SN/T 2974-2011
基本信息
标准号： SN/T 2974-2011
中文名称：牛巴贝斯虫病检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 2974-2011.Quarantine protocol for bovine babesiosis.
1范围
SN/T 2974规定了牛巴贝斯虫病病原鉴定、酶联免疫吸附试验和间接荧光抗体试验。
SN/T 2974适用于牛巴贝斯虫病的检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3疾病概述
牛巴贝斯虫病由牛巴贝斯虫( Babesia bovis)、双芽巴贝斯虫(B. bigemina).分歧巴贝斯虫(B.divergens)等寄生原虫引起。该病可以引起牛的高热、全身循环性休克，血红蛋白尿以及某些神经症状,严重可导致死亡。参见附录A.
牛巴贝斯虫病的诊断方法主要包括:病原鉴定和血清学检查。病原鉴定 中传统的方法是显微镜检查。该方法可检测出低至10个红细胞感染1个虫体。血清学实验包括间接免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验。其中,间接免疫荧光试验已广泛用于检测巴贝斯虫抗体，但一个突出的缺点是检测样品数量少,带有一定主观性。
4诊断技术
4.1镜检法
4.1.1仪器和设备
普通显微镜。
4.1.2试剂和材料
姬姆萨染色液，配制方法参见附录B。实验用水应符合GB/T 6682要求。
4.1.3采样部位
因牛巴贝斯虫通常分布在毛细血管血液里,活牛样品最好取自耳尖或尾尖的毛细血管;牛双芽巴贝斯虫和分歧巴贝斯虫均匀地分布于全身血液，如不能采集毛细血管血液做新鲜涂片,也可无菌采集颈静脉血加入抗凝剂EDTA(1 mg/mL),5℃保存,几小时内送达实验室。病死牛样品除薄血涂片外,还应有取自大脑皮层,肾、肝、肺和骨髓的组织涂片。
1范围
SN/T 2974规定了牛巴贝斯虫病病原鉴定、酶联免疫吸附试验和间接荧光抗体试验。
SN/T 2974适用于牛巴贝斯虫病的检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3疾病概述
牛巴贝斯虫病由牛巴贝斯虫( Babesia bovis)、双芽巴贝斯虫(B. bigemina).分歧巴贝斯虫(B.divergens)等寄生原虫引起。该病可以引起牛的高热、全身循环性休克，血红蛋白尿以及某些神经症状,严重可导致死亡。参见附录A.
牛巴贝斯虫病的诊断方法主要包括:病原鉴定和血清学检查。病原鉴定 中传统的方法是显微镜检查。该方法可检测出低至10个红细胞感染1个虫体。血清学实验包括间接免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验。其中,间接免疫荧光试验已广泛用于检测巴贝斯虫抗体，但一个突出的缺点是检测样品数量少,带有一定主观性。
4诊断技术
4.1镜检法
4.1.1仪器和设备
普通显微镜。
4.1.2试剂和材料
姬姆萨染色液，配制方法参见附录B。实验用水应符合GB/T 6682要求。
4.1.3采样部位
因牛巴贝斯虫通常分布在毛细血管血液里,活牛样品最好取自耳尖或尾尖的毛细血管;牛双芽巴贝斯虫和分歧巴贝斯虫均匀地分布于全身血液，如不能采集毛细血管血液做新鲜涂片,也可无菌采集颈静脉血加入抗凝剂EDTA(1 mg/mL),5℃保存,几小时内送达实验室。病死牛样品除薄血涂片外,还应有取自大脑皮层,肾、肝、肺和骨髓的组织涂片。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2974—2011
牛巴贝斯虫病检疫技术规范
Quarantine protocol for bovine babesiosis2011-09-09发布
中华人民共和国
数码防伪
国家质量监督检验检疫总局
2012-04-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T2974—2011
本标准与OIE《陆生动物疾病诊断试验和疫苗标准手册》（2008年版）中第2.4.2章“牛巴贝斯虫病”的一致性程度为非等效
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国四川出入境检验检疫局、四川农业大学
本标准主要起草人：姜红、王玉玲、赵祥平、余华、杨光友、严玉宝、胡娟。1范围
牛巴贝斯虫病检疫技术规范
本标准规定了牛巴贝斯虫病病原鉴定、酶联免疫吸附试验和间接荧光抗体试验。本标准适用于牛巴贝斯虫病的检疫2规范性引用文件
SN/T2974—2011
件，仅注日期的版本适用于本文下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文个件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的借改单）适用本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3疾病概述
牛巴贝斯虫病由牛巴贝斯虫（Babesia bouns)双芽巴贝斯虫（Bdivergens）等寄生原虫引起。该病可以引起牛的高热、全身循环性体状，严重可导致死亡，参见附录Abigemina）、分歧巴贝斯虫（B.，血红蛋白尿以及某些神经症
牛巴贝斯虫病的诊断方法主要包括：病原鉴定和血清学检香。病原鉴定中传统的方法是显微镜检查。该方法可检测出低至10个红细胞感架1个虫体
。血清学实验包括间接免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验。其中，间接免疫荧光试验已广泛用于检测巴贝斯虫抗体
少，带有一定主观性。
诊断技术
4.1镜检法
仪器和设备
普通显微镜。
试剂和材料
一个突出的缺点是检测样品数量姬姆萨染色液.配制方法参见附录B。实验用水应符合GB/T6682要求。4.1.3
采样部位
因牛巴贝斯虫通常分布在毛细血管血液里，活牛样品最好取自耳尖或尾尖的毛细血管：牛双芽巴贝斯虫和分歧巴贝斯虫均匀地分布于全身血液，如不能采集毛细血管血液做新鲜涂片，也可无菌采集颈静脉血加人抗凝剂EDTA(1mg/mL），5保存，几小时内送达实验室。病死牛样品除薄血涂片外，还应有取自大脑皮层、肾、肝、肺和骨髓的组织涂片。4.1.4
血涂片的制备
在洁净的载玻片三分之一处蘸一小滴血，以一端缘光滑的载玻片为推片，将推片的一端置于血滴之SN/T2974—2011
前，待血液沿推片端缘扩散后，自左向右推成薄血膜，待其自然风干后，无水甲醇固定1min，10%姬姆萨染色20min30min此为薄血涂片：取一小滴血液（约50μL）滴在干净的载玻片上，待血滴风干后，80加热固定5min.10%姬姆萨染色15min~20min，此为厚血涂片。虫种鉴别以薄血涂片为好。4.1.5组织涂片的制备
脏器涂片的制作可用一块干净的玻片轻触脏器的新鲜切面或以两块洁净的玻片轻夹一小块组织，沿玻片的纵向推压，使两玻片上都留下一层组织。涂片风干后，无水甲醇固定5min，再用10%姬姆萨染色20min30min。如果样品取自牛死亡后24h或更长时间，其结果不可靠。4.1.6显微镜观察
用油镜检查所有染色涂片（见图1、图2）。牛巴贝斯虫较小，通常位于红细胞中央，其平均长宽约为（1.0μm1.5μm）×（0.5μm~1.0μm），虫体常成对出现，且一端相连呈钝角。分歧巴贝斯虫也较小，其形态与牛巴贝斯虫非常相似，所不同的是呈钝角的成对虫体常位于红细胞边缘。双芽巴贝斯虫较长，成对虫体往往呈锐角相连，虫体呈典型梨形，但也有形状各异的单个虫体存在，长3.0μm3.5μm，宽1.0μm～1.5μm，成对排列的两个虫体各有两个不相连的红染点（牛巴贝斯虫和分歧巴贝斯虫往往只有一个红染点）。
牛红细胞内的双芽巴贝斯虫
图2牛红细胞内的牛巴贝斯虫
4.2血清学方法
间接免疫荧光实验
4.2.1.1仪器和设备
4.2.1.1.1烘箱。
水浴箱。
4.2.1.1.2
4.2.1.1.3
荧光显微镜。
4.2.1.2抗原片的制备
选用染虫率达2%~5%的牛，从颈静脉采血制备抗原涂片。SN/T2974—2011
采血时加入适当的抗凝剂（柠檬酸钠或EDTA）。用5倍～10倍体积PBS至少洗涤3次，除去血浆蛋白。洗涤后，将感染红细胞重悬于2倍体积PBS.并加人1%牛血清白蛋白（BSA），取一滴血液滴在干净的玻片上，以一端边缘光滑的载波片为推片，将推片的一端置于血滴之前，待血液沿推片端缘扩散后，自右向左推成薄血膜。血涂片风干后，80℃烘箱固定5min，密封已固定的血涂片，一70℃保存备用（最多可保存5年）。
正式试验
4.2.1.3.1待检血清和对照血清用PBS1：30稀释。血清使用前，可经56℃水浴30min灭活.也可不经灭活。用油笔将抗原涂片划成8个~10个疏水小区。用精密移液器在每小格内加人5μL～10L稀释血清，将玻片放人湿盒内置37℃30min。在每张玻片上设弱阳性血清，阴性血清对照。4.2.1.3.2孵育后，用PBS洗玻片1次，再用PBS和水依次各冲洗一次，每次10min。在每小格内加人用异硫氰酸荧光素标记的抗牛IgG抗体。每批新结合物都应标定，其工作浓度通常为1/400~1/1200.加二抗的玻片置于室温孵育30min。4.2.1.3.3孵育后.用PBS洗玻片1次，再用PBS和水依次各冲洗一次，每次10min。在湿片上滴加1：1甘油和PBS.盖玻片封片，置于标准的荧光显微镜下检查。4.2.1.4
结果判定
结果判定如下：
（一）无荧光：
（士）极弱的可疑荧光：
（十）荧光较弱，但清楚可见：（++）荧光明亮：
（+++++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“十”以上，而各种对照均成立，即可判定为阳性。4.2.2
间接酶联免疫吸附试验
仪器设备
4.2.2.1.1
4.2.2.1.2
4.2.2.1.3
酶标仪。
洗板机。
恒温培养箱。
试剂\
4.2.2.2.1
4.2.2.2.2
4.2.2.2.3
包被有重组抗原的96孔微量板。20倍的浓缩洗液。
辣根过氧化物酶（HRP)标记的二抗。4.2.2.2.4
底物和终止液。
4.2.2.2.5
阴性对照血清和阳性对照血清。由Svanova BiotechAB公司提供。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。3
SN/T2974—2011
待检血清：在无菌条件下采取血样，分离血清。实验前用1倍的洗液做1：100稀释。4.2.2.2.6
4.2.2.3试验程序
4.2.2.3.1
试验前，血清样品，试剂和反应板均恢复到室温。4.2.2.3.2
4.2.2.3.3
4.2.2.3.4
4.2.2.3.5
4.2.2.3.6
阴、阳性对照和待检血清用1倍的洗液做1：100稀释。稀释后的阴阳性对照100μL/孔，各加双孔。稀释后的待检血清100L/孔，按顺序依次加人。将酶标板封板后，37℃感作30min。弃掉各孔液体，每孔加人250uL～300μL已稀释好的洗液，轻轻振动后甩掉，连续洗涤3次。最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上4.2.2.3.7
4.2.2.3.8
4.2.2.3.9
4.2.2.3.10
每孔加酶标结合物1d
重复洗板步骤。
红封板后：37℃感作30mm。
每孔加TMB底物10
每孔加终止液100，混匀。
4.2.2.3.11
酶标仪以空气作为空白对照，在检血清的吸光值（OD）。
试验有效性检测
4.2.2.4.1
4.2.2.4.2
30min.从加完第一孔开始计时。15min内-在：430nm波长下测量和记录阴阳性对照和待阳性对照的数值被此差异不得大过25%阳性对照的吸光值应个手wwW.bzxz.Net
结果计算和判定
按式（1）计算阳性百分比值（P式中：
阳性百分比值：
待检血清孔的OD值
阴性对照孔的OD均值：
阳性对照孔的OD均值
间阴性对照的阳性百分比值应小于20。..（1)
当待检血清的PP值小于等于25，判足牛巴贝斯虫病为阴性：当待检血清的PP值大于等于40，判定牛巴贝斯虫病为阳性。当待检血清的PP值介于26至39之间，牛巴贝斯虫病为可疑，需重复试验，若仍为可疑，需最少间隔3周重新采血试验。A1病原
附录A
（资料性附录）
牛巴贝斯虫病概述
SN/T2974—2011
牛巴贝斯虫病是由顶器复合门、梨形虫目、巴贝斯虫属的原虫引起。寄生于牛的巴贝斯虫，迄今为止公认的有4个独立种：双芽巴贝斯巴贝斯虫是分布广泛和最为重要的A.2流行病学
牛巴贝斯虫病主要是经蜱传播的一种急性季节生疾
和大巴贝斯虫。牛巴贝斯虫和双芽君发生在放牧牛群中，黄牛、水牛和耗牛均易感染，成地方性流行。在我国，微小牛顿是双芽巴贝斯虫的主要传播媒介，病原在雌体内经卵传递给下一代，由第二代的若虫或成虫传播给易感牛，双巴贝斯虫病的发病季节出现春、夏、秋3次流行。。牛巴贝斯虫病的流行病学与双芽巴其中，夏秋两季是主要发病季节。雪节动态表现为两个发新高调第主要分布在欧洲的西部和北部，其8月初，第二个高潮位8月中旬至9月成更退A.3症状
斯虫病相似。分歧巴贝斯虫病
个高潮为4月底5月初至7月末
高消为主要发病期，占全年病例的90%。牛巴贝斯虫病多表现为急性
爱病过程，媒介
利亚急性
体，体温上升到40℃~42℃，呈留热黄染、血红蛋白尿和急性贫血。病程5A.4诊断
精神不摄，
d~14d潜伏期在血液中出现虫
欲减退，病情迅速恶化。出现可视粘膜白、疗50%以上死亡。
及时治
牛巴贝斯虫病的诊断方法主要分为病原鉴定和血清学检油
量微镜检查染色的厚、薄血液涂片是传统的病原鉴定方法。其次，目前很多实验室都在尝试使用TDNA探针或PCR的方法检测，使检测的敏感性和特异性得到了极大的提高。血清学诊断主要为间接荧光抗体试验和酶联免疫吸附试验。目前，市场上已有商品化的酶联免疫吸附试验的试剂盒SN/T2974—2011
附录B
（资料性附录）
姬姆萨染色液的配制
姬姆萨染色料粉0.5g，中型纯甘油25mL，无水中性甲醇25mL。先将姬氏染色粉置研钵中，加少量甘油充分研磨，边加边磨，直到甘油全部加完为止。将其倒人60mL~100mL棕色小口试剂瓶中，在研钵中加少量甲醇以冲洗甘油染液，冲洗液仍倾入上述瓶，再加甲醇冲洗，直到25mL甲醇全部用完为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，而后将瓶置于65℃温箱中24h或室温内3d~5d，并不时摇匀，过滤后即为原液。染色时将姬姆萨染色液原液10mL加到中性蒸馏水90mL中混匀，现用现制备。SN/T 2974-2011
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
牛巴贝斯虫病检疫技术规范
SN/T2974—2011
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
2012年3月第一版
印张0.75字数13千字
2012年3月第一次印刷
印数1-1600
书号：155066·2-23043定价16.00元
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牛巴贝斯虫病检疫技术规范
Quarantine protocol for bovine babesiosis2011-09-09发布
中华人民共和国
数码防伪
国家质量监督检验检疫总局
2012-04-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T2974—2011
本标准与OIE《陆生动物疾病诊断试验和疫苗标准手册》（2008年版）中第2.4.2章“牛巴贝斯虫病”的一致性程度为非等效
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国四川出入境检验检疫局、四川农业大学
本标准主要起草人：姜红、王玉玲、赵祥平、余华、杨光友、严玉宝、胡娟。1范围
牛巴贝斯虫病检疫技术规范
本标准规定了牛巴贝斯虫病病原鉴定、酶联免疫吸附试验和间接荧光抗体试验。本标准适用于牛巴贝斯虫病的检疫2规范性引用文件
SN/T2974—2011
件，仅注日期的版本适用于本文下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文个件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的借改单）适用本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3疾病概述
牛巴贝斯虫病由牛巴贝斯虫（Babesia bouns)双芽巴贝斯虫（Bdivergens）等寄生原虫引起。该病可以引起牛的高热、全身循环性体状，严重可导致死亡，参见附录Abigemina）、分歧巴贝斯虫（B.，血红蛋白尿以及某些神经症
牛巴贝斯虫病的诊断方法主要包括：病原鉴定和血清学检香。病原鉴定中传统的方法是显微镜检查。该方法可检测出低至10个红细胞感架1个虫体
。血清学实验包括间接免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验。其中，间接免疫荧光试验已广泛用于检测巴贝斯虫抗体
少，带有一定主观性。
诊断技术
4.1镜检法
仪器和设备
普通显微镜。
试剂和材料
一个突出的缺点是检测样品数量姬姆萨染色液.配制方法参见附录B。实验用水应符合GB/T6682要求。4.1.3
采样部位
因牛巴贝斯虫通常分布在毛细血管血液里，活牛样品最好取自耳尖或尾尖的毛细血管：牛双芽巴贝斯虫和分歧巴贝斯虫均匀地分布于全身血液，如不能采集毛细血管血液做新鲜涂片，也可无菌采集颈静脉血加人抗凝剂EDTA(1mg/mL），5保存，几小时内送达实验室。病死牛样品除薄血涂片外，还应有取自大脑皮层、肾、肝、肺和骨髓的组织涂片。4.1.4
血涂片的制备
在洁净的载玻片三分之一处蘸一小滴血，以一端缘光滑的载玻片为推片，将推片的一端置于血滴之SN/T2974—2011
前，待血液沿推片端缘扩散后，自左向右推成薄血膜，待其自然风干后，无水甲醇固定1min，10%姬姆萨染色20min30min此为薄血涂片：取一小滴血液（约50μL）滴在干净的载玻片上，待血滴风干后，80加热固定5min.10%姬姆萨染色15min~20min，此为厚血涂片。虫种鉴别以薄血涂片为好。4.1.5组织涂片的制备
脏器涂片的制作可用一块干净的玻片轻触脏器的新鲜切面或以两块洁净的玻片轻夹一小块组织，沿玻片的纵向推压，使两玻片上都留下一层组织。涂片风干后，无水甲醇固定5min，再用10%姬姆萨染色20min30min。如果样品取自牛死亡后24h或更长时间，其结果不可靠。4.1.6显微镜观察
用油镜检查所有染色涂片（见图1、图2）。牛巴贝斯虫较小，通常位于红细胞中央，其平均长宽约为（1.0μm1.5μm）×（0.5μm~1.0μm），虫体常成对出现，且一端相连呈钝角。分歧巴贝斯虫也较小，其形态与牛巴贝斯虫非常相似，所不同的是呈钝角的成对虫体常位于红细胞边缘。双芽巴贝斯虫较长，成对虫体往往呈锐角相连，虫体呈典型梨形，但也有形状各异的单个虫体存在，长3.0μm3.5μm，宽1.0μm～1.5μm，成对排列的两个虫体各有两个不相连的红染点（牛巴贝斯虫和分歧巴贝斯虫往往只有一个红染点）。
牛红细胞内的双芽巴贝斯虫
图2牛红细胞内的牛巴贝斯虫
4.2血清学方法
间接免疫荧光实验
4.2.1.1仪器和设备
4.2.1.1.1烘箱。
水浴箱。
4.2.1.1.2
4.2.1.1.3
荧光显微镜。
4.2.1.2抗原片的制备
选用染虫率达2%~5%的牛，从颈静脉采血制备抗原涂片。SN/T2974—2011
采血时加入适当的抗凝剂（柠檬酸钠或EDTA）。用5倍～10倍体积PBS至少洗涤3次，除去血浆蛋白。洗涤后，将感染红细胞重悬于2倍体积PBS.并加人1%牛血清白蛋白（BSA），取一滴血液滴在干净的玻片上，以一端边缘光滑的载波片为推片，将推片的一端置于血滴之前，待血液沿推片端缘扩散后，自右向左推成薄血膜。血涂片风干后，80℃烘箱固定5min，密封已固定的血涂片，一70℃保存备用（最多可保存5年）。
正式试验
4.2.1.3.1待检血清和对照血清用PBS1：30稀释。血清使用前，可经56℃水浴30min灭活.也可不经灭活。用油笔将抗原涂片划成8个~10个疏水小区。用精密移液器在每小格内加人5μL～10L稀释血清，将玻片放人湿盒内置37℃30min。在每张玻片上设弱阳性血清，阴性血清对照。4.2.1.3.2孵育后，用PBS洗玻片1次，再用PBS和水依次各冲洗一次，每次10min。在每小格内加人用异硫氰酸荧光素标记的抗牛IgG抗体。每批新结合物都应标定，其工作浓度通常为1/400~1/1200.加二抗的玻片置于室温孵育30min。4.2.1.3.3孵育后.用PBS洗玻片1次，再用PBS和水依次各冲洗一次，每次10min。在湿片上滴加1：1甘油和PBS.盖玻片封片，置于标准的荧光显微镜下检查。4.2.1.4
结果判定
结果判定如下：
（一）无荧光：
（士）极弱的可疑荧光：
（十）荧光较弱，但清楚可见：（++）荧光明亮：
（+++++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“十”以上，而各种对照均成立，即可判定为阳性。4.2.2
间接酶联免疫吸附试验
仪器设备
4.2.2.1.1
4.2.2.1.2
4.2.2.1.3
酶标仪。
洗板机。
恒温培养箱。
试剂\
4.2.2.2.1
4.2.2.2.2
4.2.2.2.3
包被有重组抗原的96孔微量板。20倍的浓缩洗液。
辣根过氧化物酶（HRP)标记的二抗。4.2.2.2.4
底物和终止液。
4.2.2.2.5
阴性对照血清和阳性对照血清。由Svanova BiotechAB公司提供。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。3
SN/T2974—2011
待检血清：在无菌条件下采取血样，分离血清。实验前用1倍的洗液做1：100稀释。4.2.2.2.6
4.2.2.3试验程序
4.2.2.3.1
试验前，血清样品，试剂和反应板均恢复到室温。4.2.2.3.2
4.2.2.3.3
4.2.2.3.4
4.2.2.3.5
4.2.2.3.6
阴、阳性对照和待检血清用1倍的洗液做1：100稀释。稀释后的阴阳性对照100μL/孔，各加双孔。稀释后的待检血清100L/孔，按顺序依次加人。将酶标板封板后，37℃感作30min。弃掉各孔液体，每孔加人250uL～300μL已稀释好的洗液，轻轻振动后甩掉，连续洗涤3次。最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上4.2.2.3.7
4.2.2.3.8
4.2.2.3.9
4.2.2.3.10
每孔加酶标结合物1d
重复洗板步骤。
红封板后：37℃感作30mm。
每孔加TMB底物10
每孔加终止液100，混匀。
4.2.2.3.11
酶标仪以空气作为空白对照，在检血清的吸光值（OD）。
试验有效性检测
4.2.2.4.1
4.2.2.4.2
30min.从加完第一孔开始计时。15min内-在：430nm波长下测量和记录阴阳性对照和待阳性对照的数值被此差异不得大过25%阳性对照的吸光值应个手wwW.bzxz.Net
结果计算和判定
按式（1）计算阳性百分比值（P式中：
阳性百分比值：
待检血清孔的OD值
阴性对照孔的OD均值：
阳性对照孔的OD均值
间阴性对照的阳性百分比值应小于20。..（1)
当待检血清的PP值小于等于25，判足牛巴贝斯虫病为阴性：当待检血清的PP值大于等于40，判定牛巴贝斯虫病为阳性。当待检血清的PP值介于26至39之间，牛巴贝斯虫病为可疑，需重复试验，若仍为可疑，需最少间隔3周重新采血试验。A1病原
附录A
（资料性附录）
牛巴贝斯虫病概述
SN/T2974—2011
牛巴贝斯虫病是由顶器复合门、梨形虫目、巴贝斯虫属的原虫引起。寄生于牛的巴贝斯虫，迄今为止公认的有4个独立种：双芽巴贝斯巴贝斯虫是分布广泛和最为重要的A.2流行病学
牛巴贝斯虫病主要是经蜱传播的一种急性季节生疾
和大巴贝斯虫。牛巴贝斯虫和双芽君发生在放牧牛群中，黄牛、水牛和耗牛均易感染，成地方性流行。在我国，微小牛顿是双芽巴贝斯虫的主要传播媒介，病原在雌体内经卵传递给下一代，由第二代的若虫或成虫传播给易感牛，双巴贝斯虫病的发病季节出现春、夏、秋3次流行。。牛巴贝斯虫病的流行病学与双芽巴其中，夏秋两季是主要发病季节。雪节动态表现为两个发新高调第主要分布在欧洲的西部和北部，其8月初，第二个高潮位8月中旬至9月成更退A.3症状
斯虫病相似。分歧巴贝斯虫病
个高潮为4月底5月初至7月末
高消为主要发病期，占全年病例的90%。牛巴贝斯虫病多表现为急性
爱病过程，媒介
利亚急性
体，体温上升到40℃~42℃，呈留热黄染、血红蛋白尿和急性贫血。病程5A.4诊断
精神不摄，
d~14d潜伏期在血液中出现虫
欲减退，病情迅速恶化。出现可视粘膜白、疗50%以上死亡。
及时治
牛巴贝斯虫病的诊断方法主要分为病原鉴定和血清学检油
量微镜检查染色的厚、薄血液涂片是传统的病原鉴定方法。其次，目前很多实验室都在尝试使用TDNA探针或PCR的方法检测，使检测的敏感性和特异性得到了极大的提高。血清学诊断主要为间接荧光抗体试验和酶联免疫吸附试验。目前，市场上已有商品化的酶联免疫吸附试验的试剂盒SN/T2974—2011
附录B
（资料性附录）
姬姆萨染色液的配制
姬姆萨染色料粉0.5g，中型纯甘油25mL，无水中性甲醇25mL。先将姬氏染色粉置研钵中，加少量甘油充分研磨，边加边磨，直到甘油全部加完为止。将其倒人60mL~100mL棕色小口试剂瓶中，在研钵中加少量甲醇以冲洗甘油染液，冲洗液仍倾入上述瓶，再加甲醇冲洗，直到25mL甲醇全部用完为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，而后将瓶置于65℃温箱中24h或室温内3d~5d，并不时摇匀，过滤后即为原液。染色时将姬姆萨染色液原液10mL加到中性蒸馏水90mL中混匀，现用现制备。SN/T 2974-2011
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
牛巴贝斯虫病检疫技术规范
SN/T2974—2011
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
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电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
2012年3月第一版
印张0.75字数13千字
2012年3月第一次印刷
印数1-1600
书号：155066·2-23043定价16.00元
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