，每孔加300μL洗液，轻拍板，甩去洗液，并在洁净的吸水纸上轻拍干，如此重复洗4次。7.3.2.5显色
计算好试验所需底物的体积.用相应的缓冲液配制新鲜的底物溶液.每孔加100μL，室温下避光显色10min。
7.3.2.6终止
每孔加入100μL终止液
读取OD值
在规定波长条件下读取每孔OD值。7.3.2.8结果计算
阴性对照OD值一样品OD值
阴性对照OD值一阳性对照OD值×100%计算样品的阻断率：
试验有效性
当阳性对照OD值/阴性对照OD值>4时，结果有效，可进行以下判定。5
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SN/T1919—2016
7.3.2.10结果判定
根据7.3.2.8计算结果，若阻断率>30%，判定为猪细小病毒ELISA抗体阳性，若阻断率<25%，判定为猪细小病毒ELISA抗体阴性。若阻断率在25%～30%之间，则认为可疑，需再次进行检测。7.4胶体金试验
7.4.1方法原理
检测抗原/抗体的检测卡检测线区（T线）位置封固了猪细小病毒单克隆抗体/抗原（参见D.1），对照线区（C线）位置及T线位置均封固了显色成分，当加人到加样孔的被检样品含有猪细小病毒抗原/抗体时，T线位置发生抗原抗体反应，位于显示窗口的T线和C线都会出现颜色反应。否则，仅C线位置出现颜色反应。
7.4.2操作步骤
在检测卡上加2滴（约100μL）待检样品至检测卡样孔内。将检测卡平放于桌面上，室温静置5min~20min
7.4.3结果判定
7.4.3.1有效性判定
检测窗口区，检测线区（T线）及对照线区（C线）均有紫红色线出现或检测线区（T线）无紫红色线出现但对照线区（C线）有紫红色线出现，视为试验有效，反之则试验无效，参见图D.1。7.4.3.2阴阳性判定
阳性样品的检测窗口区，检测线区（T线）及对照线区（C线）同时出现紫红色线。弱阳性样品的检测窗口区，检测线区（T线）及对照线区（C线）同时出现紫红色线，但检测线区（T）出现的颜色浅。
阴性检测窗口区，只有对照线区（C线）出现一条紫红色线，对照线区（C线）无紫红色线7.5聚合酶链式反应
7.5.1病毒株的复壮
经胰酶消化PK-15或ST细胞，同步接种PPV，待70%细胞病变后终止培养，冻融3次以上备用。7.5.2样品的前处理
7.5.2.1组织样品
取可疑猪只组织器官、死胎等1g，研磨，加人4mL的样品裂解液悬浮，冻融3次.5000r/min离心5min，取上清液备用。
或将组织磨碎后，加人4mL含10%小牛血清的Hanks液，冻融3次，5000r/min离心5min，取上清液，按1：10比例接种PK-15细胞，37℃培养3d～6d，待细胞70%以上病变后终止培养，不出现病变的需要盲传三代，培养物冻融3次备用。7.5.2.2公猪精液
采集2mL公猪精液，冻融3次备用。6
7.5.3病毒核酸提取
SN/T1919—2016
取经7.5.2处理的被检样品、阳性对照、阴性对照各200μL于1.5mL离心管，加人样品裂解液500μL，混匀，加人20g/L蛋白酶K6μL，56℃水浴30min。加人10mg/mLRNA酶，37℃作用30min，待样品冷却至室温，加人等体积酚，混勾，14000r/min离心5min，取上清液，用等体积的酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1）混合液抽提1次，抽提后用等体积的异丙醇沉淀DNA，室温放置10min，14000r/min离心5min，70%乙醇洗涤1次，晾干，取30μLDEPC水溶解DNA，贮存于一20C或立即用于PCR扩增。或推荐选择方便快捷的商品化DNA抽提试剂盒提取病毒DNA。7.5.4扩增反应
7.5.4.1引物
上游引物：5-CAGAATCAGCAACCTCAC；下游引物：5-TGGTCTCCTTCTGTGGTAGG-3”。7.5.4.2PCR反应体系
PCR反应体系参见E.1。分别设立阳性对照、阴性对照及空白对照。7.5.4.3PCR反应程序
第一步：95℃预变性3min；
第二步：94℃30s58C30s72C1min，共35个循环72C延伸10min。7.5.4.4PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测配制1.5%含荧光染料琼脂糖凝胶，取6μL扩增产物，加1μL上样缓冲液混匀后点样，在另一加样孔同时加DNA分子量标准点样。电压大小根据电泳槽长度确定，一般控制在3V/cm～5V/cm，电泳后，用凝胶成像分析系统观察拍照，记录检测结果。7.5.5结果判定
7.5.5.1有效性判定
阳性对照扩增产物电泳后仅在445bP处出现特异性条带，DNA分子量标准条带清楚，阴性对照和空白对照应无该特异性条带，可认为试验有效，否则无效。7.5.5.2结果判定
在试验有效的前提下，被检样品PCR产物经电泳后仅在445bp处出现特异性扩增条带者，可判为PPV阳性。必要时可取PCR扩增产物进行测序验证，测序结果与已公开发表的PPV特异性片段序列（参见E2进行比对。
在试验有效的前提下，被检样品PCR产物经电泳后无特异性条带的判为阴性。7.6实时荧光聚合酶链式反应
7.6.1病毒复壮
按7.5.1方法复壮病毒。
SN/T1919—2016
7.6.2样品处理
按7.5.2方法采集和处理样品。
7.6.3病毒核酸提取
按7.5.3方法提取核酸
7.6.4实时扩增反应
引物和探针
上游引物：5-TCACCAAACAATTAATAATAGC-3下游引物：5-GGTTCATCATCATTATATTGTG-3*探针：5'FAM-ACACAGAAGCAACAGCAATTAGGC-3'Eclip*e7.6.4.2
反应体系
反应体系参见F.1。
反应程序
第一步：94℃5min：
第二步：94℃5s，60℃15s.40个循环。7.6.5
结果判定
有效性判定
阳性对照荧光PCR扩增出现S形扩增曲线.Ct值小于等于30.阴性对照及空白对照无S形扩增曲线，且无Ct值.认为试验有效。
被检样品结果判定
在试验有效的前提下，有S形扩增曲线.且Ct值小于等于35（定性检测时可适当考虑临界值可变范围）.为PPV核酸阳性；无Ct值且无S形扩增曲线.为PPV核酸阴性。Ct值大于35小于40的样品认为可疑，结果可疑的需重复检测.重复检测结果仍可疑则可认为其为猪细小病毒核酸检测结果阳性。
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代替SN/T1874—2007、SN/T1919—2007猪细小病毒病检疫技术规范
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中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局bzxz.net
2017-02-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T1919—2016
本标准代替SN/T1874—2007《猪细小病毒病聚合酶链反应操作规程》和SN/T1919—2007《猪细小病毒病红细胞凝集抑制试验操作规程》。本标准与SN/T1874—2007和SN/T1919—2007相比，主要技术差异如下：增加了临床诊断和病毒分离方法；-增加了酶联免疫吸附试验；
增加了胶体金试验：
一增加了荧光聚合酶链式反应。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国广西出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：鱼海琼、蔡先全、程珏益、罗长保、赵吟、田纯见、盘宝进、邓艳、柏建山。本标准所代替标准历次版本发布情况为：-SN/T1874—2007;
-SN/T1919—2007。
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1范围
猪细小病毒病检疫技术规范
SN/T1919—2016
本标准规定了猪细小病毒病临床诊断、病毒分离、血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验、胶体金试验、聚合酶链式反应，荧光聚合酶链式反应的技术要求。本标准适用于猪细小病毒病的诊断、进出口检疫及流行病学调查等，2规范性引用文件
下列文件对于本文件的引用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T18088
3缩略语
出人境动物检疫采样
下列缩略语适用于本文件。
PPV：猪细小病毒（PorcineParvovirus）PBS磷酸盐缓冲溶液（PhosphateBufferSaline）HA：血凝试验（Hemagglutination）HI：血凝抑制试验（HemagglutinationInhibition）HAU：血凝单位（HemagglutinationUnit）OD值：光密度值（OpticalDensity）ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedImmunosorbentAssay）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）荧光-PCR：荧光聚合酶链式反应（Real-time-PCR）4试剂
猪细小病毒抗原、核酸、阳性血清、阴性血清。敏感细胞系：PK-15或ST细胞。
细胞生长液、维持液、胰酶、Hanks液。青霉素、链霉素。
磷酸盐缓冲溶液。
红细胞悬液。
RNA酶。
DNA抽提试剂盒。
蛋白酶K。
TaqDNA聚合酶。
100 bp DNA Marker.
HiiKAoNhiKAca
SN/T1919—2016
dNTP混合物及相应10X缓冲液，
设备与材料
5.1CO，培养箱。
5.2酶标仪。
396孔V型板。
5.4生物安全柜。
5显微镜。
5.6微量移液器。
高速冷冻离心机。
3PCR仪。
9水平凝胶电泳槽。
电泳仪。
凝胶成像系统。
荧光定量PCR仪。
临床诊断
疫病概况
猪细小病毒病是由PPV引起的一种猪紧殖障碍病，该病主要表现为胚胎和胎儿的感染和死亡，特别是初产母猪发生死胎、畸形胎和木乃伊胎，但母猪本身无明显的症状。其病原特征、流行病学情况参见A.1。
2病理变化
猪细小病毒病可以引起母猪子宫内膜、胎盘病理变化。感染的胎儿表现不同程度的发育障碍和生长不良，部检异常变化，参见A.2。3与其他易混淆疾病的鉴别
猪细小病毒病通常需要和猪繁殖与呼吸综合征、猪衣原体病、猪伪狂犬病感染猪群进行鉴别诊断，主要区别参见A.3。
6.4结果判定
根据该病的临床症状、病理变化和流行病学作出初步诊断，进一步确诊应根据GB/T18088采集样品进行实验室检测。
实验室检测
病毒分离
7.1.1细胞培养
用细胞瓶或细胞板培养PK-15细胞或ST细胞单层，可采用原代细胞培养或传代细胞培养，培养过程参见B.1.B.2，推荐使用传代细胞。2
HiiKAoNi KAca
7.1.2待检病料的接种
病料处理
SN/T1919—2016
无菌采取初产母猪的流产胎儿木乃伊胎的实质器官如心，肝，牌，肺，肾，去掉表面的筋膜，剪碎，加人Hanks液，用研钵研碎，制成1：5～1：10的悬液，加人1%青、链霉素溶液（10000U/mL），4℃过夜处理。冻融3次，2500r/min离心10min，除去细胞碎片，上清液用直径为0.22μm的一次性滤器过滤除菌，滤液置一20℃保存备用。7.1.2.2病料接种
胰酶消化PK-15或ST细胞后，同时按照1：10比例加人已处理好的病料，或者待次日倾倒瓶内的营养液，加人已处理好的病料，37℃吸附1h，其间每隔15min播摇一次。加人细胞维持液，37℃培养3d～6d，每天观察是否出现细胞病变，同时培养正常细胞作为对照。7.1.3结果判定
病料接种细胞后，若3d一6d内，细胞发生圆缩和溶解，出现弥慢性颗粒样变化，直至细胞破碎。细小病毒可在核内形成包涵体，稀疏地分布在核内，则可认为细胞出现病变，可初判为疑似病毒，推荐进一步应用其他病原检测方法进行证实。否则，需盲传三代，仍无病变可判为病毒分离阴性，但推荐进一步应用其他病原检测试验证实。7.2血凝抑制试验
7.2.1方法原理
猪细小病毒抗原能凝集豚鼠的红细胞，若被检血清中含有猪细小病毒抗体，则该抗体和抗原结合形成抗原抗体复合物，从而抑制抗原对豚鼠红细胞的凝集作用，红细胞凝集抑制的程度和抗体的量成正比。
7.2.2材料准备
无菌采集被检血清5mL，自然凝固后无菌分离血清，分装，冷藏保存。抗凝采集健康豚鼠血液，使用PBS(见C.1)制备红细胞悬液（见C.2)。7.2.3HA试验
抗原稀释
取96孔V型板，按2倍稀释度依次稀释抗原，即1：2、1：4.1：1024。每孔加稀释液25μL。
于A1孔加抗原25μL，吹打均匀后移取25μL至第A2孔，吹打均勾再移取25μL至A3孔，依次稀释，最后A10孔弃掉25μL。
每孔加稀释液25μL，振荡15s。2添加红细胞悬液
吸取7.2.2中制备好的0.5%红细胞悬液，加至稀释好的抗原孔，每孔加25μL，振荡30s，置室温1h判定结果并作记录（见表C.1)。3
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红细胞凝集程度的判定
红细胞均匀平铺于孔内.100%凝集，判为“+十十+”；红细胞均匀平铺于孔内，但边缘有下滑皱缩，75%凝集，判为“十十十”；红细胞聚集于孔底，四周有小凝集块，50%凝集，判为*十十”；红细胞聚集于孔底，边缘不整齐或有小凝集，25%凝集，判为”十”；红细胞聚集于孔底，边缘整齐光滑，稀释液清亮，无凝集，判为*一”7.2.3.4HA效价计算
能使孔内红细胞完全凝集的抗原最高稀释倍数为该抗原的HA效价.代表1个HAU。根据表C.1结果，该抗原的HA效价为1：128.即1个HAU为1：128。7.2.4HI试验
7.2.4.1血清稀释
取96孔V型板，按2倍稀释度依次稀释血清.即1：2、1：4..1：1024。每孔加稀释液25μL。
A1孔加被检血清25μL，吹打均勾后移取25μL至第A2孔.吹打均勾再移取25μL至A3孔，依次稀释.最后A10孔弃掉25μL
阳性血清同被检血清一样稀释(见表C.2)。7.2.4.2添加抗原
每孔加4HAU抗原25μL，振荡15s.置4℃作用6h或室温作用1h，3添加红细胞悬液
每孔加0.5%红细胞悬液25μL.振荡30s，置室温作用1h。7.2.4.4对照
设已知阳性血清、阴性血清、抗原对照、红细胞对照，加样见表C.3，设抗原回归，加样见表C.4。7.2.5结果判定
7.2.5.1对照
在抗原、红细胞、阴、阳性血清及抗原回归对照均成立的情况下才可进行结果判定。抗原对照孔和阴性血清对照孔应出现凝集现象，阳性血清对照应出现凝集抑制现象。7.2.5.2凝集抑制价
红细胞凝集程度的判定同7.2.3.3。能使红细胞凝集完全抑制的最高血清稀释倍数为其HI效价，表C.2中被检血清HI效价为1：32。7.2.5.3结果判定
不出现凝集抑制现象的，可判为血凝抗体阴性。出现凝集抑制现象的，记录每份样品的HI效价。根据检疫要求给定的阴，阳性临界滴度值判断被检血清的HI效价是否为血避凝抑制试验结果阳性或血凝抑制试验结果阴性。
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7.3酶联免疫吸附试验
7.3.1方法原理
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试剂盒微孔板上包被有PPV抗原，将被检血清加至微孔板上，作用一定时间，若样本中存在PPV抗体，则样本中针对病毒的特异性抗体与微孔板上的抗原结合。待加人过氧化物酶标记的特异性单克隆抗体并作用一段时间后，该单克隆抗体不能和已包被在板上的抗原结合，洗板，加人能使过氧化物酶显色的底物溶液，在酶标仪一定波长下，阳性样品孔将没有颜色反应，反之则有颜色反应，样品中抗体的量和酶标孔中颜色变化成反比。7.3.2检测步骤
7.3.2.1材料准备
所有试剂需提前从冰箱取出.恢复至室温。不同试剂盒依据各自说明书进行相应加样和结果判定步骤。
7.3.2.2加样
按试剂盒要求比例稀释被检血清及阴、阳性对照血清，每孔加人100μL，阴、阳性对照加双孔，被检血清建议加双孔，37℃作用30min，7.3.2.3加酶标记的单克隆抗体
计算好试验所需酶标物的体积，用相应的稀释液按比例要求稀释酶标记的单克隆抗体浓缩液，现配现用，每孔加50μL，轻拍板，使孔内液体混匀，37℃作用30min。7.3.2.4洗板
用蒸馏水按比例稀释PBS浓缩液至1×PBS洗液，甩去孔内液体，每孔加300μL洗液，轻拍板，甩去洗液，并在洁净的吸水纸上轻拍干，如此重复洗4次。7.3.2.5显色
计算好试验所需底物的体积.用相应的缓冲液配制新鲜的底物溶液.每孔加100μL，室温下避光显色10min。
7.3.2.6终止
每孔加入100μL终止液
读取OD值
在规定波长条件下读取每孔OD值。7.3.2.8结果计算
阴性对照OD值一样品OD值
阴性对照OD值一阳性对照OD值×100%计算样品的阻断率：
试验有效性
当阳性对照OD值/阴性对照OD值>4时，结果有效，可进行以下判定。5
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7.3.2.10结果判定
根据7.3.2.8计算结果，若阻断率>30%，判定为猪细小病毒ELISA抗体阳性，若阻断率<25%，判定为猪细小病毒ELISA抗体阴性。若阻断率在25%～30%之间，则认为可疑，需再次进行检测。7.4胶体金试验
7.4.1方法原理
检测抗原/抗体的检测卡检测线区（T线）位置封固了猪细小病毒单克隆抗体/抗原（参见D.1），对照线区（C线）位置及T线位置均封固了显色成分，当加人到加样孔的被检样品含有猪细小病毒抗原/抗体时，T线位置发生抗原抗体反应，位于显示窗口的T线和C线都会出现颜色反应。否则，仅C线位置出现颜色反应。
7.4.2操作步骤
在检测卡上加2滴（约100μL）待检样品至检测卡样孔内。将检测卡平放于桌面上，室温静置5min~20min
7.4.3结果判定
7.4.3.1有效性判定
检测窗口区，检测线区（T线）及对照线区（C线）均有紫红色线出现或检测线区（T线）无紫红色线出现但对照线区（C线）有紫红色线出现，视为试验有效，反之则试验无效，参见图D.1。7.4.3.2阴阳性判定
阳性样品的检测窗口区，检测线区（T线）及对照线区（C线）同时出现紫红色线。弱阳性样品的检测窗口区，检测线区（T线）及对照线区（C线）同时出现紫红色线，但检测线区（T）出现的颜色浅。
阴性检测窗口区，只有对照线区（C线）出现一条紫红色线，对照线区（C线）无紫红色线7.5聚合酶链式反应
7.5.1病毒株的复壮
经胰酶消化PK-15或ST细胞，同步接种PPV，待70%细胞病变后终止培养，冻融3次以上备用。7.5.2样品的前处理
7.5.2.1组织样品
取可疑猪只组织器官、死胎等1g，研磨，加人4mL的样品裂解液悬浮，冻融3次.5000r/min离心5min，取上清液备用。
或将组织磨碎后，加人4mL含10%小牛血清的Hanks液，冻融3次，5000r/min离心5min，取上清液，按1：10比例接种PK-15细胞，37℃培养3d～6d，待细胞70%以上病变后终止培养，不出现病变的需要盲传三代，培养物冻融3次备用。7.5.2.2公猪精液
采集2mL公猪精液，冻融3次备用。6
7.5.3病毒核酸提取
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取经7.5.2处理的被检样品、阳性对照、阴性对照各200μL于1.5mL离心管，加人样品裂解液500μL，混匀，加人20g/L蛋白酶K6μL，56℃水浴30min。加人10mg/mLRNA酶，37℃作用30min，待样品冷却至室温，加人等体积酚，混勾，14000r/min离心5min，取上清液，用等体积的酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1）混合液抽提1次，抽提后用等体积的异丙醇沉淀DNA，室温放置10min，14000r/min离心5min，70%乙醇洗涤1次，晾干，取30μLDEPC水溶解DNA，贮存于一20C或立即用于PCR扩增。或推荐选择方便快捷的商品化DNA抽提试剂盒提取病毒DNA。7.5.4扩增反应
7.5.4.1引物
上游引物：5-CAGAATCAGCAACCTCAC；下游引物：5-TGGTCTCCTTCTGTGGTAGG-3”。7.5.4.2PCR反应体系
PCR反应体系参见E.1。分别设立阳性对照、阴性对照及空白对照。7.5.4.3PCR反应程序
第一步：95℃预变性3min；
第二步：94℃30s58C30s72C1min，共35个循环72C延伸10min。7.5.4.4PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测配制1.5%含荧光染料琼脂糖凝胶，取6μL扩增产物，加1μL上样缓冲液混匀后点样，在另一加样孔同时加DNA分子量标准点样。电压大小根据电泳槽长度确定，一般控制在3V/cm～5V/cm，电泳后，用凝胶成像分析系统观察拍照，记录检测结果。7.5.5结果判定
7.5.5.1有效性判定
阳性对照扩增产物电泳后仅在445bP处出现特异性条带，DNA分子量标准条带清楚，阴性对照和空白对照应无该特异性条带，可认为试验有效，否则无效。7.5.5.2结果判定
在试验有效的前提下，被检样品PCR产物经电泳后仅在445bp处出现特异性扩增条带者，可判为PPV阳性。必要时可取PCR扩增产物进行测序验证，测序结果与已公开发表的PPV特异性片段序列（参见E2进行比对。
在试验有效的前提下，被检样品PCR产物经电泳后无特异性条带的判为阴性。7.6实时荧光聚合酶链式反应
7.6.1病毒复壮
按7.5.1方法复壮病毒。
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7.6.2样品处理
按7.5.2方法采集和处理样品。
7.6.3病毒核酸提取
按7.5.3方法提取核酸
7.6.4实时扩增反应
引物和探针
上游引物：5-TCACCAAACAATTAATAATAGC-3下游引物：5-GGTTCATCATCATTATATTGTG-3*探针：5'FAM-ACACAGAAGCAACAGCAATTAGGC-3'Eclip*e7.6.4.2
反应体系
反应体系参见F.1。
反应程序
第一步：94℃5min：
第二步：94℃5s，60℃15s.40个循环。7.6.5
结果判定
有效性判定
阳性对照荧光PCR扩增出现S形扩增曲线.Ct值小于等于30.阴性对照及空白对照无S形扩增曲线，且无Ct值.认为试验有效。
被检样品结果判定
在试验有效的前提下，有S形扩增曲线.且Ct值小于等于35（定性检测时可适当考虑临界值可变范围）.为PPV核酸阳性；无Ct值且无S形扩增曲线.为PPV核酸阴性。Ct值大于35小于40的样品认为可疑，结果可疑的需重复检测.重复检测结果仍可疑则可认为其为猪细小病毒核酸检测结果阳性。
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