SN/T 3560-2013.Detecting method for Yellow fever virus、Dengue virus、Chikungunya virus 、West Nile virus by multiplex real-time fluorescence RT-PCR at frontier ports.
1范围
SN/T 3560规定了国境口岸黄热病毒登革病毒基孔肯雅病毒西尼四病毒的多重实时荧光RT-PCR检测方法检验的对象、检测方法、程序及结果报告
SN/T 3560适用于国境口岸入出境人或蚊类携带黄热病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒的实验室快速筛查检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是E日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件.其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安 全通用要求
WS/T 230临 床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
实时荧光RT-PCR:实时荧光反转录聚合酶链反应
Ct值:每个反应管内的荧光信号达到设定的同值时所经历的循环数
FAM:FAM荧光染料,一种荧光报告基团
HEX:HEX荧光染料,一种荧光报告基团
Texas Red:Texas Red荧光染料。种荧光报告基团
CY5:CY5荧光染料,一种荧光报合基团
BHQ:黑洞淬灭基团
LNA:锁核苷酸
4术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
4.1黄热病毒Yellow fever virus
属于黄病毒科黄病毒属成员,为RNA病毒,是引起人类黄热病的病原体。传播媒介为蚊虫。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3560—2013
国境口岸黄热病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒的多重实时荧光RT-PCR检测方法
Detecting method for Yellow fever virus,Dengue virus,Chikungunya virus,WestNile virus by multiplex real-time fluorescence RT-PCRatfrontier ports2013-03-01发布wwW.bzxz.Net
赢查真
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-09-16实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3560—2013
本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。本标准主要起草人：田桢干、郑菱李强、孙立新、黄吉城、章琪、李平、曹敏、贾巍、何宇平、张显光、卢钟山。
国境口岸黄热病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒的多重实时荧光RT-PCR检测方法
本标准规定了国境口岸黄热病毒检测方法检验的对象、检测方法、程序及结果报告
SN/T3560—2013
病毒的多重实时荧光RT-PCR
本标准适用于国境口岸人出境人或蚊类携带黄热病毒、登革病毒，基孔肯雅病毒、西尼罗病毒的实验室快速筛查检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB19489实验室生物安全通用要求WS/T230
临床诊断中聚合酶链
3缩略语
下列缩略语适用手本文件
实时荧光RT-PCR：实时荧光反
Ct值：每个反应管内的荧光信
FAM.FAM荧光染料，一种荧
化报告
HEX：HEX荧光染料，一种荧光
无报告
Texas RedTexas Red荧光染糕
CY5.CY5荧光染料，一种荧光报
BHQ：黑洞淬灭基团
LNA：锁核苷酸
4术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。4.1
黄热病毒
Yellowfever virus
后酶链反应
受定的阅
值时所
种荧光报告基
经历的宿
音环数
属于黄病毒科黄病毒属成员，为RNA病毒，是引起人类黄热病的病原体。传播媒介为蚊虫4.2
登革病毒
Denguevirus
属黄病毒科黄病毒属，包括I、Ⅱ、Ⅲ、IV四种血清型，是有包膜的单股正链RNA病毒。登革病毒1
SN/T3560—2013
可感染人，并引起登革热，严重者甚至可引起登革出血热或登革休克综合症。埃及伊蚊和白纹伊蚊是登革病毒的主要传播媒介。
基孔肯雅病毒Chikungunyavirus披膜病毒科甲病毒属的第四组，核心含单股RNA。人体感染该病毒后，可以引起基孔肯雅热，该病起病快，传播范围广。我国南方广泛存在的白纹伊蚊是其主要的传播媒介。4.4
西尼罗病毒
West Nile virus
黄病毒科黄病毒属的重要成员，其基因组为单股正链RNA分子。西尼罗病毒可感染人，引起西尼罗热。库蚊是西尼罗热病毒的主要传播媒介。在欧洲和北美为尖音库蚊，在亚洲则为三带喙库蚊和致倦库蚊
仪器和设备
需要如下仪器、设备：
含FAM、HEX、TexasRed、CY5四种荧光检测通道的实时荧光PCR仪：生物安全柜：
普通冰箱：
70℃超低温冰箱：
普通台式离心机：
高速冷冻离心机（转速可达20-000g）；微量可调移液器（10μL、100μL、1000μL）及配套带滤芯吸头：离心管（1:5mL）s
涡旋器。
检测对象
6.1.人出境口岸疑似携带黄热病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒的媒介蚊虫。6.2人出境口岸疑似感染黄热病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒的人员。检测
7.1准备
实验室生物安全应符合GB19489的规定。PCR防污染措施按WS/T230的要求。7.2实验室检测
7.21标本的采集、运输和保存
7.21.1人血清标本
无菌采集发病后5d内静脉血3mL~5mL，室温静置30min使其凝固，然后500g离心10min，去除纤维蛋白和红血球，收集血清于2mL无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔记上编号，于4℃送样箱中尽快送到实验室检测，或一70C以下保存待检。7.2.1.2蚊子标本
SN/T3560—2013
根据实际工作需要采集蚊子标本。将采集的蚊子直接放人一20℃冰箱冻死后，取出，分类编号，按30只一份。装人2mL螺口塑料管内.用耐低温油性记号笔记上编号，于一70℃以下运输或保存待检。7.2.2标本的处理
7.2.2.1血清标本的处理
血清标本无需处理可直接提取核酸进行检测，如不能及时检测应存放在一70℃冰箱。7.2.2.2蚊标本的处理
在冰上操作。从一70C容器中取出蚊标本，倒人研磨器中，加人1mL标本处理液，反复研磨至组织碎片基本消失，随后将研磨液吸人1.5mLeppendorf离心管，配平后置预冷4℃的离心机上，20000g离心10min。取上清液进行核酸提取，剩余的蚊标本研磨液需保存在一70℃冰箱以备复查。7.2.3病毒核酸提取
可采用市售病毒RNA提取试剂盒以QIAampViralRNAKit，德国Qiagen公司产品为例，内含AVL、AWI、AW2、AVE等成分。
a）取血清标本或蚊标本研磨液140μL加人560pL裂解缓冲液（lysisbuffer）（AVL），在旋涡混合器上振荡15s混匀室温静置10min。b)
加人560L无水乙醇终止反应，在旋涡混合器上振荡15s混匀c）裂解后的液体分两次移人管柱，每次6000g离心1min，此时病毒RNA会吸附在管柱底部的膜上。
d）加500μL洗液（AW1)至管柱上，6000g离心1min，弃去AW1。加500μL洗液（AW2）至管柱上，20000g离心3min，弃去AW2。进一步20000g离心1min以e)
彻底去除残留在膜上的乙醇。
加人60μL洗脱液（AVE），室温静置1min。将管柱置于1.5mL离心管上，4℃6000g离心1min，得到的RNA即可进行实时荧光RT-PCRg）
检测。
7.2.4多重实时荧光RT-PCR检测
7.2.4.1用于多重实时荧光RT-PCR检测的引物及探针用于多重实时荧光RT-PCR检测黄热病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒的引物及探针序列及探针标记的荧光染料见表1。1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。3
SN/T35602013
表1多重实时荧光RT-PCR检测的引物及探针序列及标记的荧光染料引物/探针
引物/探针序列（5°-3\）
GCTAATTGAGGTGCATTGGTCTG
CTGCTAATCGCTCAACGAACG
FAM-TCTGCAAATCGAGTTGCTAGGCAATAAACAC-BHQIGCATATTGACGCTGGGARAGAC
GCGTTCTGTGCCTGGAWTGATG
HEXCA+GAGA+TCC+
TGAGCGTCGGTGCCCAC
FTGICTCEHQI
GAGTCTTATACCGTACTCCCACCGT
Texas Red-CGTACGAACACGTAACAGTGGAAGTTGGGTAGACGGTGCTGC
GGTTCTGAGGGCTTACGTG
CY5-CTGCGACCCAACCCO
注登革病毒探针DENP为LNA探
针均为常规TagMan探针，
7.2.4.2、
阳性对照和空白对照设置
检测过程中分别设阳性对照和
尼罗病毒核苷酸序列体外合成的工CCCGAAC
NGGAGGACT-BHQ2
，操序列中的字母前带“一“号的表示自对题
片段大小
目标病毒
黄热病毒
登革病毒
基孔肯雅
西尼罗
LNA修饰碱基。其他三种病毒探
阳性对照为根据黄热病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、西无菌水作为荧光
空白对照用
PCR反应的模板。
多重实时荧光RT-PCR
系组成
反应体
多重实时荧光RT-PCR采用
德国Qiagen公司产品为例），多RT-PCR
实时荧光RT
MultiplexPCRMasterMix12.5μL物探针湿
终浓度为o.2umol/L)：RNA模板5pL：去7.2.4.4反应条件
式剂盒（以Quan）
TectMultiplexRT-PCRKit.
PCR反
应体系
夜5μLC
来用以下参数：2×QuantiTect
干终浓度为0.2μmol/L、每种引物水2.5：总体积25
多重实时荧光RT-PCR反应条件：50℃逆转录20min：95变性15min94℃变性45s，60℃退火（延伸）75，45个循环，在退火（延伸）阶段检测荧光信号。7.2.4.5荧光域值的设定
PCR反应完成后应设定荧光阅值以分析样品的（Ct）值。以PCR反应的前3个～15个循环的荧光信号作为基线信号（噪音），荧光阅值理论上定义为基线信号的标准偏差的10倍。在实际应用中可以根2由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标谁的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。SN/T3560—2013
据仪器基线信号进行人工调整，设定原则是以阅值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且不出现（Ct）值为准。7.2.4.6质控标准
本文件质控标准为：
阴性对照：无扩增曲线：
阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct值应小于30.0。否则，试验视为无效。
7.3检验结果判断及报告
本方法检验结果判断及报告如下：某种病毒探针对应的检验样本Ct值小于或等于35.0时，报告该病毒核酸检测结果阳性：某种病毒探针对应的检验样本Ct值大于35.0且小于45.0时，重复检测一次，如果Ct值仍小于45.0，且曲线有明显的对数增长期，可报告该病毒核酸检测结果阳性，否则报告阴性；某种病毒探针对应的样本检测不到Ct值时，报告该病毒核酸检测结果阴性：筛选阳性的样本进行黄热病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒RT-PCR特异性检测和进一步鉴定。
废弃物的处理
检验过程中的废弃物，收集后进行高压蒸汽灭菌处理或其他等效的处理方法SN/T3560-2013
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
国境口岸黄热病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒的多重实时荧光RT-PCR检测方法
SN/T3560—2013
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010）64275323
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16
印张0.75字数12千字
2013年8月第一版
2013年8月第一次印刷
印数1-—1600
书号：155066·2-25792
定价16.00元
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